β-內(nèi)酰胺酶及其檢測(cè)方法
β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌產(chǎn)生的可水解β-內(nèi)酰胺環(huán)抗生素的酶。β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamase）的產(chǎn)生是細(xì)菌對(duì)(β內(nèi)酰胺類)抗菌藥物耐藥最常見的機(jī)制，，廣泛地涉及到許多社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，在各種耐藥機(jī)制中占80%。β-內(nèi)酰胺酶是由多種酶組成的酶家族，通過(guò)水解或非水解方式破壞進(jìn)入菌體內(nèi)的β-內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類抗生素失活，這些酶的基因存在于細(xì)菌的染色體或質(zhì)粒中。它的種類和數(shù)量現(xiàn)已超過(guò)了400種，β-內(nèi)酰胺酶分類比較多而復(fù)雜，最常用的有兩種，即分子生物學(xué)方法和布氏法。
其檢測(cè)方法包括常規(guī)方法和分子生物學(xué)方法。前者包括微生物法，碘量法，紙片酸度定量法，.產(chǎn)色頭胞菌素法；后者包括轉(zhuǎn)移性分析，基因分析，
酶蛋白性質(zhì)分析。
一 β內(nèi)酰胺酶的合成、定位及傳播方式
β內(nèi)酰胺酶既可以在細(xì)菌內(nèi)組成型表達(dá)，如銅綠假單胞菌；又可以由質(zhì)粒介導(dǎo)的誘導(dǎo)表達(dá)，如嗜水氣單胞菌及金黃色葡萄球菌。而質(zhì)粒介導(dǎo)的方式是細(xì)菌耐藥性傳播的一個(gè)主要機(jī)制，在革蘭氏陰性菌中利用接合的方式進(jìn)行傳播，而在革蘭氏陽(yáng)性菌中利用轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式獲得耐藥性狀。細(xì)菌的這種耐藥性狀的可轉(zhuǎn)移性正是細(xì)菌耐藥性爆發(fā)的原因。在革蘭氏陰性菌中，β內(nèi)酰胺酶象胞外酶一樣被分泌到膜外的環(huán)境，而在革蘭氏陽(yáng)性菌中，β內(nèi)酰胺酶在它與受體結(jié)合以攻擊抗生素的之前則停留在周質(zhì)腔中。
二 β內(nèi)酰胺酶的作用機(jī)制
β內(nèi)酰胺酶破壞β內(nèi)酰胺抗生素的β內(nèi)酰胺環(huán)有兩種作用機(jī)制。
第一，絕大多數(shù)常見的β內(nèi)酰胺酶有一個(gè)依賴絲氨酸發(fā)揮作用的機(jī)制，并且根據(jù)氨基酸序列組成分為三類（A，C和D）。通常它們的活性位點(diǎn)具有一個(gè)狹窄的縱形溝狀結(jié)構(gòu)，在溝的底部形成了一個(gè)空腔（氧陰離子袋），這種疏松的構(gòu)造容易彎曲，便于結(jié)合底物。由于β內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基碳在結(jié)合β內(nèi)酰胺酶活性部位的絲氨酸時(shí)發(fā)生了不可逆的反應(yīng)，結(jié)果使其成為開環(huán)物，進(jìn)而重建了β內(nèi)酰胺酶。這類酶對(duì)青霉素、頭孢菌素、單內(nèi)酰環(huán)類抗生素都有活性。
第二，是一類不大多見的β內(nèi)酰胺酶，被稱為金屬類β內(nèi)酰胺酶，或B類β內(nèi)酰胺酶。它們的特點(diǎn)是利用一個(gè)2價(jià)金屬離子，絕大多數(shù)為鋅離子，分別與組氨酸或半胱氨酸結(jié)合，或同時(shí)與二者結(jié)合，并與β內(nèi)酰胺類抗生素的羰基碳的酰胺鍵相互作用，使其不能發(fā)揮作用。這類酶主要對(duì)青霉素、頭孢菌素、碳青酶烯類抗生素發(fā)揮作用，但對(duì)單內(nèi)酰環(huán)類抗生素?zé)o效。
三 β內(nèi)酰胺酶的分類
迄今為止，人們發(fā)現(xiàn)的β內(nèi)酰胺酶的性質(zhì)多種多樣，從20世紀(jì)60年代后期以來(lái)人們做了許多嘗試將其分類。這些分類方法主要有兩個(gè)原則：第一種也是最古老的方法是基于酶的生化及功能特性；第二種方法是基于酶的分子結(jié)構(gòu)。
1. β內(nèi)酰胺酶的功能學(xué)分類
現(xiàn)有幾種標(biāo)準(zhǔn)來(lái)用于β內(nèi)酰胺酶的分類，包括抗生素的抑菌的作用范圍，β內(nèi)酰胺酶的耐藥范圍，β內(nèi)酰胺酶的等電點(diǎn)、最大水解速度、結(jié)合常數(shù)、等電聚焦、蛋白分子量等方法。
最新的分類方法是Bush于1995年提出，他將β內(nèi)酰胺酶分為四個(gè)大類（1－4）及六個(gè)亞類（a－f）。
第1類為耐頭孢菌素的β內(nèi)酰胺酶，但不被克拉維酸所抑制，分子生物學(xué)分類屬于C類。
第2類為耐青霉素酶、耐頭孢菌素酶，可以被克拉維酸所抑制，分子生物學(xué)分類屬于A和D類，是由最初的TEM和SHV基因表達(dá)的結(jié)果。但由于表達(dá)的β內(nèi)酰胺酶的TEM和SHV基因數(shù)量越來(lái)越多，它們首先被分為兩個(gè)亞類2a和2b。2a亞類只包括耐青霉素酶，而2b亞類范圍較廣，它可以使青霉素、頭孢菌素以同樣速度失活。進(jìn)一步的分類都是在2b基礎(chǔ)上劃分的：亞類2be，字母e代表廣譜酶活性，即ESBLs，可以使第三代頭孢菌素（頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢泊肟）失活，還可以使單內(nèi)酰環(huán)類抗生素（氨曲南）失活；亞類2br，字母r表示減少與克拉維酸及舒巴坦的結(jié)合，所以也被稱為TEM基因表達(dá)的有抗性的抑制劑，可是它們依然對(duì)他佐巴坦敏感。隨后又分出4個(gè)亞類，亞類2c是對(duì)羧芐青霉素效果比對(duì)青霉素要好，而且對(duì)氯唑西林有一定的作用。亞類2d的酶對(duì)氯唑西林耐藥效果比對(duì)青霉素要好，對(duì)羧芐青霉素有一定的作用；這些酶很少被克拉維酸所抑制，并且這些酶中的一部分成為ESBLs。亞類2e的這些酶是耐頭孢菌素酶，但同樣可以水解單內(nèi)酰環(huán)類抗生素，也可以被克拉維酸所抑制。亞類2f被加上是因?yàn)樗鼈兪且蕾嚱z氨酸發(fā)揮作用的耐碳青酶烯酶，與第3類中的依賴鋅離子發(fā)揮作用的耐碳青酶烯酶形成對(duì)比。
第3類是依賴鋅離子或金屬離子的β內(nèi)酰胺酶，分子生物學(xué)分類屬于B類。它們是唯一的在鋅離子或金屬離子輔助下發(fā)揮作用的酶。它們可以水解青霉素、頭孢菌素、碳青酶烯抗生素。這樣，碳青酶烯抗生素既可以被亞類2f酶(絲氨酸作用機(jī)制)抑制，又可以第3類酶（鋅離子作用機(jī)制）所抑制。
第4類酶是不能被克拉維酸所抑制的耐青霉素酶，但目前在分子生物學(xué)上沒(méi)有分類。
2 β內(nèi)酰胺酶的分子生物學(xué)分類
β內(nèi)酰胺酶的分子生物學(xué)分類方法是基于核酸及氨基酸的序列的差異。迄今為止，人們已經(jīng)確認(rèn)了四種類型的β內(nèi)酰胺酶（A、B、C、D），相對(duì)應(yīng)的功能學(xué)上分類如前所述。其中A類、C類和D類β內(nèi)酰胺酶是依賴絲氨酸發(fā)揮作用，而B類β內(nèi)酰胺酶是依賴鋅離子或金屬離子輔助下發(fā)揮作用的酶。
A類酶包括多種質(zhì)粒編碼的青霉素酶，活性部位為絲氨酸殘基，分子量為29kDa；
B類酶為金屬酶，由染色體或質(zhì)粒編碼，酶活性需鋅離子參與，可被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制；
C類酶的活性部位為絲氨酸殘基，分子量為39 kDa，其產(chǎn)生與誘導(dǎo)劑有關(guān)；
D類酶又稱為OXA型（水解苯唑西林）β-內(nèi)酰胺酶。
四 β內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法
1.常規(guī)方法
(1).微生物法：
[原理] 以一種對(duì)青霉素高度敏感的細(xì)菌-枯草芽孢桿菌作為指示劑，試驗(yàn)時(shí)如果被測(cè)細(xì)菌株產(chǎn)生青霉素酶，破壞了青霉素，則此高度敏感菌株即可生長(zhǎng)，否則，指示劑則被抑制。
[方法] 以枯草芽孢桿菌為指示菌，用棉拭子將枯草芽孢桿菌接種于瓊脂培養(yǎng)基上，或傾注方法將枯草芽孢桿菌混于瓊脂平板內(nèi)。然后將被測(cè)菌與產(chǎn)青霉素酶陽(yáng)性及陰性對(duì)照菌株，按下圖接種劃線，在瓊脂培養(yǎng)基中央放置一含青霉素G（1單位）紙片。放置35℃培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。
[結(jié)果判斷] 如被檢菌產(chǎn)生青霉素酶，則沿著被測(cè)菌處的枯草芽孢桿菌抑菌環(huán)出現(xiàn)凹痕。
[應(yīng)用] 生物學(xué)方法是古老的方法，由于特異性差、靈敏度低，現(xiàn)在基本上很少被采用。
(2).碘量法
[原理] β-內(nèi)酰胺酶能裂解青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)形成青霉噻唑酸，它與淀粉競(jìng)爭(zhēng)游離碘，破壞了碘和淀粉的蘭色復(fù)合物，使蘭色變?yōu)闊o(wú)色。
[方法]
①將0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸鹽緩沖液中，使其濃度成6000ug/ml。取0.1ml于一小試管中。
②將培養(yǎng)18-24小時(shí)的細(xì)菌在含青霉素試管內(nèi)制成濃厚菌懸液（109/ ml）。
③在37℃水浴中放置30分鐘，不時(shí)搖動(dòng)，使酶能破壞青霉素。
④加入1%可溶性淀粉溶液0.5 ml，搖勻。
⑤加入碘液0.02 ml。
⑥在37℃水浴中放置10分鐘，觀察結(jié)果。
[結(jié)果] 在10分鐘內(nèi)能使蘭色完全消退的菌株為β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，不消退者為陰性。
[注意事項(xiàng)]
①由于青霉素很容易分解，因而用于實(shí)驗(yàn)的青霉素應(yīng)新鮮配制。
②淀粉也新鮮配制，在100 ml蒸餾水中加入1克可溶性淀粉，放到開水中水浴直到淀粉溶解。
③實(shí)驗(yàn)應(yīng)按照步驟操作，如果碘加得過(guò)早，酶反應(yīng)就會(huì)停止，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
④每次試驗(yàn)最好用陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
[應(yīng)用] 常用于檢測(cè)淋病奈瑟氏菌。
（3）.紙片酸度定量法
[原理] β-內(nèi)酰胺酶能破壞青霉素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，形成青霉噻唑酸，使PH降低，指示劑溴甲酚紫顏色由紫變黃。
[方法]
①將一小片Whatman濾紙放于空平皿中。
②讓濾紙吸足青霉素溶液（0.05M磷酸緩沖液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%無(wú)緩沖劑的結(jié)晶青霉素）。
③用接種環(huán)把10-20個(gè)菌落涂到濾紙上，
④蓋好平皿后，將濾紙片在37℃孵育30分鐘，觀察結(jié)果。
[結(jié)果] 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株使濾紙顏色由紫色變黃色，一般在10分鐘內(nèi)即能看到。
[應(yīng)用] 紙片酸度定量法一般用于檢測(cè)淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和葡萄球菌。
（4）.產(chǎn)色頭胞菌素法
[原理] 產(chǎn)色頭胞菌素如頭胞硝噻吩（nitrocefin）的β-內(nèi)酰胺環(huán)能被β-內(nèi)酰胺酶所破壞，使其顏色由淺黃色變?yōu)榉奂t色，以此來(lái)測(cè)定細(xì)菌的產(chǎn)酶情況。
[方法] 將頭胞硝噻吩（nitrocefin）紙片置于干凈的平皿內(nèi)，用無(wú)菌的牙簽或接種環(huán)挑取細(xì)菌菌落涂于紙片上，觀察紙片有無(wú)顏色變化。
[結(jié)果] 紙片涂抹處如顏色由淺黃色變成粉紅色，表示該菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，如顏色不變，表示細(xì)菌不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。
[應(yīng)用] 頭胞硝噻吩（nitrocefin）主要檢測(cè)淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）、葡萄球菌，結(jié)果可靠。莫拉氏菌（布拉漢氏菌）只能用頭胞硝噻吩（nitrocefin）法。
（對(duì)于淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）快速測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶比做藥敏試驗(yàn)?zāi)芨斓氐玫脚R床需要的結(jié)果。β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)還可驗(yàn)證葡萄球菌對(duì)紙片法青霉素的敏感試驗(yàn)結(jié)果是否可信。腸桿菌科、假單胞菌科及其它需氧革蘭氏陰性桿菌不必測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶，因其結(jié)果常常不能預(yù)測(cè)這類細(xì)菌對(duì)臨床常用來(lái)治療β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物的敏感性。）
2.分子生物學(xué)方法
1．酶蛋白性質(zhì)分析：包括表型分析和酶動(dòng)力學(xué)分析。
耐藥表型分析：紙片藥敏試驗(yàn)和E-試驗(yàn)測(cè)定MICs
提取酶粗提物進(jìn)行a.三相水解試驗(yàn)。
b.等電聚焦電泳。
c.酶動(dòng)力學(xué)分析。
2．基因分析：基因型別分類、測(cè)序、分析其結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。
a.PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物測(cè)序。
b.PCR擴(kuò)增整合子全可變區(qū)，分析其中結(jié)構(gòu)和可能的β-內(nèi)酰胺酶基因。
c.鳥槍法克隆可表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶基因，分析基因結(jié)構(gòu)。
3．轉(zhuǎn)移性分析：分析酶編碼基因位于質(zhì)粒上還是染色體上，在不在整合子中。
A。質(zhì)粒：
a.質(zhì)粒接合試驗(yàn)。
b.轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：電轉(zhuǎn)化、鈣轉(zhuǎn)化或MgCl2轉(zhuǎn)化
B。整合子：PCR擴(kuò)增整合子全可變區(qū)及PCR產(chǎn)物序列測(cè)定。
另外，基因芯片可用于病原微生物耐藥基因的表達(dá)譜檢測(cè)、突變分析、多態(tài)性的測(cè)定。病原體的耐藥基因的檢測(cè)可通過(guò)兩種方式：表達(dá)譜芯片檢測(cè)藥物誘導(dǎo)的基因表達(dá)改變來(lái)分析其耐藥性；寡核苷酸芯片檢測(cè)基因組序列的亞型或突變位點(diǎn)從而分析其耐藥性。
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