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真核生物異染色質(zhì)是高度壓縮的染色質(zhì)區(qū)域，富集了DNA/組蛋白甲基化等多種轉(zhuǎn)錄沉默型表觀修飾和特異的組蛋白變體等因子，對維持該區(qū)域的基因沉默和基因組穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用。染色質(zhì)重塑蛋白可通過調(diào)節(jié)核小體上DNA和組蛋白八聚體之間的相互作用，移動、重排和重組染色質(zhì)纖維，從而改變?nèi)旧|(zhì)的緊密程度和三維結(jié)構(gòu)，影響基因的表達(dá)。R-loop是由RNA:DNA雜合鏈和單鏈DNA組成的三鏈核酸結(jié)構(gòu)，在基因組上廣泛存在。孫前文實驗室前期的全基因組R-loop檢測發(fā)現(xiàn)大量低峰度的R-loop富集于擬南芥基因組的異染色質(zhì)區(qū)域，但其相應(yīng)的功能和生物學(xué)意義仍然未知。

清華大學(xué)生命學(xué)院孫前文實驗室在《科學(xué)·進(jìn)展》（Science Advances）雜志上發(fā)表了題為“DDM1介導(dǎo)的R-loop解除和H2A.Z排斥促進(jìn)擬南芥異染色質(zhì)的形成”（DDM1-mediated R-loop resolution and H2A.Z exclusion facilitates heterochromatin formation in Arabidopsis）的研究論文4，揭示了擬南芥中染色質(zhì)重塑蛋白DDM1可通過解除R-loop結(jié)構(gòu)并排除組蛋白變體H2A.Z來啟動異染色質(zhì)形成的機制。該研究中，作者收集了眾多影響擬南芥異染色質(zhì)狀態(tài)的突變體并進(jìn)行了全基因組R-loop測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)重塑蛋白DDM1的突變會引起著絲粒周圍區(qū)域異染色質(zhì)R-loop水平顯著升高（圖1）。

圖1 DDM1突變導(dǎo)致著絲粒附近R-loop水平升高

DDM1是SWI/SNF家族蛋白的一員，早在1993年就發(fā)現(xiàn)其突變后會導(dǎo)致全基因組甲基化水平降低，但背后的機制仍然未知。通過ChIP-seq結(jié)果顯示DDM1富集在染色體的著絲粒周圍區(qū)域，而DDM1的突變會引起該區(qū)域的異染色質(zhì)水平下降以及轉(zhuǎn)錄水平升高。有趣的是，轉(zhuǎn)錄抑制劑FLA可以顯著降低ddm1突變體中R-loop在著絲粒附近的富集，同時部分回補DNA甲基化在ddm1中的缺失（圖2）。這些結(jié)果說明，DDM1可抑制與轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)的R-loop異常積累，從而確保著絲粒附近的DNA甲基化等異染色質(zhì)狀態(tài)正常建立。

圖2 轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)R-loop破壞著絲粒附近異染色質(zhì)

DDM1的N端和C端都有保守的解旋酶結(jié)構(gòu)域（圖3A）,并且擬南芥ddm1-1突變體在C端解旋酶保守結(jié)構(gòu)域中發(fā)生了C615Y的氨基酸殘基突變。體外結(jié)果顯示，RNA:DNA雜合鏈可以顯著激活DDM1蛋白的ATPase活性，并且體外重組的DDM1蛋白可以RNA從RNA:DNA雜合鏈結(jié)構(gòu)中解離，但是突變體蛋白DDM1C615Y的解旋酶活性顯著下降（圖3）。結(jié)合in vivo數(shù)據(jù)，表明DDM1可以直接清除在異染色質(zhì)區(qū)域瞬時轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的R-loop結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)異染色質(zhì)形成。

圖3 DDM1解除RNA:DNA雜合鏈

為了深入探索DDM1促進(jìn)異染色質(zhì)形成的機制，作者通過結(jié)合免疫沉淀-質(zhì)譜分析尋找DDM1的互作蛋白。結(jié)果顯示，DDM1可以和多種H2A組蛋白變體互作，其中H2A.W與H2A.Z兩種變體在基因組上的分布是互斥的（圖4A和B）。ChIP-seq結(jié)果顯示，DDM1功能缺失的突變體中，著絲粒區(qū)域的H2A.W含量下降，而H2A.Z含量上升（圖4C），說明野生型中異染色質(zhì)區(qū)域定位的DDM1阻止了H2A.Z在該區(qū)域富集。體外互作結(jié)果表明，DDM1可以分別與H2A.W-H2B、H2A.Z-H2B二聚體互作（圖4D），但是H2A.W-H2B可以抑制DDM1與H2A.Z-H2B復(fù)合物的形成（圖4E），這也解釋了在野生型中DDM1可以幫助H2A.W定位在著絲粒周圍區(qū)域、同時抑制H2A.Z在該區(qū)域的富集這一現(xiàn)象。有趣的是，DDM1與H2A.W-H2B、H2A.Z-H2B均可抑制DDM1的解旋酶活性（圖4F），而H2A.W的三突變體h2a.w-3中R-loop水平并沒有顯著升高（圖4C），表明DDM1解除R-loop和調(diào)控H2A變體定位的這兩種功能相互獨立。

圖4 DDM1抑制H2A.Z在著絲粒附近富集

由于H2A.Z在染色體上的定位由SWR1復(fù)合物介導(dǎo)，作者在ddm1背景下對擬南芥SWR1復(fù)合物的關(guān)鍵因子ARP6進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)ddm1arp6雙突可以一定程度上降低H2A.Z的積累，同時回補ddm1升高的R-loop和降低的DNA甲基化水平（圖5）。這些結(jié)果說明，DDM1可以抑制H2A.Z在著絲粒周圍區(qū)域的積累，同時解除由H2A.Z富集帶來的轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)R-loop，從而促進(jìn)異染色質(zhì)的形成。

圖5 抑制H2A.Z的富集可回補ddm1中R-loop的異常積累和DNA甲基化缺失

最后，作者發(fā)現(xiàn)DDM1抑制H2A.Z、解除R-loop的功能與花粉核的形態(tài)密切相關(guān)。野生型的花粉中，DDM1在精核（SN, sperm nuclei）中富集，而H2A.W也在精核中積累，但H2A.Z和R-loop在營養(yǎng)核（VN, vegetative cell nuclei）中富集（圖6A-C）。DDM1功能缺失后，H2A.Z和R-loop信號可以擴散到精核中（圖6B和C），但H2A.W在精核中的聚集狀態(tài)沒有發(fā)生改變（圖6A）。同時，ddm1突變體中異常富集的H2A.Z與R-loop伴隨著花粉精核變大、空洞的形成（圖6D）。

圖6 DDM1在精核中解除R-loop和抑制H2A.Z富集

綜上所述，本項研究揭示了擬南芥的一種染色質(zhì)重塑蛋白DDM1的主要功能是排斥異染色質(zhì)區(qū)域的H2A.Z積累并解除R-loop，從而啟動異染色質(zhì)的形成，闡明DDM1維持基因組DNA甲基化的分子新機制和生物學(xué)新功能。

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