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研究基因功能最常用的方法便是減少或者阻斷基因的正常表達(dá)，然后進(jìn)行表型分析，從而研究其功能。十幾年來，RNAi一直是實(shí)驗(yàn)室的首選技術(shù)，其也是這一領(lǐng)域的王者。然而新興技術(shù)的涌現(xiàn)（尤其是基于CRISPR的技術(shù)）正在逐漸瓦解RNAi的統(tǒng)治地位。日新月異的技術(shù)發(fā)展為生物學(xué)研究提供了越來越大的助力，但也給研究者們帶來了一個(gè)有些糾結(jié)的問題，“到底應(yīng)該選擇那一種技術(shù)呢”。本文主要介紹了這幾種技術(shù)的利弊并且教你如何正確選擇適合你的技術(shù)。
RNAi是在研究秀麗新小桿線蟲（C. elegans）反義RNA（antisense RNA）的過程中發(fā)現(xiàn)的，由dsRNA介導(dǎo)的同源RNA降解過程。1995年，Guo等發(fā)現(xiàn)注射正義RNA（sense RNA）和反義RNA均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲par-1基因的表達(dá)，該結(jié)果不能使用反義RNA技術(shù)的理論做出合理解釋。直到1998年，F(xiàn)ire等證實(shí)Guo等發(fā)現(xiàn)的正義RNA抑制同源基因表達(dá)的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA中污染了微量dsRNA而引發(fā)，并將這一現(xiàn)象命名為RNAi。
此后dsRNA介導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等多種真核生物中，并逐漸證實(shí)植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing, PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA介導(dǎo)的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）現(xiàn)象均屬于RNAi在不同物種的表現(xiàn)形式。
1992年，羅馬諾（Romano）和Macino也在粗糙鏈孢霉中發(fā)現(xiàn)了外源導(dǎo)入基因可以抑制具有同源序列的內(nèi)源基因的表達(dá)。
1995年，Guo和Kemphues在線蟲中也發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。
1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)度為25nt的RNA中間產(chǎn)物。2000年，Zamore和Hammond等使用體外培養(yǎng)的果蠅細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，外源性dsRNA通過耗能過程降解成21-23nt的小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）引發(fā)RNAi。
2000年，Wianny和Svoboda等分別證實(shí)在小鼠胚胎細(xì)胞和卵母細(xì)胞中dsRNA能引發(fā)RNAi效應(yīng)。2001年，Elbashir等證實(shí)21nt的siRNA可在避免激活dsRNA依賴的蛋白激酶(dsRNA-dependent protein kinase, PKR）和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylate synthetase, 2',5'-OAS)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的同時(shí)，有效抑制人胚腎293細(xì)胞、Hela細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。
2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1啟動(dòng)子構(gòu)建了小發(fā)卡RNA（small hairpin RNA, shRNA）表達(dá)載體pSUPER，并證實(shí)轉(zhuǎn)染該載體可有效、特異性地剔除哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)，為利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。
2006年，安德魯·法厄與克雷格·梅洛（Craig C. Mello）由于在RNAi機(jī)制研究中的貢獻(xiàn)獲得諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細(xì)胞對(duì)這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約21～23 bp），即siRNA。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。
Off-target effects（脫靶效應(yīng)）最早由Dharmacon科學(xué)家Jackson和他的同事們提出（Fedorov,Y.,et al. 'Off-targeting By siRNA Can Induce Toxic Phenotype.' RNA Accepted (2006).）。他們給細(xì)胞轉(zhuǎn)染特定基因的單條siRNA后運(yùn)用全基因組芯片檢測(cè)技術(shù)鑒定表達(dá)上調(diào)/下調(diào)1.5到3倍的靶基因數(shù)量。研究人員發(fā)現(xiàn)在這種情況下有大量的基因被非特異性的調(diào)控著。siRNA正義鏈和反義鏈與脫靶基因的互補(bǔ)水平有高有低，并且每條siRNA所引發(fā)的脫靶基因表達(dá)譜也不盡相同，反映了序列依靠性的脫靶效應(yīng)。
簡(jiǎn)單來說，Off-target效應(yīng)就是指干擾shRNA序列進(jìn)入了microRNA途徑，通過microRNA途徑，其可以不受完全互補(bǔ)的限制而調(diào)控大量靶基因的表達(dá)。原本需要19~23nt的RNA序列完全互補(bǔ)才能發(fā)生干擾作用，而如果進(jìn)入microRNA途徑，只需要11~15nt互補(bǔ)就可以產(chǎn)生干擾效果，這使得siRNA可能與非靶基因結(jié)合而導(dǎo)致非靶基因沉默，造成脫靶。
如果脫靶干擾的部分基因，正好與目的基因位于同一信號(hào)通路中，或者與目的基因的生物學(xué)功能相似，那么，如果因脫靶而干擾了其它基因，亦會(huì)造成和目的基因受到干擾后相同的細(xì)胞表型改變。而實(shí)際上，可能選擇的這條shRNA序列并沒有對(duì)目的基因造成有效干擾，或者雖然干擾了目的基因，但是并不會(huì)引起預(yù)期的細(xì)胞表型改變。
基于以上原因，自從Off-target效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)并被研究者們廣泛認(rèn)同后，越來越多的雜志要求研究者們?cè)谕陡鍟r(shí)需要有相應(yīng)的對(duì)照來說明Off-target效應(yīng)。即您需要有相關(guān)對(duì)照或者實(shí)驗(yàn)來說明，您所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不是由于Off-target效應(yīng)而產(chǎn)生的。
TALENs中文名是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶，TALENs是一種可靶向修飾特異DNA序列的酶，它借助于TAL效應(yīng)子一種由植物細(xì)菌分泌的天然蛋白來識(shí)別特異性DNA堿基對(duì)。TAL效應(yīng)子可被設(shè)計(jì)識(shí)別和結(jié)合所有的目的DNA序列。對(duì)TAL效應(yīng)子附加一個(gè)核酸酶就生成了TALENs。TAL效應(yīng)核酸酶可與DNA結(jié)合并在特異位點(diǎn)對(duì)DNA鏈進(jìn)行切割，從而導(dǎo)入新的遺傳物質(zhì)。
最早關(guān)于TALE蛋白的研究始于AvrBs3，其特異識(shí)別DNA堿基的特性直到2009年才首次得到應(yīng)用。該應(yīng)用研究發(fā)表在Science雜志上。同年人們徹底搞清了TALE的識(shí)別規(guī)則，并且在隨后的2014年CELL雜志上發(fā)表了其特異識(shí)別的原理。自TALE序列被完全解譯以后，其應(yīng)用逐漸普及開來。
自TALEN技術(shù)正式發(fā)明以來，TALEN的特異性切割活性在酵母、擬南芥、水稻、果蠅及斑馬魚等多個(gè)動(dòng)植物體系和體外培養(yǎng)細(xì)胞中得以驗(yàn)證。2013年，首爾國(guó)立大學(xué)化學(xué)系和國(guó)家基因工程創(chuàng)新舉措研究中心的Kim課題組建立了一個(gè)全基因組規(guī)模的TALEN體系。他們系統(tǒng)地選取了人類基因組中高度特異性的序列作為靶點(diǎn)以避開脫靶效應(yīng)。通過高通量克隆體系，一次性構(gòu)建了近2萬(wàn)個(gè)編碼蛋白基因的TALEN質(zhì)粒。這項(xiàng)研究中，他們以一種巧妙的方式優(yōu)化了TALEN質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，以檢測(cè)插入靶點(diǎn)后質(zhì)粒對(duì)應(yīng)位置上eGFP的表達(dá)的方式檢測(cè)TALEN靶點(diǎn)插入成功率。通過研究不同間隔序列下特定靶點(diǎn)插入效率，從而得出最佳TALEN體系結(jié)構(gòu)。
2014年2月，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魏文勝課題組依托于一種自主研發(fā)的TALE蛋白組裝技術(shù)完成了全部TALE元件的解碼工作。
2010年至今，TALEN技術(shù)已被全球范圍內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室使用。服務(wù)公司更如雨后春筍般大量涌現(xiàn)，如GeneCopoeia等。
典型的 TALEN由一個(gè)包含核定位信號(hào)（Nuclear localization signal, NLS）的N端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)包含可識(shí)別特定DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)具有FokI核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域組成。不同類型的TALEN元件識(shí)別的特異性DNA序列長(zhǎng)度有很大區(qū)別。一般來說，天然的TALEN元件識(shí)別的特異性DNA序列長(zhǎng)度一般為17-18bp；而人工TALEN元件識(shí)別的特異性DNA序列長(zhǎng)度則一般為14-20bp。
圖1，TALEN的結(jié)構(gòu)。（A）與靶點(diǎn)DNA（灰色顯示，PDB ID：3UGM）結(jié)合的TALE蛋白。每一個(gè)獨(dú)立的TALE重復(fù)序列元件包含33到35個(gè)氨基酸殘基，這些TALE重復(fù)序列元件能夠通過兩個(gè)高變異度的殘基（即重復(fù)可變雙殘基，RVD，棍狀顯示）來識(shí)別一個(gè)單一的堿基對(duì)。（B）TALE核酸酶（TALEN）形成二聚體結(jié)合DNA的動(dòng)畫演示。TALEN目標(biāo)位點(diǎn)由兩個(gè)TALE結(jié)合位點(diǎn)組成，這兩個(gè)位點(diǎn)間通過不同長(zhǎng)度的間隔區(qū)序列（12-20bp）分開。TALE可以被設(shè)計(jì)成僅僅識(shí)別左半側(cè)位點(diǎn)或右半側(cè)位點(diǎn)。圖片來源： Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas III. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 31(7): 397-405.
TALEN技術(shù)的原理并不復(fù)雜，即通過DNA識(shí)別模塊將TALEN元件靶向特異性的DNA位點(diǎn)并結(jié)合，然后在FokI核酸酶的作用下完成特定位點(diǎn)的剪切，并借助于細(xì)胞內(nèi)固有 的同源定向修復(fù)（HDR）或非同源末端連接 途徑（NHEJ）修復(fù)過程完成特定序列的插入 （或倒置）、刪失及基因融合（圖2）。
圖2，TALEN進(jìn)行基因組編輯的原理。利用位點(diǎn)特異性核酸酶可以進(jìn)行基因組編輯，而核酸酶誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSB）可由同源定向修復(fù)（HDR）或非同源末端連接途徑（NHEJ）來修復(fù)。（A）在供體質(zhì)粒（donor plasmid）暴露出延長(zhǎng)的同源臂（homology arm）的情況下，HDR可能導(dǎo)致插入的單個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因發(fā)生改變或取代原有的基因。（B）在缺失供體質(zhì)粒的情況下，NHEJ介導(dǎo)的修復(fù)會(huì)產(chǎn)生小的插入或刪失突變，并可能導(dǎo)致目標(biāo)基因被破壞；在有雙鏈寡核苷酸或線狀供體質(zhì)粒存在的情況下，這些DNA片段可能通過NHEJ介導(dǎo)的連接反應(yīng)插入；同時(shí)誘導(dǎo)兩個(gè)DSB的產(chǎn)生則會(huì)引起刪失、插入和易位突變。圖片來源：Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas III. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 31(7): 397-405.
TALEN技術(shù)的核心原理就是在同一個(gè)蛋白（TALEN）上有序地實(shí)現(xiàn)引導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核、靶位點(diǎn)DNA的特異性識(shí)別和靶位點(diǎn)DNA的切割這三個(gè)不同的功能，這一點(diǎn)在上述TALEN典型結(jié)構(gòu)一節(jié)中已作了較為詳細(xì)的描述。在具體操作中，例如在實(shí)驗(yàn)室條件下，實(shí)現(xiàn)TALEN的關(guān)鍵就在于完成DNA的特異性識(shí)別功能，一般說來分為兩個(gè)步驟。圖3與圖4分別以“鉑金門”TALEN構(gòu)建系統(tǒng)（Platinum Gate TALEN construction system）和商業(yè)化的easyT體系為例，展示了實(shí)驗(yàn)操作中TALEN元件的構(gòu)建。
圖 3，“鉑金門”TALEN構(gòu)建系統(tǒng)TALEN元件構(gòu)建操作示意圖。步驟一，四個(gè)或更少的組件被連接到陣列質(zhì)粒（array plasmid）上；步驟二，構(gòu)建好的陣列隨后被連接到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中；白色和粉色的長(zhǎng)方形分別表示在BsaI和Esp3I限制性內(nèi)切酶切割后留下的粘性末端；藍(lán)色字母代表RVD，紅色字母代表non-RVD變化，黃色長(zhǎng)方形代表后一半重復(fù)。圖片來源：Tetsushi Sakuma, Hiroshi Ochiai, Takehito Kaneko, Tomoji Mashimo, Daisuke Tokumasu, et al. (2014) Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity. Science Report, 3(3379): 1-8.
圖 4，“easyT” TALEN構(gòu)建系統(tǒng)TALEN元件構(gòu)建操作示意圖。（A）包含一個(gè)長(zhǎng)度為18.5個(gè)組件的TALE重復(fù)元件的TALEN體系示意圖。該TALE重復(fù)元件由20個(gè)單體單位（monomer unit）組裝而成。單體單位的邊界在組裝過程中發(fā)生了移位。（B）TALEN克隆示意圖。第一步，由四個(gè)單體通過連接反應(yīng)組裝成4聚體；第二步，4聚體（4-mers）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，膠回收并濃縮；最后，在第二次連接反應(yīng)中，4聚體被組裝到TALEN骨架質(zhì)粒（backbone plasmid）上；黃色和藍(lán)色箭頭分別表示4聚體擴(kuò)增時(shí)的正向引物與反向引物。圖片來源：Tomonori Katsuyama, Arslan Akmammedov, Makiko Seimiya, Samuel C. Hess, Cem Sievers and Renato Par. (2013) An ef?cient strategy for TALEN-mediated genome engineering in Drosophila. Nucleic Acids Research, 41(17): e163-171.
構(gòu)建TAL靶點(diǎn)識(shí)別模塊
TAL的DNA特異性識(shí)別單位是間隔32個(gè)恒定氨基酸殘基的二聯(lián)氨基酸。二聯(lián)氨基酸與AGCT這4個(gè)核苷酸堿基有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系：腺嘌呤（A）由NI識(shí)別、胸腺嘧啶（T）由NG識(shí)別、鳥嘌呤（G）由NN識(shí)別，而胞嘧啶（C）則由HD識(shí)別。實(shí)驗(yàn)操作中，我們通過 靶位點(diǎn)的DNA序列可以反推能特異性識(shí)別這一序列的二聯(lián)氨基酸序列，從而構(gòu)建TAL靶點(diǎn)識(shí)別模塊。
TAL靶點(diǎn)識(shí)別模塊的克隆與表達(dá)
根據(jù)之前對(duì)TALEN結(jié)構(gòu)的介紹，我們需要將上一步驟中根據(jù)目標(biāo)DNA序列構(gòu)建好的一對(duì)TAL靶點(diǎn)識(shí)別模塊與N端的核定位序列、C端的FokI酶連接起來，才能得到一個(gè)完整的TALEN元件。一般來說，我們可以采用專門用于構(gòu)建TALEN的真核表達(dá)載體體系，將一對(duì)特異性的TAL靶點(diǎn)識(shí)別模塊克隆進(jìn)該載體中，再通過轉(zhuǎn)染等方式導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。這種體系一般由供體質(zhì)粒（donor plasmid，提供單基、二聯(lián)及三聯(lián)等類型的TAL模塊）和骨架質(zhì)粒（backbone plasmid，用于構(gòu)建TALEN并表達(dá)構(gòu)建好的TALEN）兩類質(zhì)粒構(gòu)成，常用的TALEN體系有RCIscript-GoldyTALEN和pC-GoldyTALEN、TAL5-BB和pTAL6-BB及pCS2TAL3-DD和pCS2TALE-RR等。
CRISPR/Cas9 是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過將入侵噬菌體和質(zhì)粒 DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應(yīng)的CRISPR RNAs（crRNAs）來指導(dǎo)同源序列的降解，從而提供免疫性。
CRISPR/Cas系統(tǒng)最早是在細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其主要功能是對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大學(xué)（OsakaUniversity）的研究人員在E.coliK12的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)了成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR），其結(jié)構(gòu)如圖5所示，目前普遍認(rèn)為有40%的細(xì)菌基因組具有這樣的結(jié)構(gòu)。
CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR序列元件與Cas基因家族組成。其中CRISPR由一系列高度保守的重復(fù)序列（repeat）與同樣高度保守的間隔序列（spacer）相間排列組成。而在CRISPR附近區(qū)域還存在著一部分高度保守的CRISPR相關(guān)基因（CRISPR-associated gene, Cas gene），這些基因編碼的蛋白具有核酸酶活性的功能域，可以對(duì)DNA序列進(jìn)行特異性的切割。
CRISPR/Cas作為原核生物中普遍存在的一種系統(tǒng)，最初的功能就是識(shí)別外源性入侵的核酸序列，并對(duì)其進(jìn)行特異性降解，以達(dá)到抗病毒的作用。這一過程分兩步進(jìn)行——crRNA的合成及在crRNA引導(dǎo)下的RNA結(jié)合與剪切，具體機(jī)制如圖6所示，包含crRNA的生物學(xué)合成和RNA的結(jié)合與剪切兩大步驟。
crRNA的生物學(xué)合成
CRISPR區(qū)域第一個(gè)重復(fù)序列上游有一段CRISPR的前導(dǎo)序列（Leader sequence），該序列作為啟動(dòng)子來啟動(dòng)后續(xù)CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄生成的RNA被命名為CRISPRRNA（簡(jiǎn)稱crRNA）。
RNA的結(jié)合與剪切
CRISPR/Cas系統(tǒng)中crRNA與tracrRNA（反式激活的crRNA）形成嵌合RNA分子，即單向?qū)NA（Single guide RNA, sgRNA）。sgRNA可以介導(dǎo)Cas9蛋白在特定序列處進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂（Double-Stranded Break, DSB），完成基因定向編輯等的各類操作。
根據(jù)功能元件的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以分為I類系統(tǒng)、II類系統(tǒng)和III類系統(tǒng)。這三類系統(tǒng)又可以根據(jù)其編碼Cas蛋白的基因不同而分為更多的亞類。不同類型CRISPR/Cas系統(tǒng)完成干擾的步驟也有所不同（圖7）。
I類和III類CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行干擾時(shí)只需要crRNA和Cas蛋白兩種元件的參與，而II類CRISPR/Cas系統(tǒng)包括crRNA、tracrRNA和Cas蛋白三種元件。其中II類CRISPR/Cas系統(tǒng)最先在改造后用于小鼠和人類基因組編輯，同時(shí)也是目前研究最為充分的系統(tǒng)。根據(jù)Cas蛋白的類型不同分為三個(gè)亞類：II-A類含有Cas1、Cas2、Cas9和Csn2樣蛋白；II-B類含有Cas1、Cas2、Cas4和Csx12樣Cas9四種蛋白；II-C類則有Cas1、Cas2及Cas9三種蛋白。此外，II類CRISPR/Cas系統(tǒng)也是目前最常用于人工基因組編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其靶向基因組編輯的步驟如圖8所示。
最后附一張表格來指導(dǎo)各位如何選擇各項(xiàng)技術(shù)！
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8. 部分資料參考自網(wǎng)絡(luò)
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