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原名：Nuclear genome–wide associations with mitochondrial heteroplasmy

譯名：線粒體異質(zhì)性的核全基因組關(guān)聯(lián)分析

期刊：Science Advances

IF：14.136

發(fā)表時(shí)間：2021年3月

通訊作者：David Hinds；Neal Sondheimer

通訊作者單位：23andMe基因檢測(cè)公司；多倫多大學(xué)兒科學(xué)與分子遺傳學(xué)院

DOI號(hào)：10.1126/sciadv.abe7520

1 數(shù)據(jù)集和分析策略

研究使用的全基因組基因分型數(shù)據(jù)來(lái)自982,072名歐洲血統(tǒng)個(gè)體的唾液樣本，這些個(gè)體是個(gè)人基因組學(xué)和生物技術(shù)公司—23andMe公司研究項(xiàng)目的參與者。MtDNA基因分型密集，檢測(cè)出3287個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）。應(yīng)用質(zhì)量控制（QC）檢測(cè)，去除由于缺乏雜交或等位基因不準(zhǔn)確區(qū)分而導(dǎo)致基因分型不佳的檢測(cè)，最終評(píng)估出326個(gè)mtDNA SNP（附圖1）。用較小等位基因強(qiáng)度與該位置總強(qiáng)度的比值作為MtHz值，因此可能的最大異質(zhì)性值為0.5。研究使用母體-后代組合來(lái)檢測(cè)母體異質(zhì)性值>5%的成對(duì)點(diǎn)（附圖S1；n=28,963對(duì)）。正如對(duì)于所遺傳的異質(zhì)性所預(yù)期的那樣，母體-后代值存在相關(guān)性。

表1|按平均MtHz四分位數(shù)劃分的受試者性別和年齡群體表征。

圖1|在23andMe v4陣列上評(píng)估線粒體SNP。該陣列包括整個(gè)線粒體基因組的3287個(gè)位置。這些位置經(jīng)過(guò)修剪以保持雙等位基因變異，在整個(gè)測(cè)試群體中檢出率> 99%，次要等位基因頻率（MAF）>0.001。若個(gè)體參與者在單個(gè)SNP的檢出強(qiáng)度（LRR、log₂ R比）比該位置所有個(gè)體的平均強(qiáng)度低>3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（SD），將該檢出移除。如果一個(gè)位置有>1%的樣本達(dá)不到這些標(biāo)準(zhǔn)，則在所有個(gè)體中都將該位置移除。（A）在兩個(gè)同質(zhì)簇之間的異質(zhì)樣本和少量強(qiáng)度低于平均值（最低線）3個(gè)SD（個(gè)體檢出已排除）的樣本的性能良好分析。（A）（綠色）和（B）（紅色）等位基因檢測(cè)均顯示SD線。那些鑒定出差同質(zhì)簇的過(guò)度異質(zhì)性的檢測(cè)已被移除。（B）性能不佳的檢測(cè)，該檢測(cè)中數(shù)據(jù)集中>10%個(gè)體的MtHz >20% [B等位基因頻率（BAF）值，0.2到0.8]。所有個(gè)體關(guān)于此位置的數(shù)據(jù)都從分析中移除。

MtHz廣泛存在，所有被檢測(cè)位置都存在>25% MtHz的個(gè)體（附圖2A）。由于本研究的方法沒(méi)有對(duì)線粒體中所有位置進(jìn)行預(yù)估，因此將每個(gè)個(gè)體的MtHz進(jìn)行定量，作為檢測(cè)的326個(gè)位置的平均值。所評(píng)估的所有個(gè)體的平均MtHz為0.00744（四分位距=0.0046至0.012；附圖2B）。值得注意的是，平均異質(zhì)性值不是由線粒體位置的子集驅(qū)動(dòng)的，因?yàn)槊總€(gè)位置的個(gè)體間平均異質(zhì)性是緊密分布的（附圖2C）。

圖2|MtHz數(shù)據(jù)定量。（A）MtHz按群體中每個(gè)線粒體位置評(píng)估的百分位數(shù)繪制。每個(gè)位置處均觀察到高度異質(zhì)性個(gè)體。（B）數(shù)據(jù)集中個(gè)體的平均線粒體異質(zhì)性，在評(píng)估位置上取平均值。（C）QC子集中檢測(cè)出的326個(gè)線粒體位置的平均MtHz值分布。（D）平均MtHz的自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，異常值去除率為99.5%。

2 年齡、性別和線粒體單倍群對(duì)MtHz的影響

為檢測(cè)遺傳和非遺傳因素對(duì)平均MtHz的影響，研究者計(jì)算了自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的平均MtHz值，在99.5%處進(jìn)行縮尾處理，以消除異常值的影響（附圖2D）。建立初始模型以計(jì)算對(duì)平均MtHz的影響（表2）。純合常染色體SNP等位基因強(qiáng)度方差（“常染色體方差”）與MtHz呈強(qiáng)正相關(guān)。這是預(yù)料之中的，因?yàn)樵诩兒衔恢镁哂懈叱Ｈ旧w方差的樣本可能具有表明樣本噪點(diǎn)更大的技術(shù)特征。這種噪點(diǎn)使MtHz被高估，在全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）中使用常染色體方差可校正樣本質(zhì)量的微小差異。

每個(gè)群體至少有10,000個(gè)個(gè)體，針對(duì)存在于所有群體中的19個(gè)最常見(jiàn)單倍群（即總?cè)后w的約1%），評(píng)估線粒體單倍群的影響（表2）。不同單倍群之間的平均MtHz不同。H1是數(shù)據(jù)集中最常見(jiàn)的單倍群（n=203,003；20.7%）。盡管許多單倍群對(duì)MtHz的影響是顯著的，但MtHz差異的幅度很小，具有T1單倍群的個(gè)體（n=21,921；2.2%）的平均MtHz僅比H1個(gè)體大0.0010（在空模型中，P=1.1×10^?248）。群體中的平均MtHz隨年齡增加而顯著下降。此外，女性的平均MtHz顯著低于男性。將年齡和性別作為協(xié)變量包含在GWAS模型中。

3消除線粒體假基因

對(duì)平均MtHz進(jìn)行GWAS。初始時(shí)，在調(diào)整基因組膨脹因子λ=1.077后，37個(gè)基因座達(dá)到了全基因組顯著性，P<5×10^?8（附圖3和附圖S2）。然而，核mtDNA片段（NUMTs）的存在是重要的潛在混雜因素。NUMTs包括已逆轉(zhuǎn)錄到核基因組中的mtDNA的部分的、片段的、復(fù)合的或完整的拷貝。如果NUMT序列包含與個(gè)體真實(shí)mtDNA序列不同的等位基因，那么表面線粒體探針與來(lái)自NUMTs的核DNA的直接雜交將造成MtHz被高估。因此，NUMT有可能在處于連鎖不平衡（LD）的SNP處產(chǎn)生假陽(yáng)性GWAS信號(hào)。

圖3|平均MtHz初始關(guān)聯(lián)的曼哈頓圖。

例如rs1951197（AKAP6附近）所示，它與對(duì)數(shù)平均MtHz相關(guān)聯(lián)。該位置與NUMT474重疊，后者在歐洲人中呈現(xiàn)多態(tài)性（esv3633987）（附圖S3）。NUMT474與修訂的劍橋參考序列（rCRS）mtDNA（NC_012920.1）的第5583至6606位有93%一致。從MtHz的定量中去除mt.5583和mt.6606之間的任何位置后，通過(guò)重復(fù)分析來(lái)測(cè)試rs1951197關(guān)聯(lián)的有效性（表S1）。正如預(yù)期的那樣，rs1951197和平均MtHz之間的關(guān)聯(lián)不再顯著。使用類似方法，本研究還消除了rs7728823（與NUMT228重疊）和rs571982832（比對(duì)至最近鑒定出的復(fù)合物NUMT）的關(guān)聯(lián)。

因?yàn)椴⒎撬?/span>NUMT都是已知的或精確定位的，研究者試圖確定其他由未知NUMT驅(qū)動(dòng)的明顯關(guān)聯(lián)的基因座。將線粒體位置分為三組后，分別估算平均MtHz。如果NUMT驅(qū)動(dòng)了偽關(guān)聯(lián)，則推斷在核位置與這些線粒體位置子集的關(guān)聯(lián)上將顯示出顯著差異。當(dāng)異質(zhì)性分析基于子區(qū)域時(shí)，當(dāng)關(guān)聯(lián)降低至全基因組顯著性以下時(shí)，將SNP從后續(xù)分析中移除。這鑒定出四個(gè)另外的基因座，它們的關(guān)聯(lián)具有很強(qiáng)的區(qū)域依賴性（表S1），也將這些基因座從隨后的分析中移除。

4 全基因組關(guān)聯(lián)鑒定與MtHz關(guān)聯(lián)的基因座

在排除NUMT依賴性位置后，30個(gè)基因座最初有至少一個(gè)具有全基因組顯著性的位置。在其中的10個(gè)基因座上，只有一個(gè)單獨(dú)推定的SNP超過(guò)全基因組顯著性，為了避免估算出支持不足的關(guān)聯(lián)，從后續(xù)分析中將這10個(gè)基因座移除，于是得到最后與平均MtHz相關(guān)的20個(gè)基因座（表3和附圖S4）。從陣列估算，MtHz觀測(cè)尺度遺傳力為0.65%（SE=0.1%，平均χ²=1.1914，截距=1.032）。20個(gè)基因座占觀察遺傳力的32%（表S2）。通過(guò)在模型中包含單倍群的情況下重新檢測(cè)峰值關(guān)聯(lián)，確認(rèn)了這些關(guān)聯(lián)不依賴于單倍群（表S3）。

表3|與平均MtHz關(guān)聯(lián)的基因座。

在這些候選基因中，三個(gè)基因座臨近四個(gè)具有明確線粒體功能和已發(fā)表的線粒體定位的基因（TFAM、TWNK、MRPL43和NDUFS4）。在rs1049432處發(fā)現(xiàn)了最強(qiáng)的關(guān)聯(lián)（P=1.7×10^?223），rs1049432鄰近線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）。TFAM是個(gè)有意思的候選基因，它與mtDNA有許多相互作用。TFAM最初被定性為線粒體轉(zhuǎn)錄因子，但隨著時(shí)間的推移，TFAM在mtDNA的維持和包裝中的多種作用被發(fā)現(xiàn)。先前的組織特異性表達(dá)數(shù)量性狀基因座分析表明，rs1049432處的T等位基因（與升高的MtHz關(guān)聯(lián)）與較低的TFAM表達(dá)顯著關(guān)聯(lián)（附圖4和附圖S5）。rs1049432是非編碼的，與rs1937（p.Ser12Thr）（r²=0.44）關(guān)聯(lián)，后者是TFAM中最常見(jiàn)的編碼SNP（MAF=0.08）。

先前的研究表明，rs11006126在兩項(xiàng)研究中與唾液和血液樣本中的mtDNA拷貝數(shù)關(guān)聯(lián)，rs11006126與在rs1049432處鑒定出的TFAM峰值接近且處于強(qiáng)LD，并包含在可信集合（rs11006126）中。研究者對(duì)mtDNA拷貝數(shù)的改變是否可能混淆在MtHz上的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行檢測(cè)。使用來(lái)自基因分型陣列的強(qiáng)度數(shù)據(jù)對(duì)相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)表型進(jìn)行定量。重新檢測(cè)MtHz空模型以及平均MtHz與來(lái)自GWAS的候選基因座之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)所鑒定的關(guān)聯(lián)與mtDNA拷貝數(shù)無(wú)關(guān)（表S4和表S5）。

除了TFAM，其他鄰近相關(guān)SNP的基因有可能基于其已知的細(xì)胞活動(dòng)影響MtHz。這包括靠近C10orf42的rs58678340，它編碼線粒體解旋酶Twinkle（TWNK）和線粒體核糖體蛋白MRPL43。值得注意的是，該SNP與TWNK編碼變異rs17113613處于強(qiáng)LD中（r²=0.84；p.Val368Ile）。TWNK是mtDNA復(fù)制機(jī)制的一部分，遺傳缺陷會(huì)導(dǎo)致mtDNA耗竭或缺失綜合征。TWNK可防止出現(xiàn)mtDNA變異，這暗示了TWNK活性變化與MtHz相關(guān)聯(lián)的潛在機(jī)制。

MtHz也與rs10063311相關(guān)，rs10063311鄰近NDUFS4，NDUFS4是電子傳輸鏈復(fù)合體I的亞基。盡管電子傳遞鏈的運(yùn)行與mtDNA的完整性之間不存在明確的聯(lián)系，但之前的研究已經(jīng)表明復(fù)合物V亞基缺失會(huì)影響mtDNA的數(shù)量。

除此之外，盡管CLEC16A和PRKAB1編碼的蛋白質(zhì)不存在線粒體定位，但是它們與mtDNA復(fù)制的保真度和穩(wěn)定性具有潛在的功能聯(lián)系。從1型糖尿病的GWAS中鑒定出的CLEC16A，通過(guò)與NDRP1和PARKIN的相互作用調(diào)節(jié)線粒體自噬。PRKAB1編碼一磷酸腺苷活化蛋白激酶的亞基，該亞基與促進(jìn)線粒體內(nèi)生物發(fā)生和能量產(chǎn)生的一系列途徑有關(guān)。這表明對(duì)線粒體QC很重要的細(xì)胞質(zhì)和核過(guò)程在MtHz的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

幾個(gè)在免疫中起作用的基因（包括HLA-DQB1、IL1RN、IFNL4和FUT2）位于與MtHz關(guān)聯(lián)的SNP的近端。免疫系統(tǒng)功能的變化可能對(duì)MtHz有直接影響，但這些變異也有可能影響DNA樣本中細(xì)胞類型之間的比例。需要對(duì)其他樣本類型進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)以確認(rèn)這種關(guān)聯(lián)。

5 基于通路和基因的分析

使用基因集分析（MAGMA [v1.07]）對(duì)GWAS結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，鑒定出尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的基因本體生物學(xué)途徑富含關(guān)聯(lián)（P=6.7×10^?7），在對(duì)15,484條通路進(jìn)行Bonferroni校正后，這種關(guān)聯(lián)仍然顯著。該基因集中有五個(gè)基因（SLC22A13、SLC2A9、SLC17A1、SLC17A3和SLC22A12），但沒(méi)有一個(gè)基因位于符合GWAS顯著性的基因座中。SLC17A1和SLC17A3的基于基因的結(jié)果均符合顯著性標(biāo)準(zhǔn)（分別為P=4.1×10^?11和8.4×10^?9）并且在基因組中是相鄰的，而該基因集的其他三個(gè)成員沒(méi)有在對(duì)多個(gè)基因的校正中存在，表明信號(hào)可能由單個(gè)基因座驅(qū)動(dòng)。此外，尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑與控制MtHz的機(jī)制之間的相似性并不直觀。

6 PheWAS分析

使用來(lái)自23andMe的全表型組關(guān)聯(lián)研究（PheWAS），檢測(cè)19個(gè)SNP與1123個(gè)性狀的關(guān)聯(lián)。在對(duì)評(píng)估的性狀和SNP應(yīng)用Bonferroni校正后，287個(gè)SNP-表型對(duì)符合顯著性標(biāo)準(zhǔn)（表S6）。研究者重點(diǎn)關(guān)注與MtHz最密切相關(guān)的SNP的關(guān)聯(lián)。對(duì)于rs1049432（TFAM），與較高異質(zhì)性相關(guān)的T等位基因與多囊卵巢綜合征風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)（61,181例病例和839,824例對(duì)照；優(yōu)勢(shì)比=0.96，P=6×10^?7），這種關(guān)聯(lián)先前未在10,074例多囊卵巢綜合征的meta-GWAS中被鑒定出。

本研究使用通過(guò)陣列得到的大型Mt變異的基因分型群組，評(píng)估了影響MtHz水平的參數(shù)。本研究工作存在以下幾個(gè)限制。首先，先前通過(guò)與等位基因特異性定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行比較，已確認(rèn)陣列可以用于MtHz，但本研究中使用的這個(gè)陣列進(jìn)行并未經(jīng)過(guò)確認(rèn)，并且MtHz的估值中可能存在噪點(diǎn)。本研究的另一個(gè)限制是，在估算MtHz時(shí)并未評(píng)估所有線粒體位置，而是側(cè)重于選擇高檢出率和可觀的BAF的SNP子集。最后，所使用的組織類型（唾液）可能無(wú)法代表影響mtDNA的性狀的所有組織。

本研究鑒定出年齡、性別、線粒體單倍群和MtHz值之間的關(guān)聯(lián)。MtHz隨著年齡的增長(zhǎng)而降低。這一發(fā)現(xiàn)出乎意料，因?yàn)橹暗难芯胯b定出MtHz隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。來(lái)自弗雷明漢心臟研究的356名個(gè)體的血液DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，基因組中多個(gè)位置的MtHz升高。同樣，一項(xiàng)使用白細(xì)胞DNA對(duì)2077名撒丁島人的研究也發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，MtHz增加，拷貝數(shù)減少。對(duì)于這種差異，一種可能的解釋是，所研究的組織類型可能會(huì)影響MtHz和衰老的動(dòng)態(tài)，本研究的觀察可能僅特定于唾液。另一種可能性是，本研究對(duì)大量位置的MtHz的定量可能與之前的研究不同，之前的研究在分析中使用了異質(zhì)性峰值，或比本研究檢測(cè)的mtDNA位點(diǎn)少。

MtHz的變異并不經(jīng)常按性別進(jìn)行評(píng)估。一項(xiàng)對(duì)235名具有致病性mt.3243A>G變異異質(zhì)性患者尿液樣本的研究發(fā)現(xiàn)，男性尿液樣本中的MtHz高于女性。然而，使用1035名沒(méi)有線粒體疾病的個(gè)體的白細(xì)胞DNA進(jìn)行的測(cè)序研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的性別差異。與年齡類似，這種差異可能反應(yīng)了組織的特異性。此外，本研究具有更高的能力來(lái)檢測(cè)MtHz中較小的年齡和性別依賴性差異。

從線粒體遺傳的角度來(lái)看，女性MtHz通常低于男性的這種可能性很有趣，因?yàn)槟行?/span>MtHz的影響應(yīng)該僅限于個(gè)體，而不具有將MtHz傳播給后代的風(fēng)險(xiǎn)。然而，體細(xì)胞異質(zhì)性的研究不能輕易擴(kuò)展到對(duì)雌性生殖系的理解。

本研究鑒定出20個(gè)與MtHz水平關(guān)聯(lián)的基因座。其中兩個(gè)基因座臨近DNA結(jié)合TFAM和線粒體解旋酶TWNK，這兩個(gè)基因編碼直接參與mtDNA復(fù)制的蛋白質(zhì)。表達(dá)數(shù)據(jù)表明TFAM處的變異rs1049432與許多組織中TFAM表達(dá)的差異有關(guān)。一個(gè)明顯的問(wèn)題是，TFAM的單體劑量不足是否與mtDNA MtHz增加有關(guān)。最近在小鼠模型中的研究顯示，TFAM表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致致病性MtHz水平下降。值得注意的是，這項(xiàng)研究表明，無(wú)論異質(zhì)性如何變化，致病性變異造成的后果在較低拷貝數(shù)下比在高拷貝數(shù)下更大，這表明野生型等位基因的拷貝數(shù)可能是疾病表型的控制特征。在TFAM致病性變異患者的單一報(bào)告中，罕見(jiàn)錯(cuò)義變異的純合性導(dǎo)致TFAM缺失、mtDNA耗竭和一種線粒體表型，但同樣，這種TFAM缺失對(duì)線粒體序列保真度的影響未知。

TFAM是mtDNA的多功能結(jié)合蛋白。顧名思義，它最初被鑒定出在線粒體轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用，但TFAM在mtDNA復(fù)制和基因組的整體壓縮中也具有多種作用。在兩項(xiàng)研究中，一個(gè)SNP與唾液和血液樣本中的mtDNA拷貝數(shù)均相關(guān)，這個(gè)SNP鄰近本研究鑒定出的TFAM峰值（r²=0.96）并具有強(qiáng)LD，并且包含在本研究的可信集中（rs11006126）。對(duì)拷貝數(shù)的觀測(cè)影響的方向性很有趣，因?yàn)樵谶@些研究中，等位基因關(guān)聯(lián)的拷貝數(shù)越大，相關(guān)聯(lián)地，MtHz增加越多。之前觀察到的TFAM對(duì)mtDNA拷貝數(shù)的影響可能與本研究中TFAM對(duì)異質(zhì)性影響的發(fā)現(xiàn)有關(guān)。蔡等人觀察到不穩(wěn)定二核苷酸重復(fù)mt.514到mt.523處的MtHz也與mtDNA拷貝數(shù)相關(guān)，并且可能不足以在其他基因座觀察到這種關(guān)聯(lián)。

在本研究的分析中，研究者試圖排除NUMT的影響。如果核基因組內(nèi)的線粒體序列塊的序列與個(gè)體的mtDNA不同，那么他們可以使異質(zhì)性估值變大。這反應(yīng)出本研究存在一個(gè)潛在的問(wèn)題，因?yàn)?/span>NUMT與鄰近核基因座處于LD中。本研究鑒定出驅(qū)動(dòng)與核基因座的錯(cuò)誤關(guān)聯(lián)的已知NUMT，但也證實(shí)額外的基因座可能與未知NUMT鄰近。鑒定這些錯(cuò)誤關(guān)聯(lián)的策略可能對(duì)包含全長(zhǎng)線粒體基因組的非常大的“mega-NUMT”無(wú)效；然而，它們?cè)谌后w中顯然不常見(jiàn)，因此它們的影響存在限制。

MtHz的狀態(tài)是細(xì)胞器基因組的一個(gè)重要特性，它影響新的多態(tài)性組合的出現(xiàn)，并在由致病變異引起的疾病的外顯率和嚴(yán)重程度中起著至關(guān)重要的作用。異質(zhì)變異既可以發(fā)生在體細(xì)胞水平，也可以通過(guò)種系傳播改變。在本研究中，研究者評(píng)估了一個(gè)大樣本，以鑒定影響異質(zhì)性的核編碼變異和附近基因。結(jié)果表明，與mtDNA復(fù)制所需的基因（TFAM和TWNK）以及其他與線粒體產(chǎn)能和QC相關(guān)的基因（CLEC16A和PRKAB1）鄰近的核變異與MtHz相關(guān)，這可能是基于這些基因在維持線粒體內(nèi)復(fù)制保真度方面的作用。