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這次和大家分享的文章是2015年發(fā)表在Nature上的。標(biāo)題是”Melanoma-intrinsic β-catenin signalling prevents anti-tumour immunity”。（回復(fù)170606可下載文獻(xiàn)，一月有效）

這兩年腫瘤免疫研究特別火，像免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1和CTLA-4，這些分子都開(kāi)始用于臨床治療。本文發(fā)表于2015年，現(xiàn)在來(lái)看非常前沿，引領(lǐng)了這兩年在免疫研究方面的潮流。

科學(xué)假說(shuō)

本文主要講述了黑色素瘤內(nèi)β-catenin信號(hào)通路能夠啟動(dòng)ATF3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，然后ATF3又能抑制CCL4表達(dá)，而CCL4能夠招募CD103⁺樹(shù)突狀細(xì)胞，CD103⁺樹(shù)突狀細(xì)胞是CD8⁺T細(xì)胞活化的關(guān)鍵。

也就是說(shuō)β-catenin信號(hào)通路通過(guò)ATF3、CCL4最終可以影響CD8⁺T細(xì)胞的浸潤(rùn)。所以說(shuō)腫瘤組織中β-catenin信號(hào)通路如果活化了，就不能夠產(chǎn)生CCL4也就不能活化CD8⁺T細(xì)胞，就造成了一個(gè)非T細(xì)胞浸潤(rùn)的表型。如果β-catenin信號(hào)通路是失活的，CCL4就能表達(dá)，就能造成T細(xì)胞浸潤(rùn)的表型。這樣對(duì)患者的預(yù)后就能起到一個(gè)很好的預(yù)示作用。

在患者進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)治療的時(shí)候，并不是所有患者都能受益。現(xiàn)在篩選患者是否需要進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)治療大多都是根據(jù)免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)來(lái)進(jìn)行定義，但也有越來(lái)越多研究顯示，一些突變，比如MSI突變最主要的一個(gè)因素就是免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，尤其是CD8⁺T細(xì)胞的浸潤(rùn)。如果患者沒(méi)有CD8⁺T細(xì)胞的浸潤(rùn)，很大程度上進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)治療是沒(méi)有意義的。

結(jié)果分析

本文有4張大圖：

• Fig.1在黑色素瘤內(nèi)篩選到了β-catenin信號(hào)通路與T細(xì)胞浸潤(rùn)互斥；

• Fig.2中重點(diǎn)提到了黑色素瘤小鼠抗腫瘤免疫始發(fā)減弱和真皮層CD103⁺樹(shù)突狀細(xì)胞減少；

• Fig.3重點(diǎn)闡述了β-catenin信號(hào)通路如何抑制CD103⁺樹(shù)突狀細(xì)胞的募集；

• Fig.4著重探討了重建Flt3配體樹(shù)突狀細(xì)胞的臨床意義，可以逆轉(zhuǎn)免疫治療抵抗。

Fig.1中作者是如何篩選到β-catenin信號(hào)通路的呢？

作者將腫瘤中CD8⁺T細(xì)胞浸潤(rùn)分為多與少兩部分，查看哪些通路存在差異。作者充分利用了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)將266例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤進(jìn)行了比較，一共分了8組。其中1、2、3組中的CD8⁺T細(xì)胞浸潤(rùn)少，6、7、8組中CD8⁺T細(xì)胞浸潤(rùn)多。分析工具用了Consensus ClusterPlus，基于CD8⁺T細(xì)胞特異性marker的表達(dá)。

Fig.1B就用熱圖展示β-catenin靶基因在Low與High兩群的表達(dá)情況。

發(fā)現(xiàn)分子表達(dá)高的話，T細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)要少；表達(dá)少，T細(xì)胞浸潤(rùn)多。

Fig.1C，就對(duì)CD8A的表達(dá)與c-MYC，TCF1和WNT7B進(jìn)行了相關(guān)性分析。

紅色表示T細(xì)胞gene signature高，藍(lán)色表示T細(xì)胞gene signature低

可以看到CD8A與PD-L1呈明顯的正相關(guān)。

為了驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果，F(xiàn)ig.1D進(jìn)行了免疫組化，觀察黑色素瘤組織中β-catenin與CD8的相關(guān)性。說(shuō)明了β-catenin與CD8⁺ T細(xì)胞的浸潤(rùn)是呈負(fù)相關(guān)的。

N=49

接下來(lái)，作者用了本文中最重要的一個(gè)轉(zhuǎn)基因黑色素瘤的小鼠模型。

模型做好后，作者就開(kāi)始分析了。首先檢測(cè)了CD3⁺ T細(xì)胞浸潤(rùn)，過(guò)表達(dá)的小鼠模型中T細(xì)胞浸潤(rùn)更少。

最后作者用了免疫熒光對(duì)T細(xì)胞浸潤(rùn)定位，結(jié)論和上面一樣。

Fig.2A-B，是流式細(xì)胞術(shù)展示 TCR-transgenic 2C T 細(xì)胞的富集與增殖，加了模式抗原后CD8⁺ T細(xì)胞比例明顯增多。這部分結(jié)果說(shuō)明了β-catenin通路抑制了腫瘤免疫的早期階段，抑制了T細(xì)胞的始發(fā)。

接下來(lái)主要關(guān)注在樹(shù)突狀細(xì)胞，因?yàn)樗蔬f抗原給CD8⁺ T細(xì)胞，對(duì)抗腫瘤免疫的始發(fā)起著至關(guān)重要的作用。樹(shù)突狀細(xì)胞有很多亞型，作者檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)CD8α⁺和CD103⁺樹(shù)突狀細(xì)胞存在顯著差異。

作者也用了一個(gè)典型的流式圖來(lái)說(shuō)明這一點(diǎn)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CD103的重要性，作者敲除了CD103后，發(fā)現(xiàn)小鼠模型中T細(xì)胞亞群的比例明顯下調(diào)。

將Flt3配體衍生的樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤內(nèi)注射到BP小鼠腫瘤中，流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤中CD3⁺ T細(xì)胞和CD103⁺ 樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)。

Fig.2的結(jié)果就是內(nèi)源性β-catenin通路主要是影響CD103⁺樹(shù)突狀細(xì)胞，來(lái)影響腫瘤免疫。

Fig.3中作者探討了β-catenin通路的主要機(jī)制。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)肯定是通過(guò)釋放趨化因子，作者用了表達(dá)譜芯片分析和qRT-PCR驗(yàn)證。

驗(yàn)證結(jié)果和表達(dá)譜結(jié)果是一致的，趨化因子表達(dá)都是下調(diào)的。進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果，做了YFP導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞。用qRT-PCR分析了YFP⁺ 和 CD45-/YFP- 細(xì)胞中Ccl3, Ccl4, Cxcl1和 Cxcl2的表達(dá)水平。

Ccl3在正常皮膚中也有表達(dá)，Cxcl2在Stroma中表達(dá)，兩者可以排除。Ccl4與Cxcl1都來(lái)自于腫瘤細(xì)胞。而從橫坐標(biāo)比值來(lái)看，Ccl4的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Cxcl1，因此作者重點(diǎn)就是做的Ccl4。

Ccl4的受體就是CCR5，作者用qRT-PCR 分析CD45⁺CD11c⁺細(xì)胞中CCR5的表達(dá)。

BP過(guò)表達(dá)以后，在黑色素瘤細(xì)胞上的CCR5也是下調(diào)的。

那Ccl4到底能不能影響樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)呢？作者用了細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組小鼠CCL4或條件培養(yǎng)基對(duì)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞遷移能力的影響，包括皮膚、淋巴結(jié)的樹(shù)突狀細(xì)胞。

可以看出加了CCL4后的樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)是明顯增多的。作者由此得出結(jié)論，β-catenin通路是通過(guò)影響CCL4的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用的。那β-catenin通路又是怎么來(lái)影響CCL4的表達(dá)呢？

β-catenin通路并不是直接調(diào)控，因?yàn)樗掠螞](méi)有CCL4的結(jié)合區(qū)域。作者根據(jù)以往文獻(xiàn)找到了β-catenin的經(jīng)典靶基因ATF3，再驗(yàn)證ATF3能抑制CCL4的表達(dá)。通過(guò)qRT-PCR分析ATF3在BPC小鼠中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于BP小鼠。

而之前也有文獻(xiàn)報(bào)道ATF3能有抑制CCL4的表達(dá)，作者用ChIP實(shí)驗(yàn)對(duì)這個(gè)結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證。CCL4在BPC小鼠中的結(jié)合區(qū)域明顯的比BP小鼠多。這部分結(jié)果說(shuō)明了，ATF3能直接調(diào)控CCL4的表達(dá)影響樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)。

Fig.3H中用了EILISA檢測(cè)，在48h時(shí)，BP細(xì)胞中的CCL4表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于BPC，ATF3則有相反的趨勢(shì)。這部分結(jié)果說(shuō)明了，CCL4在一定程度上是ATF3調(diào)控的。

Fig.4評(píng)估了這項(xiàng)研究的臨床意義，作者將活化的樹(shù)突狀細(xì)胞注射到BPC小鼠中。Fig.4A-B在免疫檢查點(diǎn)治療下，小鼠黑色瘤的生長(zhǎng)情況。

Fig.4C則是腫瘤內(nèi)進(jìn)行Flt3配體（Flt3-L）樹(shù)突狀細(xì)胞注射可以逆轉(zhuǎn)免疫治療抵抗。

套路分析

這篇文章用了一種倒推法。首先作者觀察到一個(gè)現(xiàn)象，腫瘤中CD8⁺ T細(xì)胞的浸潤(rùn)對(duì)免疫檢查點(diǎn)是否有效起到了決定性的作用?；诖?，將腫瘤中是否有T細(xì)胞浸潤(rùn)分為兩類，進(jìn)行比較。找出了β-catenin信號(hào)通路與其密切相關(guān)。

β-catenin信號(hào)通路是如何影響免疫細(xì)胞浸潤(rùn)呢，作者又發(fā)現(xiàn)了CD103⁺ DC在腫瘤組織中的浸潤(rùn)是不同的，這兩者是怎么發(fā)生聯(lián)系的呢？作者找到了β-catenin信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)ATF3，而ATF3又抑制了CCL4表達(dá)，CCL4又對(duì)CD103⁺ DC浸潤(rùn)起到了招募作用。CD103⁺ DC對(duì)T細(xì)胞的始發(fā)又是至關(guān)重要。