活性氧自由基在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)作用＊
李建喜，楊志強(qiáng)，王學(xué)智
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050)
摘 要：自由基是近年來在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，研究較多的以氧(O)、碳(C)和氮(N)為中心的活性基團(tuán)。其中活性氧是機(jī)體內(nèi)最常見自由基，也是近年來對(duì)其體內(nèi)外生物學(xué)作用闡述最多的自由基種類之一。正常情況下，該類自由基在抗菌、消炎和抑制腫瘤等方面具有重要意義。但是，在疾病或某些外源性藥物和毒物入侵后，機(jī)體抗氧化體系可能會(huì)發(fā)生紊亂，自由基代謝平衡因此失調(diào)，從而導(dǎo)致生物膜和大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷。文章對(duì)活性氧自由基在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的產(chǎn)生、性質(zhì)和生物學(xué)作用，以及天然清除劑在機(jī)體內(nèi)對(duì)自由基的抗氧化作用、自由基與疾病間的關(guān)系做了較全面綜述。
關(guān)鍵詞：活性氧自由基；生物學(xué)作用；動(dòng)物
自Comberg (1900)提出有機(jī)自由基(organic free radical)以來，有關(guān)自由基在生命體系中生物學(xué)作用的研究相繼開展了很多[1]。1956年，Harman等發(fā)現(xiàn)放射線誘導(dǎo)突變和誘發(fā)腫瘤的發(fā)病機(jī)理與自由基有關(guān)，該研究是自由基醫(yī)學(xué)(free radical medicine)史上的里程碑。1968年，McCord和Fridovich報(bào)道了超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)抗氧化的生物學(xué)作用，從而開創(chuàng)了自由基生物學(xué)的新篇章。自由基是機(jī)體內(nèi)的一種不可缺少的活性元素，對(duì)生物體既有益又有害。正常情況下，生物體內(nèi)有一套完整的抗氧化體系，可以維持自由基的代謝平衡。但是，當(dāng)機(jī)體在某些疾病或外源性物質(zhì)入侵后，自由基代謝可能會(huì)發(fā)生異常，從而誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并可能導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生氧應(yīng)激性損傷[2-4]。
1 機(jī)體內(nèi)的活性氧自由基及其性質(zhì)
1.1 自由基的產(chǎn)生和種類
自由基(free radicals， FRs)是指帶不成對(duì)電子的原子、分子、離子或原子團(tuán)。自由基的種類很多，研究較多的以氧(O)、碳(C)、氮(N)為中心的活性基團(tuán)，其中對(duì)活性氧(reactive oxygen species， ROS)及其產(chǎn)物的研究最為活躍，其占機(jī)體內(nèi)總自由基研究報(bào)道的95%以上。自由基的形成有3種方式[2]：①共價(jià)鍵的均裂；②單電子丟失；③單電子獲得。機(jī)體內(nèi)電子傳遞是自由基形成最普遍最易發(fā)生的途徑；如高溫、紫外線照射或電子輻射作用，也能導(dǎo)致分子裂解后形成自由基。生物體內(nèi)自由基形成的機(jī)理非常復(fù)雜。氧化呼吸鏈?zhǔn)菣C(jī)體賴以存在的基礎(chǔ)，其中有多次分級(jí)電子傳遞，O2是電子受體，所以會(huì)形成多種活性氧自由基，如 O ，·OH，HO ，H2O2和1O2等。在活性氧的作用下，組織細(xì)胞會(huì)因脂質(zhì)過氧化(LPO)而產(chǎn)生許多脂自由基，如L·，LO·，LOO·，LOOH[5]。外源性化合物進(jìn)入機(jī)體后，也可能導(dǎo)致大量自由基生成，如腎上腺素、CCl4和乙醇等會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生·CCl3和·OH等自由基。機(jī)體內(nèi)生物活性物質(zhì)代謝異常后，也會(huì)導(dǎo)致自由基水平升高，如細(xì)胞內(nèi)硫醇和對(duì)苯二酚等小分子物質(zhì)發(fā)生自氧化反應(yīng)，或蛋白酶(如黃嘌呤氧化酶)等的催化反應(yīng)中，都會(huì)生成自由基[6]。另外，在炎癥等病變過程中，白細(xì)胞發(fā)生呼吸爆發(fā)(respiratory burst)后，機(jī)體內(nèi)O 和·OH水平會(huì)明顯升高。動(dòng)物體內(nèi)硒等微量元素缺乏時(shí)，自由基水平也會(huì)升高。
1.2 自由基的典型理化性質(zhì)
自由基典型物理性質(zhì)是順磁性(paramagnetism)，因此可以用電子自旋共振技術(shù)(electron spin resonance， ESR)對(duì)組織內(nèi)的自由基進(jìn)行直接檢測(cè)。
由于自由基外層具有奇數(shù)價(jià)電子，因此其化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，它既是電子供體，又是電子受體[2，5]。
2 活性氧自由基對(duì)組織的損傷
2.1 生物膜損傷
生物膜是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖類組成，脂質(zhì)以磷脂為主，磷脂的主要成分是多聚不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids， PUFAs)，其中有多個(gè)弱鍵和不飽和鍵，自由基對(duì)其有很高的親合力，因此生物膜易受自由基攻擊[7]?；钚匝踝饔糜谏锬ず?，PUFA中LH會(huì)在R·的作用下，會(huì)啟動(dòng)LPO鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。但當(dāng)LPO反應(yīng)鏈遇到SOD、谷胱甘肽(Glutathione， GSH)、維生素E和維生素C等抗氧化物，或產(chǎn)生損傷效應(yīng)后就會(huì)終止[8]。紅細(xì)胞膜發(fā)生LPO損傷后，通透性會(huì)增加，細(xì)胞變脆，易發(fā)生溶血。分析認(rèn)為，這主要與紅細(xì)胞膜含有豐富的PUFAs，并與O2接觸機(jī)率高，以及循環(huán)中自由基的濃度相對(duì)較高等有關(guān)。在脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物中，醛類(aldehydes)所占比例較大，其中丙二醛(MDA)被認(rèn)為是LPO反應(yīng)的代表性中間產(chǎn)物，有人認(rèn)為它不會(huì)對(duì)組織造成損傷；也有人認(rèn)為它與膜蛋白結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致膜通透性增加，膜蛋白酶失活，或膜上的受體和供體被破壞，細(xì)胞代謝因此會(huì)發(fā)生紊亂[9]。線粒體膜在Fe2＋和Cu＋等作用下，其附近的H2O2分解成·OH，會(huì)導(dǎo)致膜腫脹甚至消失[10]。當(dāng)微粒體、溶酶體發(fā)生LPO損傷后，多聚核糖體會(huì)解聚，蛋白質(zhì)合成可能被抑制。又如過氧化體膜組成發(fā)生LPO損傷后，大量的H2O2被釋放入血，也會(huì)加劇細(xì)胞的氧化損傷[9，11]。
2.2 蛋白質(zhì)的損傷
蛋白質(zhì)在細(xì)胞中分布廣，比例大，也是活性氧靶分子。如His，Pro，Trp，Cys和Tyr等是自由基的敏感型受體，自由基會(huì)使這些氨基酸殘基發(fā)生突變，蛋白多肽鏈也會(huì)隨之?dāng)嗔?、聚合或交?lián)，蛋白質(zhì)的構(gòu)象和活性位點(diǎn)改變，導(dǎo)致其功能的改變[11]。又如GSH-Px等富含巰基(－SH)的酶，活性氧使－SH轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>-S-S-而失去活性。O 可激活線粒體順烏頭酸酶，并形成多量的·OH[12]。蛋氨酸(Met)氧化損傷后，一些抗蛋白酶如α-抗胰蛋白酶會(huì)失活?；钚匝踝杂苫?/span>O ，·OH，H2O2和3ΣgO3共同作用于蛋白質(zhì)的結(jié)果可能有以下5種：①疏水性的改變，從而影響膜受體和配體等；②酶活性降低或增強(qiáng)；③免疫原性改變，誘發(fā)自身免疫性疾??；④熱應(yīng)激蛋白如HSP70的大量表達(dá)，導(dǎo)致特異性轉(zhuǎn)錄因子釋放；⑤蛋白水解作用增強(qiáng)，這也是細(xì)胞蛋白質(zhì)氧化降解的標(biāo)志[9，11]。
2.3 核酸的損傷
多聚核苷酸也是活性氧和其他自由基攻擊的靶分子。DNA雙螺旋外側(cè)的嘌呤和嘧啶對(duì)自由基最為敏感，被損傷后會(huì)導(dǎo)致堿基被修飾，氫鍵斷裂，雙鏈或單鏈也發(fā)生斷裂。雖然DNA有強(qiáng)大的修復(fù)功能，但修復(fù)后的突變率會(huì)升高，有時(shí)也出現(xiàn)永久性破壞[13]。氧應(yīng)激時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋增多，核苷酸因此會(huì)發(fā)生羥化反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Fe2＋和 Cu＋或其它過度金屬離子可提高H2O2轉(zhuǎn)化為·OH的速率，從而間接地對(duì)DNA帶來損傷。當(dāng)DNA發(fā)生LPO損傷后，會(huì)因基因突變可能導(dǎo)致癌癥或遺傳病[2-3]。另外，DNA損傷后，會(huì)導(dǎo)致ADP核酸轉(zhuǎn)移酶所依賴的NAD＋/NADH的丟失，從而阻斷其修復(fù)通路。線粒體由于和活性氧接觸比較頻繁，而且缺乏修復(fù)功能，所以它的DNA損傷率極高，但修復(fù)率較低。肝微粒體發(fā)生氧損傷后，UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下降，從而影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能[9]。
3 機(jī)體對(duì)自由基的利用
活性氧是細(xì)胞生命活動(dòng)不可缺少的活性物質(zhì)。研究表明，低劑量輻射增強(qiáng)機(jī)體免疫力的機(jī)理可能與自由基生成有關(guān)；紅斑狼瘡患者，在一定范圍內(nèi)機(jī)體的免疫機(jī)能會(huì)因自由基水平的上升而增強(qiáng)。自由基在體內(nèi)的適量增多可提高部分酶的活力，如核酸還原酶發(fā)揮作用時(shí)需自由基參與。自由基還參與機(jī)體內(nèi)一些活性物質(zhì)(如前列腺素、凝血酶原和膠原蛋白)的合成；核苷酸的合成和肝臟的解毒過程中，自由基可激活某些合成酶或解毒酶[4-5]。炎癥過程中，自由基可促進(jìn)炎性細(xì)胞吞噬細(xì)菌或殺死細(xì)菌，如中性粒細(xì)胞發(fā)生呼吸爆發(fā)時(shí)，細(xì)菌會(huì)因自由基水平升高而逐漸消失。炎癥過程中髓過氧化物(Myeloperoxidase， MPO)和一些鹵素作用能起到殺滅細(xì)菌的作用。NO作為一種信號(hào)分子，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的多種功能有調(diào)節(jié)作用[1]。自由基能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)單加氧酶的活性，進(jìn)而使許多化學(xué)物質(zhì)發(fā)生羥化反應(yīng)而易于排泄。
4 活性氧自由基清除劑
4.1 酶類抗氧化劑
酶既是自由基攻擊的靶分子，又是自由基的天然清除劑。當(dāng)自由基水平升高時(shí)，SOD，過氧化氫酶(Catalase， CAT)，GSH-Px，MPO和乳酸脫氫酶，還有硫轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶的活性都會(huì)或多或少發(fā)生變化[2，5-6]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有兩類SOD，一類為Cu，Zn-SOD，另一類為Mn-SOD，前者主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，后者主要分布于線粒體內(nèi)。SOD在輻射、炎癥、缺血再灌和實(shí)驗(yàn)性皮膚癌等病變過程中，均有明顯抗脂質(zhì)過氧化作用。CAT不但能阻止H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>·OH，還能使之分解為H2O和O2，這是CAT抗炎和抗UV照射損傷的機(jī)理。SOD和CAT在脂質(zhì)過氧化方面有協(xié)同作用。GSH-Px也能催化H2O2的分解，降低機(jī)體內(nèi)·OH的水平。GSH-PX有直接保護(hù)組織免受LPO損傷的作用，其機(jī)理是可使LOOH分解，從而保護(hù)生物膜。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶能維持NADPH在體內(nèi)清除活性氧的能力。乳酸脫氫酶和肌酸激酶也有抗氧化作用，但機(jī)理尚不清楚[12]。
4.2 維生素類抗氧化劑
(1)維生素E。維生素E是6-OH-苯并二氫呋喃衍生物，C6上的羥基比較活潑，在活性氧的作用下，α-TOH會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>α-TO·。維生素C等活性物質(zhì)又能使其還原為α-TOH，從而被重復(fù)利用[8]。維生素E能猝滅1O2，是1O2良好的清除劑。由于維生素E是脂溶性維生素，既能附著在膜上，又能透過膜而進(jìn)入細(xì)胞，所以它對(duì)細(xì)胞膜的氧化損傷有很好的頡頏作用，能與LOO·反應(yīng)而終止LPO鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[3，8]。
(2)維生素C。維生素C是許多酶的輔助因子，機(jī)體缺乏時(shí)血管脆性會(huì)變大，創(chuàng)傷難以愈合。它是多羥基五元環(huán)，每一個(gè)OH都有接受活性氧的能力[8]。維生素C是水溶性維生素，能很好的作用于細(xì)胞質(zhì)中的極性氧自由基和被活化了中性白細(xì)胞釋放的活性氧，從而起到抗氧化和抗炎作用[14]。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，維生素C通過抗氧化作用，能對(duì)組胺引起的休克起到治療作用。維生素C和維生素K3協(xié)同作用時(shí)，能抑制DNA的氧化損傷。維生素C還可促進(jìn)維生素E的再生，如果二者結(jié)合使用，其抗氧化效果更好。
(3)β-類胡蘿卜素。β-類胡蘿卜素是維生素A的前體物質(zhì)，其分子構(gòu)成是多不飽和烴，所以易受活性氧自由基的攻擊。因此可防止機(jī)體內(nèi)LDL的過氧化損傷，并能提高HDL的含量[2，6]。β-類胡蘿卜素能使1O2轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>3O2和NADH合用還能使LOO·、L·轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>LH，從而終止LPO反應(yīng)鏈。研究發(fā)現(xiàn)，β-類胡蘿卜素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有預(yù)防作用，可降低心血管疾病發(fā)病率。給動(dòng)物飼喂β-類胡蘿卜素，可防止皮下和皮膚瘤的形成或延緩發(fā)展[14]。
4.3 其他抗氧化劑
(1)微量元素。許多微量元素都有抗氧化作用，如Se，Cu，Zn，Mn和Ge等。Se以GSH-Px的活性中心而發(fā)揮作用，能提高GSH-PX活力，加快GSH與自由基反應(yīng)速率[15]。含Se的有機(jī)制劑Ebselen是GSH-Px結(jié)構(gòu)類似物，對(duì)·OH有直接清除作用。Se還可抑制聯(lián)胺誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)LOOH的蓄積，從而保護(hù)生物膜。Se和維生素E協(xié)同作用時(shí)，抗氧化效果更好。Cu，Zn和Mn可通過改善SOD活性，發(fā)揮抗氧化作用。據(jù)報(bào)道，Ge也能通過提高SOD活性，從而降低MDA含量，并起到抗氧化作用[10]。
(2)中草藥對(duì)自由基的清除作用。迄今為止，人工合成的抗氧化劑的數(shù)量和效果非常有限，所以從天然動(dòng)藥物中提取和分離一些活性成分，篩選有效、無毒的自由基清除劑則是研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，有許多天然藥物中含有大量抗氧化有效成分，如人參皂甙、丹參酮、茶多酚、黃芪、枸杞、赤芍、何首烏、五味子、大蒜、黨參和類胡蘿卜素等，這些藥物在動(dòng)物試驗(yàn)中有顯著的抗氧化和保健作用。其中黃酮類、黃芪類、單寧類、倍單萜類、甾體類和蒽醌類等中藥有效成分，抗氧化和保護(hù)生物膜完整性方面均有良效[16-17]。
5 自由基與疾病
自由基能引起多種器管功能異?；蚪M織病變，如癌癥和衰老的發(fā)病機(jī)理與脂質(zhì)過氧化有關(guān)。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物褐色素沉著于皮膚會(huì)出現(xiàn)老年斑，沉著于心、腎、腦等臟器會(huì)影響它們的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能。礦物質(zhì)和維生素代謝紊亂時(shí)氧損傷有時(shí)也會(huì)加重，如克山病就是因?yàn)槲?/span>(Se)嚴(yán)重缺乏，結(jié)果GSH-Px，SOD和CAT的活性降低，MDA水平升高[18]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)維生素E，維生素C，維生素A等缺乏時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)氧應(yīng)激反應(yīng)。腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)理與自由基代謝紊亂有一定關(guān)系[8，14]。肝炎、肝硬化患者LPO產(chǎn)物和自由基的水平有明顯升高[19-20]。心血管疾病和糖尿病的發(fā)病機(jī)理也與自由基有關(guān)[20-21]。另外，象燒傷、休克等引起的缺血再灌是自由基產(chǎn)生的溫床。關(guān)節(jié)炎、脊髓灰質(zhì)炎的發(fā)病過程中，也有自由基的參與[22]。小雞滲出性素質(zhì)、肉雞肺動(dòng)脈高壓、動(dòng)物缺硒病等的發(fā)病機(jī)理也可能與自由基有密切關(guān)系[23-24]。
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