本文刊于:中華心血管病雜志, 2016,44(04): 364-366
作者:姜雋 楊悠 姜睿 何延政
人類基因組只有20%的DNA用于編碼蛋白質(zhì)，其余轉(zhuǎn)錄成RNA但不被翻譯成蛋白質(zhì)，稱為非編碼RNA。部分非編碼RNA參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、剪切和修飾等，在生命活動中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，對小非編碼RNA的研究取得了很多進展，尤其是microRNA[1]，它廣泛參與細胞分化、發(fā)育、衰老和腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生命活動和疾病過程。長鏈非編碼RNA，長度為200～10000nt，也受到較多關(guān)注。長鏈非編碼RNA在發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等領(lǐng)域具有重要意義。相對這些非編碼RNA而言，人們對環(huán)狀RNA的認識不多，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它參與不少重要的生命過程[2,3]。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，環(huán)狀RNA在作為疾病診斷的特異性標志物和疾病治療靶點等方面具有優(yōu)勢。本文就環(huán)狀RNA的形態(tài)特點、潛在功能、作用機制以及在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用進行綜述。
一、環(huán)狀RNA的形成與特點
遺傳信息傳遞的標準流程為：DNA先轉(zhuǎn)錄為核內(nèi)不均一RNA(hnRNA，主要為前信使RNA)，然后剪去內(nèi)含子并進行5'和3'修飾，成為成熟的mRNA，mRNA在細胞質(zhì)中被核糖體翻譯成多肽鏈，最后折疊形成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)反過來協(xié)助前兩項流程，并協(xié)助DNA復(fù)制。由基因組轉(zhuǎn)錄形成的RNA中，不翻譯為蛋白質(zhì)的部分稱為非編碼RNA，包括轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、小RNA(包括snoRNA、microRNA、siRNA和piRNA)、大RNA(Xist、Evf、Air、CTN和PINK等)以及近年來受到關(guān)注的長鏈非編碼RNA(lncRNA)。
人們曾認為RNA都是線性的，然而20世紀70年代科學(xué)家在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)一種環(huán)形RNA分子，命名為環(huán)狀RNA[4]。其后，分別在酵母細胞和人體細胞中發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA[5,6]。后續(xù)研究證實，環(huán)狀RNA在細胞中廣泛存在，只是由于經(jīng)典的RNA測序法只分離具有特征性poly(A)尾巴的RNA，而環(huán)狀RNA末端連在一起沒有尾巴，所以才長時期受到忽視。隨著測序技術(shù)的進步，生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)大量無尾巴的環(huán)狀RNA，并逐漸揭示其成環(huán)機制及在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要功能。
mRNA前體形成以后，將內(nèi)含子移出RNA序列的過程稱為剪接。在經(jīng)典的剪接過程中，剪接體(一種核內(nèi)蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合體)識別內(nèi)含子的3'和5'剪接位點，5'位點(或稱供體剪接位點)受到攻擊形成一個套索。外顯子1的5'攻擊外顯子2的3'位點(或稱受體剪接位點)，兩個外顯子接合在一起，而內(nèi)含子套索被釋放和分解。在非經(jīng)典剪切中，有以下幾種方式可以形成環(huán)狀RNA[7]：(1)索尾插接。兩段未剪切的內(nèi)含子之間配對，內(nèi)含子5'分支點攻擊3'位點，外顯子3'剪切供體攻擊自身5'剪切受體，形成環(huán)狀RNA。(2)外顯子跳讀形成套索，套索經(jīng)內(nèi)部剪切后形成環(huán)狀RNA。(3)人為過表達法構(gòu)建環(huán)狀RNA。將欲環(huán)化的外顯子置于可配對的內(nèi)含子之間，通過索尾插接模式形成環(huán)狀RNA。
環(huán)狀RNA呈閉合環(huán)狀，沒有5'和3'端，核酸外切酶無法將其降解，因此，比多數(shù)線性RNA穩(wěn)定。環(huán)狀RNA位于細胞內(nèi)，數(shù)量大，序列高度保守，具有組織、時間和疾病特異性，容易出膜進入體液，因此，具有作為疾病診斷標志物的潛質(zhì)。
二、環(huán)狀RNA的功能
環(huán)狀RNA由外顯子構(gòu)成，但不編碼蛋白質(zhì)，絕大多數(shù)功能未知。研究發(fā)現(xiàn)某些環(huán)狀RNA參與調(diào)節(jié)重要基因表達，絕非可有可無。
1．作為microRNA的分子海綿，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[8]：microRNA是一類長度21～23nt的小非編碼RNA，與mRNA進行堿基互補配對，抑制其翻譯，還可引起靶mRNA降解。有些環(huán)狀RNA具有microRNA應(yīng)答元件，能夠結(jié)合(吸附)游離microRNA，從而阻斷microRNA對基因表達的抑制。如小腦變性相關(guān)蛋白反義轉(zhuǎn)錄物(CDR1as)具有70個microRNA-7的microRNA應(yīng)答元件[9]，能大量結(jié)合microRNA-7[10]，從而使microRNA-7的靶基因表達水平上調(diào)；另一個例子是Y染色體性別決定區(qū)(SRY)序列[11]，它在睪丸組織中高表達，是microRNA-138的分子海綿。
2．與RNA以及RNA結(jié)合蛋白結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合體[12]：這種復(fù)合體能夠調(diào)控RNA以及RNA結(jié)合蛋白之間的相互作用，如基因的線性轉(zhuǎn)錄過程[13]。
3．天然的環(huán)狀RNA不能和核糖體結(jié)合，也不能翻譯蛋白質(zhì)，但具有翻譯的起始密碼子，一種人工合成的含有核糖體進入位點(IRES)的環(huán)狀RNA在體外實驗中能夠翻譯蛋白[14]。
4．運輸microRNA：CDR1as作為分子海綿吸附大量microRNA-7，在特定的時機下CDR1as被microRNA-671降解，而釋放大量的microRNA-7，相當(dāng)于起到microRNA-7轉(zhuǎn)運載體的作用[15]。
三、環(huán)狀RNA的篩選和驗證
由于環(huán)狀RNA沒有3'poly(A)尾巴，傳統(tǒng)RNA測序無法發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA。研究人員通過梳理大量的RNA測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA[9,13,16,17]，在測序結(jié)果中尋找兩個重排外顯子之間的結(jié)點，來識別可能存在的環(huán)狀RNA。
目前有根據(jù)環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫開發(fā)的商業(yè)化環(huán)狀RNA芯片，原理如下：(1)從組織液(如血清)或組織勻漿中提取總RNA；(2)加入RNA酶去除線性RNA；(3)加入隨機引物，利用與熒光染料CY3相連的隨機引物標記環(huán)狀RNA：芯片上特異性的探針識別環(huán)狀RNA外顯子5'和3'相連的結(jié)點，若樣品中存在環(huán)狀RNA，則芯片在紫外線的激發(fā)下出現(xiàn)熒光。靶基因預(yù)測軟件可提供與環(huán)狀RNA對應(yīng)的線性mRNA信息以及可能的MRE，便于下一步的生物學(xué)驗證工作。
四、環(huán)狀RNA與心血管疾病的關(guān)系
對環(huán)狀RNA與心血管疾病聯(lián)系的了解是從INK4/ARF基因簇反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus, ANRIL)，又名細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2B反義序列(CDKN2B-AS)開始的。ANRIL是一條由19個外顯子組成的長鏈非編碼RNA，其編碼基因位于第9染色體短臂(9p21.3)，與INK4/ARF基因座相鄰。它在基因組中的長度為126.3kb，轉(zhuǎn)錄時與蛋白編碼方向相反，轉(zhuǎn)錄后剪切產(chǎn)物為3 834 bp。
ANRIL與多梳蛋白復(fù)合物(polycomb repressive complex, PRC)1中的色素框7蛋白以及PRC2中的SUZ12多梳蛋白結(jié)合，輔助PCR1和PCR2定位于染色體p16INK4a、p14ARF和p15INK4b，通過乙?；M蛋白H3第27位賴氨酸(H3K27Me3)，引起這幾個基因靜默[18,19]。p16、p14和p15抑癌基因的蛋白產(chǎn)物包括：p16蛋白，又稱為細胞周期蛋白依賴性激酶4抑制因子A(CDKN2A)或多能性腫瘤抑制因子1(MTS-1)；p14蛋白，又稱為CDKN2A讀碼框移蛋白(ARF); p15蛋白，又稱為細胞周期蛋白依賴性激酶4抑制因子B(CDKN2B)或多能性腫瘤抑制因子2(MTS-2)。這些蛋白產(chǎn)物可抑制細胞的生長和增殖，因此對于心血管疾病的調(diào)控具有重要作用。ANRIL可造成以上抑癌基因的靜默，將會引起以下心血管疾病[20,21]：(1)損傷后血管內(nèi)膜增生。這是p16靜默導(dǎo)致的后果，是血管旁路轉(zhuǎn)流術(shù)后形成血栓堵塞、冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄及血栓形成的常見原因。該基因也參與骨髓造血干細胞增殖的調(diào)控。(2)動脈硬化性心血管疾病。p16和p15可通過抑制TGF-β阻止動脈粥樣硬化的發(fā)生，其靜默后易于形成動脈硬化斑塊。p14靜默后，也易于形成動脈硬化斑塊，其信號通路有待進一步研究。
ANRIL可引發(fā)多種疾病，包括上述心血管病變以及糖尿病和多種腫瘤。對于心血管疾病而言，9p21.3區(qū)域的ANRIL是獨立的高危因素，不受高血壓、吸煙、肥胖或血脂異常等其他因素的影響，因此具有重要的研究價值。若其發(fā)生單核苷酸多態(tài)性位點改變，將改變其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，且影響相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。
ANRIL具有19個外顯子，研究者發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄中存在'外顯子跳讀'現(xiàn)象，TaqMan和RNA-seq測序發(fā)現(xiàn)，部分研究對象轉(zhuǎn)錄本中央第4～12外顯子缺失(這兩種測序方式均以RNA尾端開始，因此只檢出線性RNA)。隨后發(fā)現(xiàn)，第4～12外顯子形成不含poly(A)尾端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對RNA酶穩(wěn)定[22]。有趣的是，心血管疾病低風(fēng)險人群的ANRIL往往被剪切成兩段，1個環(huán)狀A(yù)NRIL和1條短的線性RNA。心血管疾病高風(fēng)險人群的ANRIL通常是長鏈狀態(tài)，不存在cANRIL。研究者推測長鏈ANRIL容易引起抑癌基因p14、p15和p16靜默，而環(huán)狀A(yù)NRIL則不容易引起其靜默，它的存在有減少罹患心血管疾病的可能性。目前對環(huán)狀A(yù)NRIL的生物學(xué)功能尚不清楚，或許它作為microRNA海綿削弱了對靶基因的抑制，或者通過其他途徑(與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，或直接作用于mRNA等)發(fā)揮作用。即使環(huán)狀A(yù)NRIL不具有特定的生物學(xué)功能，由于其環(huán)狀結(jié)構(gòu)可使RNA酶穩(wěn)定，加上容易出膜進入體液，具有很好的作為疾病診斷標志物的潛力。
五、展望
環(huán)狀RNA在心血管疾病發(fā)病過程中有重要作用。由于環(huán)狀RNA具有極大的多樣性[13]，有理由推測還有更多的環(huán)狀RNA參與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。目前環(huán)狀RNA在心血管疾病中的研究還剛起步，國內(nèi)外尚未見心血管疾病特征性環(huán)狀RNA譜的研究。利用新發(fā)展的芯片技術(shù)篩選可能的致病相關(guān)環(huán)狀RNA，在細胞或動物實驗通過調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平，深入了解其在疾病發(fā)生和發(fā)展中起到的作用及機制，對于心血管疾病的診斷和治療可能具有重要的價值。
參考文獻（略）
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