RNA 抽提比基因組 DNA 抽提要困難得多。事實上，現(xiàn)有的 RNA 抽提方法/試劑，如果用于從培養(yǎng)細胞中抽提 RNA，比抽提基因組 DNA 更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織 RNA 的抽提，總會碰到問題呢？
剛涉及 RNA 抽提的新手都會聽到別人說 RNase 很頑固，用高壓滅菌都無法去除其活性。于是在配制 Tris 緩沖液時就遇到了兩難的境地。Tris 緩沖液不能用 DEPC 處理，只能用 DEPC 處理過的水配制，那么在藥品稱量、調(diào) pH 值等過程中 Tris 緩沖液會造到 RNase 的再次污染，所以是一個兩難的境地。但是今天我要談的是 RNase 并不頑固，高壓滅菌可以去除其大量活性。
下面的實驗照片很清楚的顯示了高壓滅菌的效果。實驗很簡單，將不同含量的 RNase 用高壓滅菌處理，然后與未高壓滅菌處理的 RNase 一起來降解 RNA（37 度 1 小時），結果表明，當 RNase 的污染量小于 100 ng/ml 時，高壓滅菌可以去除其活性。
這張照片還說明了一個問題，當你的 RNA 溶液中含有很微量的 RNase 污染時，不用過于擔心，因為 RNase 對 RNA 的降解是需要時間的，更何況你的 RNA 是存放在低溫下的。
誤區(qū)一：重復使用含 DEPC 的水處理槍頭、離心管等。
由于 DEPC 較貴，而且書上說 DEPC 要用高壓滅菌處理去除，于是有些人就萌發(fā)了重復使用 DEPC 的想法，即對含有 DEPC 的水不進行高壓滅菌，從而重復使用含 DEPC 的水處理槍頭、離心管等。
節(jié)約本是好事，但這樣的節(jié)約是無效的。為什么不能重復使用含 DEPC 的水？因為 DEPC 在水溶液中不穩(wěn)定，極易分解，DEPC 在 pH 6.0 和 pH 7.0 的 PBS 緩沖液中的半衰期分別約為 20 min 和 10 min，DEPC 在水中的半衰期約為 30 min。因此，重復使用含 DEPC 的水就不能保證槍頭和離心管的 RNase-free。
誤區(qū)二：必需長時間高壓滅菌來徹底去除 DEPC。
用 DEPC 處理過的溶液，在 15－20 min 的高壓滅菌后還可以聞到一股特殊的香味，因此有人認為高壓滅菌去除 DEPC 不徹底，所以要延長高壓滅菌的時間以完全去除 DEPC。
但是延長高壓滅菌的時間并不需要，因為聞到的特殊香味不是 DEPC 的，而是 DEPC 分解產(chǎn)物之一的乙醇同溶液中殘留的微量的羧酸（如甲酸和乙酸等）反應產(chǎn)生的揮發(fā)性脂類。這種特殊的水果香味不代表有痕量的 DEPC 殘留。
誤區(qū)三：溶液中 DEPC 含量約高，滅活 RNase 的效果越好。
這個誤區(qū)錯了一半，的確，1% DEPC 能滅活高達 1000 ng/ml 的 RNase A，而 0.1% DEPC 只能滅活少于 500 ng/ml 的 RNase A。但是溶液中殘留的 DEPC 副產(chǎn)物會抑制一些酶反應，例如 DEPC 副產(chǎn)物會抑制體外轉錄反應，因此 DEPC 含量越高，高壓滅菌后的 DEPC 副產(chǎn)物就越多，抑制越明顯。
不少的文獻都說，用 LiCl 沉淀 RNA 有很多好處，比如只沉淀 RNA，不會沉淀 DNA、蛋白和多糖等。但就是操作比較麻煩，比如，過夜沉淀，不能沉淀小分子 RNA 等。下面就 LiCl 沉淀方法的誤區(qū)進行探討。
誤區(qū)一：LiCl 不能沉淀小分子 RNA。
很多文獻都說 LiCl 沉淀的 RNA 不含小分子的 5s rRNA 和 tRNA。但，事實是這樣嗎？至少在我的實驗中發(fā)現(xiàn) LiCl 可以沉淀小分子 RNA。
下面的圖片更能說明 LiCl 可以沉淀小分子 RNA。泳道 1 是 RNA maker，泳道 2、3、4 是用 LiCl 沉淀的 RNA。當然 LiCl 沉淀 tRNA 的效果真的不好，其原因可能是 tRNA 的高度二級結構。
誤區(qū)二：LiCl 沉淀需要長時間和低溫。不少文獻上說 LiCl 沉淀需要 4 度、－20 度、甚至－80 度下放置 1 小時、2 小時、甚至過夜，其操作極其繁雜。但是，LiCl 沉淀真的需要長時間和低溫嗎？
讓我們來看看下面的數(shù)據(jù)：
Lane 1, RNA marker.
Lane 2, RNA centrifutged immediately without chilling.
Lane 3, RNA chilled at -20°C for 30 minutes before centrifugation.
Lane 4, RNA incubated at 25°C for 30 minutes to test precipitation time independently of chilling.
Lane 5, RNA chilled at -20°C for 1 hour.
Lane 6, RNA incubated at 25°C for 1 hour.
圖片顯示放置 30 min 后，RNA 沉淀比不放置更有效（請比較泳道 2 和 3），但是比較泳道 3、4、5、6 后，你會發(fā)現(xiàn)在－20 度下沉淀與在 25 度下沉淀沒有區(qū)別，放置 30 min 與放置 1 小時沉淀沒有區(qū)別。
但是建議大家用 -20 度 ＋ 30 minutes 的沉淀方法，因為低溫能降低 RNases 的活性（假設有痕量的 RNase 殘留）。
小提示：任何事務有利便有弊，LiCl 沉淀與乙醇沉淀相比，它的沉淀效率稍低。數(shù)據(jù)顯示 2.5 M 的 LiCl 的平均沉淀率是 74％，而乙醇則是 85％。通俗的說乙醇沉淀可以得到更多的 RNA。
本文作者系丁香園站友 @eagleeden
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