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T細(xì)胞特異性殺傷腫瘤的特性為將來的腫瘤治療帶來無限可能，現(xiàn)今CAR-T細(xì)胞免疫療法正處在快速發(fā)展階段，不管是在臨床前試驗還是最近獲批用于白血病和淋巴瘤的生物藥品，CAR-T細(xì)胞療法都是很有前景的腫瘤免疫治療技術(shù)。近日，最新一期《Science》刊登了CAR-T細(xì)胞治療領(lǐng)域的大咖Carl June的一篇綜述，全面講述了CAR-T細(xì)胞療法的研究歷程及未來面臨的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，快來跟小編一起飽嘗這頓CAR-T細(xì)胞領(lǐng)域的大餐吧。

1.2 CAR-T突破了TCR-T抗原識別的限制

TCR-T療法和CAR-T療法的制備工藝都是對患者自身的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外改造，然后再輸注回患者體內(nèi)殺傷腫瘤，但是這兩種療法識別抗原的機(jī)制卻截然不同。TCR是利用α和β肽鏈構(gòu)成的異二聚體來識別由MHC呈現(xiàn)在細(xì)胞表面的多肽片段。而CAR則是利用能夠與特定抗原結(jié)合的抗體片段來識別腫瘤細(xì)胞表面的抗原。

從細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白中獲得的肽鏈MHC分子都可以呈遞，因此TCR可以靶向更多種類的抗原，而CAR-T細(xì)胞只能靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原。但CAR也突破了TCR-T細(xì)胞療法上的一些限制，比如TCR-T需要MHC表達(dá)，MHC一致性和協(xié)同共刺激信號。腫瘤免疫耐受的一種重要機(jī)制就是腫瘤細(xì)胞上MHC相關(guān)的抗原呈遞因子表達(dá)缺失，因此CAR-T細(xì)胞也就明顯具有了重要的抗腫瘤優(yōu)勢。

圖1 CAR與TCR結(jié)構(gòu)設(shè)計

1.3 CAR-T療法研發(fā)歷程

第一代CAR-T研發(fā)出來以后很快就被投入臨床，雖能看到一些特異性的細(xì)胞毒性，但在2006年進(jìn)行臨床試驗總結(jié)時卻發(fā)現(xiàn)療效差強(qiáng)人意。究其原因，第一代CAR-T細(xì)胞在病人體內(nèi)很快就會耗竭，持久性很差，以至于CAR-T細(xì)胞還沒有來得及接觸到大量的腫瘤細(xì)胞時就已經(jīng)凋亡。

在2011年，靶向CD19和編碼共刺激區(qū)域的第二代CAR-T技術(shù)成為T細(xì)胞治療的主流。CD19是正常和惡性B淋巴細(xì)胞特異性表達(dá)的表面蛋白，在B細(xì)胞發(fā)育、增殖和分化以及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。CD19在B淋巴細(xì)胞表達(dá)的特異性和在惡性腫瘤表達(dá)的廣泛性，使其在治療B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤時頗具潛力。大部分的復(fù)發(fā)性白血病患者在接受了CD19 CAR-T治療后達(dá)到完全緩解。但免疫耐受也同樣出現(xiàn)了，在急性白血病患者中， CD19抗原表位缺失似乎是腫瘤免疫耐受的主要機(jī)制。這跟在TCR-T療法中觀察到的獲得性抗原呈遞缺陷或抗原缺失導(dǎo)致的抗原逃逸機(jī)制很像。成人和兒童急性白血病患者的國際性試驗數(shù)據(jù)顯示，CD19陰性缺失所導(dǎo)致的復(fù)發(fā)概率竟達(dá)到28%。目前還沒有報道說CD19缺失是慢性淋巴細(xì)胞白血病耐受的原因；推測慢性淋巴細(xì)胞白血病出現(xiàn)耐受可能是因為CAR-T細(xì)胞輸注后在體內(nèi)的擴(kuò)增受限。

CAR-T技術(shù)目前得到廣泛應(yīng)用。除了CD19，靶向BCMA和CD22的CAR-T細(xì)胞治療也相繼被投入臨床。早期臨床試驗結(jié)果顯示，靶向后兩種靶點(diǎn)在多發(fā)性骨髓瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病中也出現(xiàn)了與CD19相似的抗瘤活性，跟CD19一樣，這兩種抗原同樣在B細(xì)胞譜系中具有高度特異性。

從CAR-T細(xì)胞療法評估其他靶點(diǎn)的早期臨床試驗結(jié)果來看，CD19的脫靶交叉反應(yīng)雖并非個例，但在其他靶點(diǎn)中更常見。靶向BCMA或CD269的晚期骨髓瘤臨床試驗結(jié)果顯示，除了惡性骨髓瘤細(xì)胞，表達(dá)BCMA的非惡性漿細(xì)胞也被清除了，而靶向哪種正常的組織或細(xì)胞決定了對這種脫靶毒性的耐受性。

2.1 脫靶毒性

ERBB2/HER2蛋白是一種酪氨酸受體激酶，在腫瘤細(xì)胞中廣泛過表達(dá)，是抗體或抗體結(jié)合劑的有效靶點(diǎn)。但靶向ERBB2/HER2的CAR-T療法在第一例患者中就出現(xiàn)了致命的毒性。后來的第三代CAR技術(shù)的應(yīng)用研究顯示，這種毒性是由于低表達(dá)ERBB2的肺上皮細(xì)胞被錯誤識別并殺傷，導(dǎo)致了肺損傷和大量細(xì)胞因子釋放。

而靶向CAIX的第一代CAR-T細(xì)胞在腎細(xì)胞癌的I期臨床試驗中也遭遇了意外的肝臟毒性，這種肝毒性是由于CAIX抗原在正常膽管上皮細(xì)胞中低表達(dá)，而這種毒性在臨床前試驗階段并未被發(fā)現(xiàn)。

靶向CEACAM5的CAR-T細(xì)胞治療所帶來的延遲呼吸毒性與T細(xì)胞擴(kuò)增也表明了靶向這種抗原或許可以帶來抗瘤療效和脫靶毒性。

靶向其他腫瘤相關(guān)性抗原的CARs臨床試驗，包括間皮素、癌胚抗原、GD2神經(jīng)節(jié)苷脂，并沒有顯示出明顯的毒性，但抗瘤活性也很小。在臨床前階段GD2 CAR-T細(xì)胞抗瘤活性增強(qiáng)，但也引起了非常嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，這加劇了接下來的挑戰(zhàn)。

而在多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中局部注射靶向IL13Rα2的CAR-T細(xì)胞證實其具有抗瘤活性，而且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的毒性。這提示直接靶向抗原進(jìn)行瘤內(nèi)注射或可增加治療指數(shù)。

靶向EGFRvIII的CAR-T細(xì)胞療法相對安全，但一些患者也出現(xiàn)了瘤內(nèi)EGFRvIII抗原缺失，這也進(jìn)一步說明靶向多種抗原有利于防止抗原逃逸。

腫瘤微環(huán)境也是過繼性細(xì)胞免疫治療成功應(yīng)用要面臨的另一道很高的門檻，尤其在實體瘤中。目前研究比較清楚的抑制T細(xì)胞免疫活性的因子包括免疫檢查點(diǎn)、腫瘤代謝微環(huán)境的改變、調(diào)節(jié)T細(xì)胞和MSC細(xì)胞。過繼細(xì)胞輸注后瘤內(nèi)這些免疫和代謝抑制因子的上調(diào)，意味著即將出現(xiàn)獲得性耐受。CD19 CAR-T細(xì)胞聯(lián)合PD-1/PD-L1抑制劑的臨床試驗?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。此外，聯(lián)合其他免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床試驗也在開展中。

2.2 CAR-T細(xì)胞治療的毒性反應(yīng)及機(jī)制

CAR-T細(xì)胞治療的常見毒性為嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放綜合征。這種綜合征甚至比TIL和TCR-T細(xì)胞治療中常見的流感樣綜合征更厲害。研究顯示，CRS的嚴(yán)重分級與腫瘤負(fù)荷相關(guān)。最嚴(yán)重的CRS會出現(xiàn)包括嗜血細(xì)胞性淋巴細(xì)胞病和巨噬細(xì)胞激活綜合征等。

除了CRS，CD19和BCMA CAR-T細(xì)胞的臨床試驗中還報道了不同程度的神經(jīng)并發(fā)癥。CD19 CAR-T細(xì)胞引起的神經(jīng)毒性大部分是可逆的。但腦水腫是CRS的一種極端形式還是另有機(jī)制還不清楚。有證據(jù)表明內(nèi)皮損傷可能與導(dǎo)致神經(jīng)毒性的炎癥細(xì)胞因子有關(guān)，這大大支持了另有機(jī)制這一說法。

圖2 CAR-T細(xì)胞治療的毒性反應(yīng)

3.1 提高親和力或能增加CAR-T抗瘤活性

受體和配體的親和力是影響大多數(shù)受體通路的重要生化因素。親和力的工程化或許可以應(yīng)用于CAR的設(shè)計來增加CAR-T細(xì)胞的抗瘤活性，調(diào)節(jié)靶向療效和脫靶毒性。ERBB2/HER2編碼的細(xì)胞表面受體與很多上皮細(xì)胞惡性腫瘤的病理相關(guān)。CAR與ERBB2/HER2親和力的多樣性增加了對抗原表達(dá)的辨別，就是說可以提高對正常上皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的低表達(dá)抗原和腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)抗原的辨別能力。但顯然，最佳親和力的辨別并非那么簡單，就像GD2 CAR臨床前試驗結(jié)果:腫瘤活性的提高也伴隨嚴(yán)重神經(jīng)毒性。除了親和力，目前研究大力投入的還有CAR的胞外結(jié)構(gòu)及跨膜結(jié)構(gòu)和信號。遺憾的是，幾乎沒有明確的評價標(biāo)準(zhǔn)，而且CAR設(shè)計也存在很強(qiáng)的經(jīng)驗主義。此外，臨床前試驗結(jié)果不清晰也增加了CAR設(shè)計的復(fù)雜度。

3.2 通用型CAR-T或成未來趨勢

基于MHC的限制，傳統(tǒng)的CAR-T療法中T細(xì)胞主要來源于患者自身。如果MHC的阻礙可以被克服，那么，相比患者自身的T細(xì)胞，異體供體或通用型T細(xì)胞治療就具有了長足的優(yōu)勢。而且來自健康人的通用型CAR-T還有可能克服很多癌癥治療相關(guān)的免疫缺陷。再者通用型CAR-T療法可以以工業(yè)級的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提前制備，并且不受患者自身T細(xì)胞質(zhì)量的影響。

Torikai教授的工作組是第一個采用基因編輯技術(shù)制備通用型CAR-T細(xì)胞的，這種通用CAR-T細(xì)胞中不含功能性內(nèi)源TCR。基于TALEN基因編輯技術(shù)制備的通用型CAR-T，應(yīng)用到兩例患者的試驗證實了通用型CD19 CAR-T療法的可行性。但是，在這項試驗中，通用型CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)增受限，因此這兩例患者并未取得療效。重要的是，在MHC I類等位基因錯配的一位患者中出現(xiàn)了移植物抗宿主病，這可能與未被編輯的受污染的T細(xì)胞仍然存在內(nèi)源性TCR有關(guān)，這也提示我們，通用型CAR-T療法要想獲得成功需要更完善的基因編輯技術(shù)。盡管阿倫單抗（免疫調(diào)節(jié)藥物）可以調(diào)節(jié)免疫抑制，但NK細(xì)胞對MHC I類分子缺失細(xì)胞的識別仍然帶來一定的局限性。抑制NK細(xì)胞對通用型CAR-T細(xì)胞溶解的方式是插入HLA-E，敲除HLA-A，-B和-C，來阻止自身T細(xì)胞攻擊通用CAR-T細(xì)胞。鑒于該領(lǐng)域的快速發(fā)展，通用CAR-T細(xì)胞很可能會被廣泛使用。關(guān)鍵的問題就在于通用型CAR-T細(xì)胞能不能像干細(xì)胞移植或自體CAR-T細(xì)胞治療那樣作為單一療法或輔助療法進(jìn)行應(yīng)用。

3.3 基因編輯技術(shù)帶來的變革

目前有很多技術(shù)可以實現(xiàn)在DNA中引入靶向雙鏈斷裂的有效插入或刪除，從而使靶基因失活。同源性修復(fù)可以用于在靶點(diǎn)插入感興趣的基因。目前有很多基因編輯工具，而且這些技術(shù)也已經(jīng)成功應(yīng)用于工程T細(xì)胞。這個領(lǐng)域主要的難題在于細(xì)菌衍生的Cas9能否產(chǎn)生有效的免疫原性來干擾CRISPR-Cas9編輯的T細(xì)胞的傳遞。基因編輯技術(shù)帶來了一種新的機(jī)遇，敲除CTLA-4或PD-1免疫抑制信號，可以增強(qiáng)T細(xì)胞功能，甚至可能都沒有免疫檢查點(diǎn)抑制劑的毒性?；蚓庉嫾夹g(shù)還可用于敲除T細(xì)胞中CAR靶向的基因，這種基因雖可使CAR-T細(xì)胞靶向腫瘤相關(guān)抗原，但卻使T細(xì)胞免疫療法失效。最近，Eyquem教授研究組將CAR引入TCR中，這樣受體表達(dá)可以被內(nèi)源性TCR啟動子所控制，從而顯著提高CAR-T細(xì)胞的功能。

單一抗原區(qū)別腫瘤細(xì)胞和正常組織的能力有限，應(yīng)用也受到限制。為了提高靶向腫瘤的特異性，聯(lián)合傳感方式可靶向兩個或更多抗原。研究顯示，合成的Notch信號通路可以通過轉(zhuǎn)錄方式結(jié)合雙重抗原（《Science》長文：治療實體瘤更有效的CAR-T療法 | 白澤專欄）。結(jié)合抗原傳感系統(tǒng)來理解CAR表達(dá)的動力學(xué)特征很重要，因為生理參數(shù)的轉(zhuǎn)變可發(fā)生在CAR-T細(xì)胞輸注后的幾個小時內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)仍保持CAR表達(dá)，可能仍然可以調(diào)節(jié)毒性。

圖3 Notch受體實現(xiàn)靶向雙重抗原

為了減輕細(xì)胞回輸帶來的自身免疫反應(yīng)風(fēng)險， 研發(fā)了“自殺開關(guān)“，它可以誘導(dǎo)工程T細(xì)胞自發(fā)走向死亡。比如，引入FKBP2雙聚小分子（iCasp9的雙聚體分子），T細(xì)胞就會快速走向凋亡。在造血干細(xì)胞移植后同種異體淋巴細(xì)胞輸注中，iCasp9方法已經(jīng)得到了評估，并證明了可有效清除T細(xì)胞，可減輕自身免疫疾病。

目前全球正在進(jìn)行的CAR-T臨床試驗超過了250項。這些臨床試驗的數(shù)量存在地區(qū)差異，中國和美國CAR-T臨床試驗最多，成為轉(zhuǎn)化研究的熱門地區(qū)，而歐洲、日本和南半球相對來說要少很多。當(dāng)然，出現(xiàn)這種地區(qū)差異的原因很復(fù)雜，包括對這種新療法的接受和投資力度，衛(wèi)生部門的監(jiān)管政策以及社會文化的差異等。

圖4 CAR-T細(xì)胞療法開展臨床試驗的地區(qū)差異

血液瘤患者所接受的有效但非治愈性療法帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也是很大的挑戰(zhàn)，特別是對CLL和多發(fā)性骨髓瘤患者。作為美國最常見的白血病形式，2000年約有100000名CLL患者，治療只能改善生存狀況，并不能達(dá)到治愈，因此給患者和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)估計，每例患者終生的治療費(fèi)用為604000美元，而到2025年，僅美國的CLL疾病管理總費(fèi)用估計每年就要超過50億美元。

跟傳統(tǒng)療法相比，CAR-T細(xì)胞治療可能更具成本效益。但高度個性化的細(xì)胞免疫治療，制備工藝也需要個性化，這大大增加了成本。相信隨著制備工藝越來越成熟，CAR-T細(xì)胞治療的成本肯定能降低到普通百姓能用得起的價格。

總的來說， CAR-T細(xì)胞療法對于血液瘤絕對是一個突破。更重要的是，CAR-T是FDA批準(zhǔn)的第一種轉(zhuǎn)基因療法。目前，細(xì)胞免疫治療面臨的最大挑戰(zhàn)是缺乏臨床前模型來評估藥物的安全性和有效性。另外就是，在實體瘤方面的療效還需要更大的突破。

但值得期待的是，隨著工程T細(xì)胞、基因編輯和細(xì)胞制備工藝的發(fā)展，T細(xì)胞治療很可能可以擴(kuò)展到其他類型的細(xì)胞，比如多功能干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和NK細(xì)胞，而且適用的疾病也不再單單是腫瘤，還可能是傳染病、器官移植或自身免疫性疾病。

參考資料：

1.    Carl H. June, et al. Science 359, 1361–1365 (2018)

2.    Fesnak AD, et al. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81.