論文標(biāo)題：Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression.
本篇文章發(fā)表在HEPATOLOGY上，該期刊是美國肝病學(xué)會（AASLD）會刊，肝病領(lǐng)域頂級期刊，目前影響因子13.246。HEPATOLOGY屬于臨床雜志，所以上面發(fā)表的論文側(cè)重于臨床轉(zhuǎn)化，該刊可能更加看重研究內(nèi)容對肝膽醫(yī)學(xué)的意義，也就是兼顧創(chuàng)新及應(yīng)用，而對于機制挖掘沒有傳統(tǒng)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)刊物要求那么高，總體來說，該雜志需要一定的創(chuàng)新性及較完整研究證據(jù)鏈，和一定的轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛能。
研究背景
環(huán)狀RNA（circRNA）代表一類新的內(nèi)源性非編碼RNA，可調(diào)節(jié)哺乳動物的基因表達(dá)。不同于用5'末端和3'末端終止的線性RNA，circRNAs是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子。circRNA是保守和穩(wěn)定的，并且許多circRNA似乎在細(xì)胞類型或發(fā)育階段被特異性表達(dá)。細(xì)胞類型或發(fā)育階段特異性表達(dá)模式表明，circRNA可能在許多生理和病理生理過程中起重要作用。天然內(nèi)源性circRNA本身對外切核糖核酸酶衰變具有抗性，并含有選擇性保守的微小RNA（miRNA）靶位點。因此，circRNA可以作為有效的miRNA海綿（miRNAsponge），與miRNA相互作用來調(diào)控基因表達(dá)。幾乎每個生物過程都對miRNA的調(diào)節(jié)異常和功能進(jìn)行了廣泛的研究，然而，新鑒定的circRNA在特定生物活性中的表達(dá)譜和功能仍需進(jìn)一步研究。
目前，已經(jīng)證實circRNA參與發(fā)育過程、細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)、心臟病的發(fā)病機理和神經(jīng)變性疾病，如阿爾茨海默病的發(fā)展。在癌癥發(fā)生和發(fā)展的研究中，就像miRNA廣泛參與癌癥一樣，腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的表達(dá)譜和circRNA在癌癥發(fā)生和發(fā)展中的作用引起了廣泛的關(guān)注。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些種類的circRNA在胃癌、結(jié)腸直腸癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中顯著失調(diào)，這些失調(diào)的circRNA被認(rèn)為參與癌癥發(fā)展。這些研究結(jié)果表明，circRNA可能是一種新的潛在生物標(biāo)記和癌癥治療靶點。然而，在癌癥研究中，闡明失調(diào)的circRNA和識別其功能仍然是一個持續(xù)的進(jìn)程。
肝細(xì)胞癌（HCC）是廣泛的癌癥相關(guān)死亡世界的主要原因之一，特別是在中國。只有30％?40％的HCC患者適用于治愈性切除術(shù)，部分原因是癥狀晚期出現(xiàn)，并且由于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高，這些HCC患者的預(yù)后仍然很差。這些挑戰(zhàn)導(dǎo)致迫切需要識別預(yù)后預(yù)測的潛在生物標(biāo)志物，并找到新的目標(biāo)來設(shè)計更有效的治療方法。在過去十年中，許多非編碼RNA（包括miRNA）和長非編碼RNA已被發(fā)現(xiàn)在HCC患者中表達(dá)失調(diào)，這些在臨床中具有潛在的應(yīng)用價值。然而，HCC中circRNA的表達(dá)譜、功能和失調(diào)仍有待確定。
在本文中，先通過分析HCC組織中circRNA的表達(dá)譜，確定了HCC組織中的circRNAcircMTO1（hsa_circRNA_0007874/ hsa_circRNA_104135）顯著下調(diào)，并且與HCC患者的預(yù)后密切相關(guān)。通過研究發(fā)現(xiàn)circMTO1可能作為致癌miR-9的海綿起到上調(diào)p21表達(dá)的作用，從而抑制HCC的發(fā)展。因此，circMTO1的減少可以作為預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物，并可作為HCC患者潛在的治療靶點。
實驗及結(jié)果
1、HCC腫瘤組織中失調(diào)的circRNA和下調(diào)的circMTO1
利用circRNA芯片分析HCC組織（7個樣本）和匹配的非腫瘤肝臟組織（7個樣本）樣本中上調(diào)和下調(diào)的基因，根據(jù)在組織中的表達(dá)豐度排序，選擇10個上調(diào)和10個下調(diào)最多的基因（如上兩張圖）。
接下來在21個病人的樣本中驗證以上選定的circRNA的表達(dá)。其中作者只給出了其中6個結(jié)果（如上圖）。在給出的6個結(jié)果圖中發(fā)現(xiàn)只有circMTO1在HCC腫瘤組織中與芯片結(jié)果一致，且顯著降低。（注：作者發(fā)現(xiàn)，雖然一些circRNA，包括circARID1B，circFAM13B和circFARP2在HCC組織中降低，但初步結(jié)果表明，這些circRNA的沉默對HCC細(xì)胞生長沒有顯著影響（數(shù)據(jù)未顯示），只有沉默circMTO1對促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖具有重要作用。）
為了進(jìn)一步的驗證circMTO1的表達(dá)下降，作者又選用了另外261個病人的組織樣品進(jìn)行驗證，如下圖，結(jié)果顯示，與匹配的非腫瘤組織相比，circMTO1表達(dá)在87.4％的（261例中的228例）HCC組織中明顯降低。
以上結(jié)果顯示，HCC組織中circMTO1降低的百分比高，引起作者重視circMTO1在HCC發(fā)展中的生物學(xué)意義。
第一部分結(jié)束：為了檢測在HCC腫瘤組織中circRNA的表達(dá)情況，作者首先用circRNA芯片檢測了腫瘤組織與正常組織中的circRNA的表達(dá)情況，篩選出10個表達(dá)升高和降低幅度最大的。在另外的6對組織中驗證表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有circMTO1在HCC中HCC腫瘤組織中一致和顯著降低。大樣本的驗證進(jìn)一步證實circMTO1表達(dá)顯著降低。
第一部分可以總結(jié)為篩選目的circRNA。
2、circMTO1表達(dá)降低與HCC患者的不良預(yù)后有明顯的相關(guān)性
結(jié)合臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，取116名HCC病人的樣品，經(jīng)過原位雜交分析顯示，與匹配的非腫瘤組織相比，circMTO1表達(dá)在HCC組織中也顯著降低。
另外，HCC組織中circMTO1的表達(dá)減少與HCC患者的預(yù)后差異顯著相關(guān)，如以circMTO1表達(dá)中值作為臨界值的Kaplan-Meier存活曲線所示，相對于circMTO1表達(dá)高的病人，circMTO1表達(dá)低的病人存活率顯著降低。
此外，作者還使用R軟件中的K自適應(yīng)分區(qū)統(tǒng)計（kaps）算法來計算circMTO1表達(dá)（76.89）的最有效的臨界值，這可以最顯著地區(qū)分這些HCC患者的結(jié)果。
以上數(shù)據(jù)表明，circMTO1在HCC中的表達(dá)降低與患者預(yù)后不良有關(guān)，circMTO1表達(dá)值為76.89可能有助于HCC患者的預(yù)后預(yù)測。
第二部分結(jié)束：作者使用臨床樣品進(jìn)行檢測，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)HCC中的circMTO1表達(dá)降低與患者預(yù)后不良相關(guān)。
第二部分可以總結(jié)為結(jié)合臨床數(shù)據(jù)驗證目的基因與患者預(yù)后的相關(guān)性。
3、在HCC細(xì)胞中circMTO1與miR-9相結(jié)合。
目前的研究表明，circRNAs主要作為miRNA海綿結(jié)合功能性miRNA，然后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，接下來，通過生信分析篩選出與circMTO1相關(guān)的潛在miRNA。
通過miRandaProgram預(yù)測，99個miRNA被預(yù)測并列為circMTO1的可能靶標(biāo)。以上為預(yù)測的相關(guān)miRNA。
為了捕獲可能與HCC細(xì)胞中的circMTO1相互作用的功能性miRNA，使用circMTO1特異性探針進(jìn)行體內(nèi)沉淀（RIP），以鑒定與靶circRNA實際結(jié)合的miRNA。通過circMTO1特異性探針純化了與circMTO1相關(guān)的RNA，然后篩選了之前由miRandaProgram預(yù)測的潛在miRNA。
根據(jù)預(yù)測出99個相關(guān)miRNA，目標(biāo)主要著重于表達(dá)和功能與HCC有關(guān)的miRNA，主要篩選和分析了20種miRNA。通過RIPcircMTO1下拉實驗，純化circMTO1相關(guān)的RNA，并分析復(fù)合物中的20個候選miRNA。與對照相比，發(fā)現(xiàn)circMTO1只和miR-9特異性富集。而其他miRNA沒有富集。
通過FISH分析在HCC腫瘤和匹配的非腫瘤組織中，發(fā)現(xiàn)circMTO1與細(xì)胞質(zhì)中的miR-9共定位，與匹配的非腫瘤組織相比，這種共定位在腫瘤中降低。
這些結(jié)果表明circMTO1可以結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的miR-9。
第三部分結(jié)束：在該部分中，作者為了確定與circMTO1相結(jié)合的miRNA，先使用生信分析，進(jìn)行大致篩選，然后在根據(jù)篩選得出的miRNA的功能進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，接下來進(jìn)行RIP實驗，確定了與circMTO1相結(jié)合的miRNA。最后通過FISH實驗，驗證并發(fā)現(xiàn)circMTO1與細(xì)胞質(zhì)中的miR-9共定位。
第三部分可以總結(jié)為通過生信分析篩選與靶circRNA相結(jié)合的miRNA，RIP進(jìn)一步篩選，FISH進(jìn)行驗證。
4、circMTO1抑制HCC細(xì)胞增殖和侵襲
接下來，作者研究了circMTO1在HCC發(fā)展中的作用。
為了選擇用于circMTO1沉默或過表達(dá)的HCC細(xì)胞系，檢測8個HCC細(xì)胞系中circMTO1和miR-9的表達(dá)。 SK-Hep1細(xì)胞circMTO1表達(dá)最低、miR-9表達(dá)最高，QGY-7701細(xì)胞中這兩種RNA表達(dá)量中等，HepG2和SMMC-7721細(xì)胞circMTO1表達(dá)較高、miR-9表達(dá)較低。
構(gòu)建siRNA，覆蓋circMTO1的反向剪接區(qū)域以進(jìn)行沉默。用circMTO1siRNA轉(zhuǎn)染到HepG2和SMMC-7721HCC細(xì)胞后，通過qPCR測定和確定circMTO1沉默的效率。
circMTO1亞型2（has_circRNA_0132266）和MTO1mRNA的表達(dá)在circMTO1siRNA轉(zhuǎn)染后沒有顯著變化，證實了circMTO1沉默的特異性。
此外，再構(gòu)建帶有環(huán)狀框架和circMTO1序列的circMTO1過表達(dá)質(zhì)粒（pCD-circMTO1），發(fā)現(xiàn)在QGY-7701和SK-Hep1HCC細(xì)胞中circMTO1可以顯著過度表達(dá)。
circMTO1的沉默在HCC細(xì)胞中進(jìn)行以確定其對HCC進(jìn)展的影響并且研究其與miR-9的相互作用。通過在HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中過表達(dá)miR-9（上圖A），發(fā)現(xiàn)，circMTO1沉默顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（上圖B），增強細(xì)胞侵襲能力（上圖C），減少HepG2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡（上圖D），circMTO1過表達(dá)促進(jìn)QGY-7701和SK-Hep1細(xì)胞凋亡（上圖D）。此外，miR-9過表達(dá)影響了circMTO1在HepG2和SMMC-7721中沉默的促腫瘤效應(yīng)（上圖B-D）。
為了驗證circMOT1的miRNA海綿功能，檢測了miR-9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circMTO1對miR-9的表達(dá)水平?jīng)]有影響。
這些結(jié)果表明circMTO1抑制HCC發(fā)展可能是海綿活性減少miR-9的致癌作用。
第四部分結(jié)束，在該部分中，作者先確定合適的細(xì)胞系，構(gòu)建了相應(yīng)的knockdwn和overexpress細(xì)胞，通過qPCR和westernblot驗證。再此基礎(chǔ)上，研究circMTO1對HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡的影響，同時也檢測miR-9的變化，最終得出結(jié)論：circMTO1抑制HCC發(fā)展可能是海綿活性減少miR-9的致癌作用。
第四部分可以總結(jié)為，knockdwn和overexpress目的基因，檢測該基因?qū)?xì)胞的影響以及潛在機制，即，對目的基因的作用機制提出猜測。
5、circMTO1通過對miR-9的海綿活性和p21的上調(diào)抑制HCC生長
為了研究circMTO1是否通過對miR-9的海綿活性發(fā)揮其抗腫瘤效果，首先，檢測miR-9的靶標(biāo)抑癌蛋白p21的表達(dá)。
如上圖，circMTO1的沉默或miR-9mimic的轉(zhuǎn)染均顯著降低了HCC細(xì)胞中p21的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。此外，circMTO1的過表達(dá)可以增加QGY-7701和SK-Hep1肝癌細(xì)胞中p21的mRNA和蛋白表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，circMTO1可能通過保護p21免受miR-9的下調(diào)來發(fā)揮其抗腫瘤作用。
為了在功能上確認(rèn)circMTO1通過對miR-9的海綿活性抑制HCC發(fā)展并因此上調(diào)p21，使用miR-9抑制劑來檢測circMTO1沉默的腫瘤促進(jìn)作用是否可以被miR-9敲低所阻斷。如上圖所示，miR-9抑制劑可顯著降低circMTO1沉默后p21mRNA和蛋白表達(dá)的下調(diào)。
miR-9抑制劑顯著阻斷了circMTO1沉默介導(dǎo)的促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖和抑制凋亡的作用。因此，miR-9抑制劑可以阻斷circMTO1沉默的HCC促進(jìn)作用。
這些數(shù)據(jù)證明circMTO1作為miR-9海綿通過circMTO1/ miR-9 / p21軸抑制HCC發(fā)展以消除miR-9致癌作用。
第五部分結(jié)束，該部分作者首先沉默circMTO1和過表達(dá)miR-9（miR-9mimic）所得到結(jié)果均一致；接著，過表達(dá)circMTO1，所得到的結(jié)果與沉默circMTO1結(jié)果相反；然后，使用miR-9抑制劑（miR-9inhibitor）處理沉默過circMTO1的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-9抑制劑的處理可以使沉默circMTO1的效果逆轉(zhuǎn)；在后續(xù)的對增殖以及凋亡的實驗中結(jié)果與前面實驗一致。
第五部分可以總結(jié)為對目的基因作用機制的驗證。
6、circMTO1的腫瘤內(nèi)敲除增強了體內(nèi)HCC的生長
最后一部分，進(jìn)行活體實驗。
對小鼠進(jìn)行連續(xù)瘤內(nèi)注射膽固醇結(jié)合的circMTO1siRNA兩周后，發(fā)現(xiàn)攜帶HCC的SMMC-LTNM小鼠的腫瘤生長顯著加速并且血清AFP顯著增加。
瘤內(nèi)注射膽固醇結(jié)合的circMTO1siRNA 48小時后，SMMC-LTNM小鼠的腫瘤組織中circMTO1和p21的表達(dá)顯著降低。
此外，p21和下游CDK2表達(dá)被體內(nèi)circMTO1敲低抑制，而細(xì)胞侵襲和增殖標(biāo)記MMP2和PCNA上調(diào)。
因此，這些結(jié)果表明circMTO1可抑制體內(nèi)HCC發(fā)展。
第六部分，該部分為活體實驗，對小鼠進(jìn)行連續(xù)瘤內(nèi)注射膽固醇結(jié)合的circMTO1siRNA，實驗結(jié)果與體外實驗相一致。
第六部分可以總結(jié)為活體實驗驗證。
結(jié)論
本文首先確定研究方向為HCC中的circRNA，HCC病人樣本表達(dá)譜分析結(jié)果表明，HCC病人中circMTO1顯著下調(diào)，結(jié)合病例分析得出結(jié)論：circMTO1表達(dá)降低與HCC患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)。接下來RIP篩選出circMTO1與miR-9相結(jié)合發(fā)揮miRNA海綿（miRNAsponge）的作用，從而抑制miR-9，使miR-9不能對其目的基因p21進(jìn)行負(fù)調(diào)控。活體瘤內(nèi)給藥knockdowncircMTO1可使HCC發(fā)展加速，與體外實驗以及臨床數(shù)據(jù)結(jié)果一致。
總的來說，circRNAMTO1作為miR-9的海綿，抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)展
本文思路總結(jié)：
結(jié)合臨床樣本確定目的基因，目的基因與病的相關(guān)性，篩選與目的基因相互作用的基因（或蛋白），進(jìn)一步篩選與目的基因相互作用的基因（或蛋白）調(diào)控的基因（或蛋白），體外實驗進(jìn)一步驗證。
參考來源：Han D, Li J, Wang H, et al. Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression.[J]. Hepatology, 2017, 66(4):1151.
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