作者：葉子（轉載請注：解螺旋·醫(yī)生科研助手）
上周文獻精讀里，我們討論的是一篇發(fā)表在Journal of Hepatology（IF: 10.59，也算肝病中數(shù)一數(shù)二的期刊）上的論文，題目是“Long Non-coding RNA DILC Represses Self-renewal of Liver Cancer Stem Cells via Inhibiting Autocrine IL-6/STAT3 Axis”（回復0419可下載本文，一周有效），文章的通訊作者是第二軍醫(yī)大的王紅陽院士。
通過文章題目可以知道，本文研究的核心分子是一個lncRNA，名字叫“DILC”，它發(fā)揮的生物學效應是抑制腫瘤干細胞的自我更新能力，發(fā)揮作用的信號通路是IL-6/STAT3信號軸。
科學假說
在Introduction里，作者就講到對于肝癌患者來說手術是一種很好的治療手段，很多患者也會接受術后化療。但肝癌手術患者會出現(xiàn)一個高比例的復發(fā)，復發(fā)的原因根據(jù)現(xiàn)有理論來解釋的話就是因為，雖然可以把腫瘤組織手術切除，但總會有腫瘤干細胞的殘存。這些殘存的腫瘤干細胞就是導致肝癌患者復發(fā)轉移的“元兇”。
所以作者就想知道，在肝癌腫瘤干細胞當中有沒有l(wèi)ncRNA的作用機制。作者篩選到了這個關鍵的lncRNA分子，命名為“l(fā)nc-DILC”。
在肝癌腫瘤干細胞中TNF-α和IL-1β可以激活下游的NF-κB，使它可以從胞漿轉移到胞核內，胞核的NF-κB結合在IL-6的啟動子區(qū)域，促進了IL-6的高表達。之后IL-6通過自分泌的方式到細胞外，又作用于自身受體，激活JAK2/STAT3信號軸，導致腫瘤干細胞的擴增。
在這條信號通路當中，lnc-DILC有什么作用呢？有這么三個：
1、lnc-DILC 能成為肝癌的一個分子靶標；
2、lnc-DILC 介導NF-κB通路與Jak2/STAT3 通路之間的crosstalk；
3、lnc-DILC 能結合IL-6 的啟動子區(qū)域，調控IL-6 的轉錄。
結果解讀
本文中有8組Fig，可以分成4部分：
Fig1通過細胞進行l(wèi)ncRNA分子的篩選驗證，最后發(fā)現(xiàn)了起重要作用的lnc-DILC分子。
Fig2-Fig4通過離體和在體的實驗證實了lnc-DILC與腫瘤干細胞（CSC）之間的關系。
Fig5-Fig7作者開始研究DILC下游的分子信號通路。
Fig8中對DILC的臨床意義進行了研究。
由于腫瘤干細胞在腫瘤組織中的含量也很少，作者要進行篩選就必須在腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞中進行一個差異比較。腫瘤干細胞有兩大特性，一是自我更新能力；二是對化療藥物抵抗的能力。
作者采取了3株肝癌細胞系：Huh7、HepG2和CSQT-2，對這3種肝癌細胞系采取了2種培養(yǎng)方式，第一種培養(yǎng)方式就是普通培養(yǎng)，這樣的條件下，肝癌細胞呈現(xiàn)出了一種貼壁生長、粘附生長的特性。這類都是非腫瘤干細胞的特性，如何獲得腫瘤干細胞呢？
作者用了干細胞的一種化療藥物抵抗的能力，在培養(yǎng)基中加入了順鉑。對于非腫瘤干細胞來說，有殺滅作用，剩下的就是腫瘤干細胞。而且腫瘤干細胞還有自我更新的能力可以不斷分裂。這樣作者就既有非腫瘤干細胞，又有腫瘤干細胞，通過mRNA和lncRNA的嵌合芯片比較了有顯著差異的mRNA和lncRNA分子。
作者在結果里挑選了一個lncRNA的分子，叫l(wèi)nc-DILC（lncRNA down-regulated in liver cancer stem cells）。通過驗證發(fā)現(xiàn)，這個分子在粘附細胞中表達很高，在腫瘤干細胞中表達非常低。
在腫瘤培養(yǎng)基中撤掉化療藥物順鉑，就會導致腫瘤干細胞缺少篩選壓力，分化成非腫瘤干細胞，獲得粘附表型。Fig1這兩個實驗說明了DILC的表達高低與腫瘤干細胞干性呈明顯負相關。
Fig2中作者繼續(xù)研究DILC與腫瘤干細胞之間的關系。在細胞內敲減DILC之后發(fā)現(xiàn)，EpCAM 和CD24這兩個肝癌腫瘤干細胞的marker會顯著增高。
另外還有Nanog、SOX2、OCT-4、Bmi-1這4個和腫瘤干細胞相關的轉錄因子都會在DILC被敲減后，表達水平明顯升高。在做了流式細胞檢測后，還發(fā)現(xiàn)，在敲減了DILC之后腫瘤干細胞的比例也會有所增加。
在微球形成過程中敲減DILC，形成微球的數(shù)量明顯增加；過表達DILC的話，則效果相反。
通過Fig2說明的就是DILC在腫瘤干細胞中的表達量會明顯減少，在非腫瘤干細胞中DILC的表達量會明顯增加。DILC的表達高低與腫瘤干細胞的數(shù)量呈反比關系。
在Fig3中用了一個在體的動物模型證實了DILC和腫瘤干細胞負向調控的關系。
作者在收集了腫瘤干細胞之后，做了梯度稀釋，按照不同的濃度比例接種到動物身上看成瘤率。統(tǒng)計結果顯示，在對照情況下，腫瘤干細胞成瘤率大約是1/4~1/3，但是敲減了腫瘤干細胞中的DILC表達后，可以使成瘤率大幅度提高。Fig3C、D兩張圖也證實了DILC表達被敲減后，腫瘤干細胞占比會顯著提升，形成腫瘤的體積也會顯著增加。
通過前面的離體細胞實驗和在體動物實驗證實了DILC和腫瘤干細胞存在明顯的負相關性。表型驗證完后，作者開始研究下游的信號通路。作者用了PCR array的方式篩選了多條信號通路，結果發(fā)現(xiàn)其中一條JAK2/STAT3信號通路發(fā)生了顯著變化。
Fig4A通過WB證實了DILC下游可以影響JAK2/STAT3信號通路。DILC表達升高抑制了JAK2/STAT3信號通路，表達下降，促進了JAK2/STAT3信號通路。
Fig4C通過免疫熒光實驗證實了DILC和STAT3之間的關系，如果敲減了細胞內的DILC，發(fā)現(xiàn)STAT3的熒光會有所增強，且和DAPI共定位的STAT3增加的更明顯。
在Fig4E中，作者又通過在微球實驗中阻斷JAK2/STAT3信號通路發(fā)現(xiàn)，DILC確實是通過JAK2/STAT3信號通路來影響微球形成。
之前的實驗說明了DILC調控了JAK2/STAT3信號通路，而在之前也有文獻報道，IL-6也能調控JAK2/STAT3信號通路。那么這兩者之間是什么樣的調控關系呢？
Fig5A、B告訴我們DILC也能調控IL-6。Fig5A中在細胞內敲減DILC的表達后，可以明顯的促進IL-6的表達。Fig5B中敲減了DILC之后IL-6的分泌增加，過表達DILC后，IL-6分泌明顯減少。它們也是一個負向調控關系。
在Fig5D微球形成實驗中，用單抗阻斷了IL-6的受體，敲減DILC后微球并不會增多。說明DILC要促進微球形成，依賴于IL-6信號通路。
Fig5E通過在體的移植瘤模型，作者采用了免疫組化實驗證實敲減DILC表達后使的下游的IL-6表達明顯上升。整個Fig4、5就證實了DILC可以負向調節(jié)JAK2/STAT3信號通路和IL-6信號通路。
那DILC是如何負向調控IL-6的呢？作者發(fā)現(xiàn)，DILC和IL-6的啟動子區(qū)域有一段序列是可以完全反向互補。這就提示了DILC也許可以結合在IL-6的啟動子區(qū)來達到負向調控的表達效應。
為了驗證這個假設，作者做了如下實驗，作者先合成了一段反義寡聚核苷酸鏈。將這段反義序列結合到DILC上，獲得了大量的富集的DILC序列。
同時作者還做了與DILC序列完全一樣的oligo mimics，結合到IL-6的啟動子區(qū)域，負向調節(jié)IL-6表達。
另一條Decoy序列則是與DILC完全反向互補，在過表達DILC的同時過表達Decoy的話也可以阻斷DILC的下游效應。
整個Fig6就是研究了DILC對IL-6調控的具體機制——DILC可以結合在IL-6的啟動子區(qū)域。
在很多文獻中都證實，NF-κB也能結合在IL-6的啟動子區(qū)域，同樣可以影響IL-6的表達。作者想知道DILC和NF-κB之間是否也有調節(jié)的關系？
結果發(fā)現(xiàn)，NF-κB與DILC之間有一個競爭性結合IL-6，并調控IL-6表達的一個效應。
最后Fig8中，作者在臨床樣本中檢測了DILC表達水平的高低，以及其臨床意義。
通過表達研究發(fā)現(xiàn)，DILC在腫瘤組織中的表達，比在癌旁組織表達低。對患者預后隨訪進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，如果患者的DILC表達很低，就表明腫瘤干細胞的干性強，未來發(fā)生復發(fā)的概率就比較高；總生存率也更低。
套路分析
對本文做個總結，作者首先通過篩選腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞，發(fā)現(xiàn)了表達具有顯著差異的lnc-DILC分子。因為它的表達在腫瘤干細胞中明顯下降，之后作者又證實了DILC可以負向調節(jié)JAK2/STAT3信號通路，還能負向調節(jié)IL-6的表達。進一步RNA pull down實驗發(fā)現(xiàn)，DILC負向調節(jié)IL-6的表達是通過結合在IL-6啟動子區(qū)域，阻斷了下游IL-6的轉錄和翻譯。
同時，結合其他文獻發(fā)現(xiàn)，NF-κB可以正向調節(jié)IL-6的表達。這就導致了DILC和NF-κB都可以結合在IL-6的啟動子區(qū)域，它們就存在著明顯的競爭性抑制。
當腫瘤干細胞內的DILC表達很低，DILC競爭不過NF-κB使的NF-κB結合在IL-6的啟動子區(qū)域。正向激活IL-6，提升了IL-6的表達量，這樣IL-6就可以通過自分泌的方式激活JAK2/STAT3信號通路，促進了腫瘤干細胞的增殖。
但如果在腫瘤干細胞內的DILC表達很高，就可以競爭性結合在IL-6的啟動子區(qū)域。阻斷NF-κB的結合，使IL-6的表達被完全阻斷，抑制了下游JAK2/STAT3信號通路，腫瘤干細胞無法發(fā)生進一步的增殖。
這項研究最大的意義在于揭示了，lnc-DILC在腫瘤干細胞中所起的競爭性抑制NF-κB的作用，提示DILC可以作為肝癌患者總生存期和復發(fā)的參考因子。
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