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隨著嵌合抗原受體工程化T 細(xì)胞（CAR-T）在治療血液腫瘤方面的巨大成功，開發(fā)CAR工程化自然殺傷細(xì)胞（CAR-NK）的興趣迅速增長(zhǎng)。本文著眼于CAR-NK細(xì)胞基因工程設(shè)計(jì)和臨床應(yīng)用的進(jìn)展，討論當(dāng)前挑戰(zhàn)和未來(lái)前景。

NK細(xì)胞占人類外周血白細(xì)胞的5%~15％，表達(dá)CD56，不表達(dá)CD3和T細(xì)胞受體（TCR）。人NK細(xì)胞可根據(jù)CD56和CD16（Fcγ受體Ⅲ或FcγRⅢ）的表達(dá)進(jìn)一步分為兩個(gè)亞組：CD56dim CD16high NK細(xì)胞和CD56bright CD16low/- NK細(xì)胞。CD56dim CD16high NK 細(xì)胞占外周血NK細(xì)胞的85%～95%，發(fā)育成熟，細(xì)胞毒性強(qiáng)，CD56bright CD16low/- NK細(xì)胞發(fā)育不成熟，細(xì)胞毒性低。

NK細(xì)胞發(fā)育不進(jìn)行體細(xì)胞基因重排，不表達(dá)抗原特異性受體，是一種非特異性腫瘤殺傷細(xì)胞。NK細(xì)胞受一系列激活和抑制受體信號(hào)調(diào)控，其殺傷力取決于抑制信號(hào)和激活信號(hào)之間的平衡。HLA低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞由于KIR介導(dǎo)的抑制作用下降而更易于被NK細(xì)胞殺傷。

NK細(xì)胞還通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）殺傷靶細(xì)胞。NK細(xì)胞膜上的CD16可識(shí)別與靶細(xì)胞表面結(jié)合IgG的Fc部分，通過(guò)ITAM信號(hào)途徑激活NK細(xì)胞，通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡（如釋放穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒物質(zhì)殺傷靶細(xì)胞，F(xiàn)as/FasL、TNF-α/TNFR-I介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡等）。活化的NK細(xì)胞還分泌各種細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)一步募集并活化其他免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。

1. CAR-NK細(xì)胞優(yōu)勢(shì)

過(guò)繼細(xì)胞療法旨在利用人體免疫系統(tǒng)消除癌癥。早期臨床研究顯示LAK或TIL細(xì)胞療效不夠強(qiáng)大。通過(guò)在免疫細(xì)胞（包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）表達(dá)抗原特異性TCR或嵌合抗原受體（CAR）可明顯提高免疫細(xì)胞抗癌效果。與CAR-T細(xì)胞相比，CAR-NK細(xì)胞有一些顯著優(yōu)勢(shì)，包括：(1)更好的安全性。未修飾的NK細(xì)胞及CAR-NK細(xì)胞安全性已在臨床研究中得到證明，如沒有細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性，異體來(lái)源的CAR-NK不會(huì)誘發(fā)移植物抗宿主?。℅VHD），這可能是由于活化的CAR-T細(xì)胞分泌IL-1α、IL-1Rα、IL-2、IL-2Rα、IL-6、TNF-α、MCP-1、IL-8、IL-10 和IL-15，與CRS 和神經(jīng)毒性高度相關(guān)，而活化的NK 細(xì)胞通常分泌的是IFN-γ和GM-CSF 。(2)有多種激活機(jī)制。除了以CAR依賴性方式殺死腫瘤靶細(xì)胞外，CAR-NK細(xì)胞具有天然的細(xì)胞毒活性，可通過(guò)非CAR依賴的機(jī)制激活，例如NCR、NKG2D、共刺激受體DNAM-1（CD226）和KIR（KIR2DS1、KIR2DS4和KIR2DL4）。此外，NK細(xì)胞可通過(guò)CD16介導(dǎo)的ADCC殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，NK細(xì)胞具有廣譜高效的殺瘤活性。(3)可生產(chǎn)“現(xiàn)貨”（off-the-shelf product）產(chǎn)品。(4)可對(duì)CAR-NK細(xì)胞進(jìn)行改造，使其靶向多種抗原，增加對(duì)實(shí)體瘤的浸潤(rùn)，克服耐藥的腫瘤微環(huán)境，最終實(shí)現(xiàn)有效抗腫瘤反應(yīng)。

2. CAR-NK 細(xì)胞來(lái)源

同種異體NK 細(xì)胞的低GVHD風(fēng)險(xiǎn)使CAR-NK細(xì)胞的來(lái)源多樣化，包括NK92細(xì)胞系、外周血單核細(xì)胞（PBMC）、CD34⁺ 造血祖細(xì)胞（HPC）、臍帶血（UCB）細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）。

當(dāng)前CAR-NK細(xì)胞臨床試驗(yàn)多使用NK92細(xì)胞系，因它具有無(wú)限體外增殖能力。但作為腫瘤細(xì)胞系的NK92細(xì)胞具有固有缺陷，包括潛在的致瘤風(fēng)險(xiǎn)，缺乏CD16和NKp44表達(dá)，輸注前需要進(jìn)行輻射處理，因此不是最理想細(xì)胞來(lái)源。

PBMC是原代NK細(xì)胞重要來(lái)源，細(xì)胞可來(lái)自HLA匹配或不匹配供體。PBMC衍生的CAR-NK細(xì)胞90％以上是CD56^dimCD16⁺NK細(xì)胞，屬于成熟細(xì)胞，表達(dá)大部分激活受體，因此細(xì)胞毒性強(qiáng)，但增殖能力較弱。

UCB來(lái)源的NK細(xì)胞由于單份UCB體積有限，分離得到NK 細(xì)胞數(shù)量少，可能無(wú)法滿足臨床需要。此外UCBNK細(xì)胞不成熟，某些黏附分子、CD16、KIR、穿孔素和顆粒酶B表達(dá)較低，而抑制性分子如NKG2A的表達(dá)較高，導(dǎo)致活性不如PBMC 來(lái)源的CAR-NK細(xì)胞。

采用CD34⁺HPC分化是獲得大量成熟NK細(xì)胞的另一種方法?？蓮墓撬琛⑴咛ジ杉?xì)胞、動(dòng)員的PBMC或UCB中分離CD34⁺ HPC，然后擴(kuò)增并分化為成熟的NK細(xì)胞。

由于具有無(wú)限增殖能力，iPSC已成為重要CARNK細(xì)胞來(lái)源。與分化的NK細(xì)胞相比，iPSC可更穩(wěn)定表達(dá)CAR。CAR-iPSC可在含有SCF、VEGF 和BMP4的培養(yǎng)基中分化為HPC，然后用含有IL3、IL-15、IL-7、SCF 和FLT3L的培養(yǎng)液分化為CARNK細(xì)胞。但是與UCB-NK細(xì)胞相似，iPSC生的NK細(xì)胞通常具有不成熟表型，KIR和CD16表達(dá)較低而NKG2A表達(dá)較高。

綜上，CAR-NK細(xì)胞易于取材、生產(chǎn)，具備通用性，可根據(jù)治療需求提供現(xiàn)貨產(chǎn)品。

3. CAR 結(jié)構(gòu)

大多數(shù)CAR-NK細(xì)胞研究都使用CAR-T細(xì)胞設(shè)計(jì)的CAR，少部分是針對(duì)NK細(xì)胞專門設(shè)計(jì)的CAR。含有4-1BB共刺激域（scFv-CD8TM-4-1BB-CD3ζ）的第二代抗CD19CAR 可在原代NK細(xì)胞中表達(dá)。生產(chǎn)的NK細(xì)胞可特異性殺傷CD19⁺急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞。針對(duì)HER2、EGFR或EGFR變體Ⅲ和CS1的CAR-NK也已開發(fā)出。此外，具有不同信號(hào)傳導(dǎo)域（包括CD3ζ、DAP10和DAP12）的原代CAR-NK細(xì)胞或CARNK92細(xì)胞也有報(bào)道。

4. CAR 基因轉(zhuǎn)染方法

開發(fā)CAR-NK細(xì)胞的主要障礙之一是原代NK細(xì)胞缺乏有效基因轉(zhuǎn)染方法。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞效率為27％~52％。編碼分泌型IL-15或膜結(jié)合型IL-15（mIL-15）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可達(dá)70％，然而這種方法有兩個(gè)弊端：一是病毒可插入到基因組，導(dǎo)致細(xì)胞癌變；二是逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染會(huì)抑制原代NK細(xì)胞活力。

慢病毒具有較低遺傳毒性和插入誘變作用，但慢病毒在原代NK細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率很低，通常需要多輪轉(zhuǎn)導(dǎo)。修飾的狒狒包膜糖蛋白（BaEVgp）假型化的慢病毒載體可提高轉(zhuǎn)染效率。同樣，用長(zhǎng)臂猿猿猴白血病病毒的包膜蛋白假型化的慢病毒也能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)原代NK細(xì)胞。

電穿孔和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染也可將外源基因有效傳入NK細(xì)胞，而且轉(zhuǎn)入的基因表達(dá)快，細(xì)胞凋亡水平較低，個(gè)體間變異性較小。但電穿孔和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的外源DNA不會(huì)整合到靶細(xì)胞的基因組中，因此轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是瞬時(shí)。

DNA轉(zhuǎn)座子是可移動(dòng)的DNA元件，可通過(guò)“ 剪切和粘貼”機(jī)制在載體和染色體之間有效轉(zhuǎn)座，產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)CAR分子的CAR-iPSC-NK細(xì)胞。PiggyBac（PB）和“ 睡美人”（SB）是兩個(gè)最常用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，由兩個(gè)部分組成：介導(dǎo)“剪切和粘貼”功能的轉(zhuǎn)座酶和側(cè)接兩個(gè)末端反向重復(fù)序列（TIR）的DNA載體。與病毒載體相比，這些轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)具有多個(gè)優(yōu)勢(shì)，如免疫原性低、生物安全性高、生產(chǎn)成本低及具有轉(zhuǎn)導(dǎo)長(zhǎng)度大于100 kb大基因片段的能力。然而轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在轉(zhuǎn)導(dǎo)原代NK細(xì)胞中的適用性仍需要進(jìn)一步完善，以克服低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和質(zhì)粒DNA電穿孔導(dǎo)致NK細(xì)胞死亡等缺點(diǎn)。

因此，開發(fā)有效基因轉(zhuǎn)染方法是未來(lái)CAR-NK細(xì)胞的研究重點(diǎn)。

5. 體外擴(kuò)增CAR-NK 細(xì)胞

NK細(xì)胞僅占PBMC一小部分，因此擴(kuò)增足夠數(shù)量NK細(xì)胞仍然是主要挑戰(zhàn)。IL-2、IL-15、IL-12、IL-21和IL-18是常用的體外原代NK細(xì)胞擴(kuò)增因子，但擴(kuò)增效率不夠高。采用與刺激性細(xì)胞共培養(yǎng)的方法比細(xì)胞因子的擴(kuò)增效率高。常用的刺激細(xì)胞包括Wilms腫瘤細(xì)胞系、自體PBMC、EB 病毒轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞、K562細(xì)胞、表達(dá)mIL-15 或4-1BB配體（4-1BBL）的K562 細(xì)胞、共表達(dá)mIL-15 和4-1BBL的K562細(xì)胞等。但這些飼養(yǎng)細(xì)胞激活的原代NK細(xì)胞連續(xù)增殖8~15周后會(huì)發(fā)生衰老。腫瘤細(xì)胞在與NK細(xì)胞共培養(yǎng)之前則必須經(jīng)過(guò)照射，以確保最終產(chǎn)品中沒有存活的飼養(yǎng)細(xì)胞。表達(dá)mIL-15的NK細(xì)胞在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出優(yōu)異增殖和存活率，并對(duì)腫瘤細(xì)胞具有更高細(xì)胞毒性?？傮w上目前還缺乏高效、安全的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增方法。

6. CAR-NK 細(xì)胞臨床應(yīng)用

CAR-NK細(xì)胞臨床研究還處于早期階段。2016年之前只開展了2項(xiàng)試驗(yàn)（NCT01974479、NCT00995137），至今仍在進(jìn)行中。2016年之后進(jìn)入臨床研究的CAR-NK細(xì)胞項(xiàng)目明顯增加，目前有19項(xiàng)研究已在Clinicaltrials.gov 中注冊(cè)，其中11項(xiàng)靶向造血系統(tǒng)惡性腫瘤，針對(duì)抗原包括CD19、CD22、BCMA、CD33和CD7。針對(duì)轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的試驗(yàn)中，靶向抗原包括HER2、PSMA、間皮素、ROBO1、MUC1和NKG2DL。4項(xiàng)原代NK細(xì)胞的研究中有3項(xiàng)使用mRNA 電穿孔介導(dǎo)瞬時(shí)CAR表達(dá)。這些試驗(yàn)中僅3項(xiàng)發(fā)表了研究結(jié)果。其中編號(hào)為NCT03056339的臨床研究納入11名高危CD19⁺B細(xì)胞惡性腫瘤患者，在接受UCB衍生的CAR-NK細(xì)胞移植后11位患者中有7 位完全緩解，而且未出現(xiàn)嚴(yán)重副作用。

Fate Therapeutics 公司開展的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT04245722）采用iPSC制備CAR-NK細(xì)胞（代號(hào)FT596），用于治療CD19⁺B 細(xì)胞惡性腫瘤。FT596表達(dá)3種蛋白：CD19-CAR、高親和力CD16及IL-15受體融合蛋白。自分泌IL-15可支持CAR-NK細(xì)胞在體內(nèi)長(zhǎng)久存活。當(dāng)FT596與治療性抗體一起使用時(shí)可有效克服由于CD19抗原丟失而引起的腫瘤細(xì)胞抵抗。

7. CAR-NK 細(xì)胞未來(lái)研究方向

與CAR-T細(xì)胞不同，CAR-NK細(xì)胞可通過(guò)非CAR依賴性方式殺傷癌細(xì)胞。因此?？裳邪l(fā)不表達(dá)活化信號(hào)的CAR，該CAR雖然不會(huì)誘導(dǎo)直接靶細(xì)胞殺傷，但會(huì)促進(jìn)NK細(xì)胞黏附靶細(xì)胞，觸發(fā)NK 細(xì)胞自然殺傷機(jī)制，而不會(huì)殺傷表達(dá)相同抗原的正常細(xì)胞。

使用先進(jìn)基因工程技術(shù)使NK細(xì)胞同時(shí)表達(dá)其他細(xì)胞因子、抗體和蛋白酶等，從而促進(jìn)其增殖、遷移和浸潤(rùn)，或改善腫瘤微環(huán)境。

與T細(xì)胞一樣，活化NK細(xì)胞也表達(dá)一些T 細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)分子（如PD-1、CTLA-4、LAG3 和TIM3），它們可能會(huì)抑制NK抗腫瘤活性。因此，通過(guò)基因編輯敲除檢查點(diǎn)分子也是提高CAR-NK活性的途徑。

NK細(xì)胞表達(dá)CD16并發(fā)揮ADCC介導(dǎo)的腫瘤殺傷作用。但細(xì)胞因子的激活或靶細(xì)胞刺激通常會(huì)導(dǎo)致NK細(xì)胞CD16表達(dá)明顯下降。對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使其穩(wěn)定表達(dá)CD16可提高CAR-NK活性。

總之，CAR-NK細(xì)胞作為一種新型的癌癥細(xì)胞免疫療法將提高癌癥患者的生存率，具有廣闊的前景。

（ID ：yxckbsc2021020501）

作者介紹

廖聯(lián)明副研究員

福建醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室副研究員，碩士生導(dǎo)師。主要從事臨床科研設(shè)計(jì)的教學(xué)和間充質(zhì)干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)研究。為中華醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)工程學(xué)分會(huì)干細(xì)胞工程專業(yè)委員會(huì)委員、《中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志》和 J Cellular Immunother 雜志常務(wù)編委、《中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志》編委、《醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào)》國(guó)際新藥研究信息特約撰稿人。主持或參與國(guó)家級(jí)、省部級(jí)課題研究8項(xiàng)，發(fā)表SCI論文100多篇，其中干細(xì)胞相關(guān)的臨床研究論文發(fā)表在 Bone Marrow Transpl、Leukemia、Diabetes、JAMA、J Clin Oncol、Cytotherapy 等。

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