能量是維持生命系統(tǒng)復(fù)雜性及有序性的基礎(chǔ)，作為具有獨立基因組DNA的半自主細(xì)胞器，線粒體是包含人類在內(nèi)的幾乎所有真核生命的能量代謝中樞。在衰老過程中，線粒體的功能顯著下降并導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝穩(wěn)態(tài)失衡，進而促進衰老及相關(guān)疾病的進程。但伴隨衰老進程線粒體功能下降的核心原因尚未有明確定論，其中一個重要假設(shè)即是：伴隨著衰老進程線粒體DNA（mtDNA）突變會不斷累積，而由于mtDNA編碼了線粒體氧化磷酸化所需的部分核心蛋白，因此mtDNA突變積累到一定程度后可導(dǎo)致線粒體及細(xì)胞功能的異常，促進衰老及相關(guān)疾病的發(fā)生。

 

由于mtDNA突變具有高度的細(xì)胞間異質(zhì)性，而傳統(tǒng)的混合細(xì)胞測序（Bulk sequencing）技術(shù)會導(dǎo)致單個細(xì)胞中的高頻突變被平均化而無法被測到，極大地限制了我們對于細(xì)胞中mtDNA突變頻率和突變譜的認(rèn)識。因此，開發(fā)相應(yīng)技術(shù)以在單細(xì)胞層面探究mtDNA突變與個體細(xì)胞衰老及相關(guān)疾病的關(guān)系尤為重要。

 

近日，康奈爾大學(xué)顧正龍教授（現(xiàn)就職于復(fù)旦大學(xué)和粵港澳大灣區(qū)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院（廣州））團隊，在 PNAS 發(fā)表了題為：High-frequency and functional mitochondrial DNA mutations at the single-cell level 的研究論文。

 

該研究通過使用自主開發(fā)的低成本的單細(xì)胞mtDNA深度測序技術(shù)（scSTAMP，多重探針靶向擴增的單細(xì)胞mtDNA測序）對健康老年個體的B淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞進行單細(xì)胞mtDNA深度測序，首次揭示老年個體體細(xì)胞中mtDNA突變具有遠(yuǎn)高于預(yù)期的高頻性、有害性及異質(zhì)性，為衰老過程中線粒體功能下降現(xiàn)象提供了新的機制解釋，并為衰老及相關(guān)疾病的干預(yù)及治療提供了新的研究方向。

 

為更準(zhǔn)確地評估細(xì)胞內(nèi)mtDNA突變率及其對細(xì)胞功能的影響，研究團隊首先基于基于前期自主開發(fā)的STAMP (Sequencing by Targeted Amplification of Multiplex Probes) 技術(shù)，開發(fā)了低成本的單細(xì)胞mtDNA靶向測序技術(shù)（scSTAMP）?；谠摷夹g(shù)平臺，研究團隊獲取了同一受試者的24 個B淋巴細(xì)胞（代表淋系）和24個單核細(xì)胞（代表髓系），將其裂解液分成兩份，分別進行文庫構(gòu)建及深度測序，發(fā)現(xiàn)兩者之間的突變譜具有高度的一致性，成功驗證了scSTAMP技術(shù)檢測單細(xì)胞水平mtDNA突變的可靠性。

 

單細(xì)胞mtDNA靶向測序技術(shù)（scSTAMP）的技術(shù)原理

 

為進一步系統(tǒng)探究老年個體細(xì)胞中mtDNA的突變圖譜，并評估m(xù)tDNA突變對細(xì)胞功能的潛在影響，研究團隊運用scSTAMP技術(shù)對來自一名76歲捐獻者的各768個B淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞進行了超高深度（平均測序深度大于640×）mtDNA測序。研究團隊在這些B淋巴細(xì)胞的416個mtDNA位點中鑒定到了473個突變頻率超過20%的突變，而在這些單核細(xì)胞的439個mtDNA位點中鑒定到了503個突變頻率超過20%的突變，平均每個B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中存在0.658個和0.712個高頻mtDNA突變位點。

 

進一步分析發(fā)現(xiàn)，318個（50.3%）B淋巴細(xì)胞及346個（56.1%）單核細(xì)胞中至少具有一個高頻mtDNA突變（>20%）。有趣的是，絕大多數(shù)B淋巴細(xì)胞（93.8%）和單核細(xì)胞（90.2%）中檢測到的mtDNA突變位點都只出現(xiàn)了一次，說明老年個體體細(xì)胞的mtDNA突變具有高度的細(xì)胞間異質(zhì)性及隨機性。同時，還發(fā)現(xiàn)24.3%的B淋巴細(xì)胞和17.5%的單核細(xì)胞具有至少一個突變頻率高于90%的高頻突變位點。上述結(jié)果表明，高頻mtDNA突變在衰老個體的B細(xì)胞和單核細(xì)胞中廣泛存在。

 

B細(xì)胞和單核細(xì)胞中存在廣泛的mtDNA突變

 

在上述研究基礎(chǔ)上，研究團隊對鑒定到的單細(xì)胞mtDNA突變進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)90%以上的mtDNA突變均定位于蛋白編碼基因及tRNA基因區(qū)，且定位于蛋白編碼基因的mtDNA突變中，絕大部分（>75%）均為非同義突變。為進一步評估上述mtDNA突變的有害性，研究團隊利用CADD (The Combined Annotation Dependent Depletion scores）數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞中的52.2%的錯義突變及單核細(xì)胞中59.6%的錯義突變的分值均大于20，表明這些mtDNA突變具有較高的致病性，提示細(xì)胞內(nèi)廣泛的mtDNA突變有可能顯著影響線粒體的功能，促進細(xì)胞及個體的衰老。文章還比較了兩種細(xì)胞之間的突變差異。

 

B細(xì)胞和單核細(xì)胞中單細(xì)胞mtDNA突變功能分析

 

總而言之，該研究成功開發(fā)了低成本的單細(xì)胞mtDNA測序技術(shù)，并基于該技術(shù)繪制了老年個體的B細(xì)胞及單核細(xì)胞的mtDNA突變譜，發(fā)現(xiàn)老年個體的體細(xì)胞中mtDNA突變極為普遍，且具有高度的異質(zhì)性及有害性，為衰老過程中線粒體功能下降的原因提供了一種新的機制解釋。這一研究也提示mtDNA突變及衍生的線粒體功能下降是衰老及相關(guān)疾病的重要基礎(chǔ)，而降低細(xì)胞mtDNA突變積累可能有助于衰老及相關(guān)疾病的預(yù)防及治療。

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