研究人員將一種名為CRISPR的細(xì)菌防御系統(tǒng)改造成為人類(lèi)細(xì)胞（比方說(shuō)腫瘤細(xì)胞）基因表達(dá)的強(qiáng)效活化劑，從而促進(jìn)了基因功能的研究。
分子生物學(xué)家一直以來(lái)都有一個(gè)夢(mèng)想，就是希望能夠隨意啟動(dòng)任何基因的表達(dá)。機(jī)體內(nèi)大多數(shù)基因的表達(dá)都是在特定生物學(xué)過(guò)程的控制之下進(jìn)行動(dòng)態(tài)啟動(dòng)和關(guān)閉的，而對(duì)基因表達(dá)水平的操控技術(shù)則是研究基因、調(diào)控元件和信號(hào)通路的功能的一種關(guān)鍵方法。Konermann等人描述了一種簡(jiǎn)潔的技術(shù)策略，可以將CRISPR/Cas9系統(tǒng)（即細(xì)菌內(nèi)用于抵御外源性DNA的防御系統(tǒng)）轉(zhuǎn)變成為一種強(qiáng)效的選擇性基因活化劑。Konermann等人在文章中展示了如何用這一方法來(lái)檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)基因的并行啟動(dòng)效果。
CRISPR是成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）的縮寫(xiě)，是指細(xì)菌內(nèi)用于編碼特殊RNA序列的DNA區(qū)域；這些特殊的RNA序列可以通過(guò)直接的序列互補(bǔ)作用來(lái)識(shí)別外源性DNA序列，例如病毒的DNA序列。在細(xì)菌中，這些向?qū)NA（guide RNA）能夠與Cas9酶結(jié)合形成復(fù)合物，或者與其他能特異性剪切被識(shí)別的DNA序列的蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，從而破壞被識(shí)別的DNA序列，保護(hù)細(xì)菌免受侵害。因此CRISPR/Cas9是一種可被操控的DNA靶向系統(tǒng)，其特異性取決于其RNA序列。
分子生物學(xué)家已經(jīng)利用此系統(tǒng)來(lái)促使基因組序列發(fā)生快速突變或替換——這一技術(shù)策略被稱為基因組編輯（genome editing）。2012年時(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了突破性的進(jìn)展，當(dāng)時(shí)研究人員利用短鏈向?qū)NA（short guide RNA, sgRNA）分子來(lái)特異性地操控CRISPR，從而簡(jiǎn)化了CRISPR/Cas9系統(tǒng)。研究人員在不久之后發(fā)現(xiàn)，Cas9的突變體dCas9雖然無(wú)法剪切DNA序列，但是卻能夠用來(lái)結(jié)合DNA。我們將dCas9連接到參與轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制的蛋白質(zhì)區(qū)域（或結(jié)構(gòu)域）上，然后利用CRISPR，使其作用于調(diào)節(jié)特定基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列，如此一來(lái)，這些融合蛋白就能夠調(diào)節(jié)基因的自然表達(dá)水平。然而，對(duì)于眾多應(yīng)用領(lǐng)域而言，這種方式對(duì)基因表達(dá)水平的影響效果太低——基因活化程度小于或約等于五倍。
Konermann等人將CRISPR sgRNA轉(zhuǎn)變成為一種可將多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄激活因子組裝起來(lái)的模塊化平臺(tái)，從而解決了該方法基因活化效率低的問(wèn)題（圖1a）。RNA結(jié)合蛋白可以結(jié)合到RNA的一些短序列上，而Konermann等人則在sgRNA上確定了兩個(gè)有此類(lèi)短序列的區(qū)域，而這兩個(gè)區(qū)域反過(guò)來(lái)能夠融合到哺乳動(dòng)物體內(nèi)不同轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域上。Konermann等人將該系統(tǒng)命名為協(xié)同激活介導(dǎo)因子（synergistic activation mediator, SAM）。機(jī)體內(nèi)有12個(gè)基因無(wú)法被dCas9-激活因子融合蛋白有效地激活，而Konermann等人證明，SAM系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)激活這12個(gè)基因，基因活化倍數(shù)可達(dá)到100倍以上。
圖1 RNA可作為基因調(diào)控的模塊化支架。a. Konermann等人對(duì)天然的CRISPR短鏈向?qū)NA（short guide RNA, sgRNA）分子進(jìn)行了改良，使其變成蛋白質(zhì)裝配的模塊化支架；改良后的CRISPR sgRNA可形成復(fù)合物，利用多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的作用，來(lái)特異性地調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平。sgRNA上的適配體（aptamer）結(jié)構(gòu)可以招募特殊的蛋白質(zhì)：在本案例中，適配體招募的蛋白質(zhì)是與不同轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活域相融合的RNA結(jié)合蛋白。由于CRISPR RNA的不同區(qū)域均可以與靶DNA序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，因此sgRNA復(fù)合物具有良好的DNA靶向特異性。dCas9酶通常都與CRISPR RNA結(jié)合在一起，有助于打開(kāi)DNA的結(jié)構(gòu)；dCas9也能夠融合到另一個(gè)調(diào)控區(qū)域中，進(jìn)而增加生物學(xué)效應(yīng)的多樣性。b. CRISPR系統(tǒng)的改良工作體現(xiàn)了天然的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）的設(shè)計(jì)原則，lncRNA能夠招募多種可修飾染色質(zhì)（即細(xì)胞核內(nèi)組蛋白與DNA形成的復(fù)合體）、調(diào)節(jié)基因表達(dá)的細(xì)胞因子。
為了說(shuō)明該方法的潛在應(yīng)用價(jià)值，Konermann等人創(chuàng)建了一個(gè)sgRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，匯總了一系列能夠分別啟動(dòng)23000個(gè)人類(lèi)基因的改良后的sgRNA。他們隨后逐個(gè)探討哪個(gè)基因在被sgRNA激活后，可以促使黑色素瘤癌細(xì)胞逃避PLX-4720（治療黑色素瘤的主要藥物）的殺傷作用。不同的基因被激活后，可以使黑色素瘤癌細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的抗藥性，而抗藥性的高低則取決于細(xì)胞在接受藥物治療后sgRNA的相對(duì)頻率。在高度富集的sgRNA中，有一些sgRNA可以啟動(dòng)已知耐藥性通路中的基因，還有一些sgRNA可以啟動(dòng)在抗藥性黑色素瘤患者體內(nèi)表達(dá)水平增高的基因，這就可以證明，SAM法能夠確定基因表達(dá)水平改變后會(huì)發(fā)生哪些生物相關(guān)性結(jié)局。
CRISPR改良工作的成功可用于直接揭示天然的基因調(diào)控機(jī)制。增強(qiáng)子（enhancer）是一種能夠啟動(dòng)基因表達(dá)的DNA序列，它們通常都含有一些可識(shí)別不同轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別序列。此外，增強(qiáng)子和其它調(diào)控元件通常都會(huì)轉(zhuǎn)錄出長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA），這種RNA可以作為模塊支架，利用各種各樣可修飾染色質(zhì)（即細(xì)胞核內(nèi)由組蛋白與DNA形成的復(fù)合物）的細(xì)胞因子，調(diào)控基因的表達(dá)（圖1b）。lncRNA就像放大的分子“菜譜”，既能夠指導(dǎo)一系列生化作用的組合，也能夠指導(dǎo)這些生化作用應(yīng)該去影響哪些基因組位置。
最近還有另外兩項(xiàng)研究也證明，在將dCas9或CRISPR RNA改良成模塊化支架后，就大大提高了CRISPR引導(dǎo)性基因調(diào)控技術(shù)的效率或靈活性。其中一項(xiàng)研究還進(jìn)一步表明，多種改良后的CRISPR RNA能夠同時(shí)啟動(dòng)和關(guān)閉同一細(xì)胞內(nèi)的不同基因，從而操控某一條代謝通路。Konermann等人的研究發(fā)現(xiàn)以及這兩項(xiàng)研究均表明，天然lncRNA的模擬技術(shù)是一種有效的、協(xié)調(diào)多個(gè)蛋白質(zhì)的方式，可以使這些蛋白質(zhì)共同對(duì)整個(gè)基因組內(nèi)產(chǎn)生影響。我們用一個(gè)sgRNA分子，也許就能夠讓各種效應(yīng)蛋白作用于相同的基因組位置上。由于這類(lèi)研究工具在生物技術(shù)領(lǐng)域中具有廣泛的實(shí)用性，因此我們也有必要進(jìn)一步構(gòu)建一些新的多功能人工蛋白或非編碼RNA。
下一代CRISPR技術(shù)為我們提供了一個(gè)絕佳的機(jī)會(huì)來(lái)研究多個(gè)基因和DNA序列的功能。在過(guò)去十年里，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于研究基因功能缺失后所造成的影響，但是由于存在非特異性靶向作用，因此這種方法出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的概率非常高。與此同時(shí)，如果利用過(guò)表達(dá)技術(shù)來(lái)開(kāi)展功能獲得性研究的話，可能無(wú)法闡明正常的RNA調(diào)控過(guò)程，例如選擇性剪接（alternative splicing）。我們雖然可以根據(jù)鋅指蛋白和TALEN等DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)來(lái)合成人工轉(zhuǎn)錄因子，作為改變基因表達(dá)水平的備選方法，但是我們卻難以在全基因組范圍內(nèi)構(gòu)建這些人工轉(zhuǎn)錄因子。因此，CRISPR技術(shù)擁有其他技術(shù)無(wú)法比擬的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)：即CRISPR數(shù)據(jù)庫(kù)的全面覆蓋性以及CRISPR方法的模塊化特性。然而，CRISPR靶向技術(shù)也會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)（off-target effect），因此，如果我們利用這種方法來(lái)確定基因表達(dá)水平的改變會(huì)造成哪些影響，那么還需要開(kāi)展額外的驗(yàn)證性試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行證實(shí)。
Konermann等人對(duì)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，最終確定了13個(gè)特殊的基因：當(dāng)每個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生改變時(shí)，都可以使黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性。然而，一般而言，只有當(dāng)多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行復(fù)雜調(diào)控時(shí)，才能夠?qū)е录膊』驀?yán)重生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)生——有一個(gè)很好的例子可以說(shuō)明這一點(diǎn)：研究人員發(fā)現(xiàn)，四個(gè)基因必須同時(shí)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，才能夠促使誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，是成熟細(xì)胞所產(chǎn)生的一類(lèi)干細(xì)胞）的生成。因此，我們需要詳盡地了解基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也需要利用基因分庫(kù)和基因劑量來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以便確定是哪些基因共同決定了某些性狀。CRISPR/Cas系統(tǒng)將會(huì)成為一個(gè)用于實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的萬(wàn)能工具，這是因?yàn)樵撓到y(tǒng)能夠?qū)Ω鞣N不同的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重靶向和多重調(diào)控。
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