準(zhǔn)備
1. 電泳：RNA 專用 0.5×TBE 緩沖液、DEPC 水
2. 超凈工作臺(tái)：無 RNA 酶污染的槍頭及 EP 管（1.5、0.2 ml）、鑷子、1.5 ml EP 管架、離心管架、0.2 ml PCR 管架（200 μL 槍頭盒代替）污物缸。一次性薄膜手套和橡膠手套、衛(wèi)生紙、75% 乙醇、RNase Free 水、15 ml 離心管。
樣品處理：RNA 提取前的步驟
? 懸浮細(xì)胞
每 1 ml Trizol 可裂解 5×106 動(dòng)物、植物或酵母細(xì)胞，或 107 細(xì)胞。
? 貼壁細(xì)胞
1. 從培養(yǎng)箱取出細(xì)胞融合率達(dá)到 100% 的 T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去培養(yǎng)基。
2. 用彎頭滴管將殘余液體給吸去
3. 一個(gè)培養(yǎng)瓶 10 cm2 加入 1 mL Trizol，故加入 2.5 ml Trizol 裂解細(xì)胞， 用 1 ml 槍頭反復(fù)的吹打培養(yǎng)皿底的細(xì)胞，或用一次性注射器反復(fù)抽打直至裂解液清澈透明不粘稠，至少 2 分鐘，直至細(xì)胞全部溶解在 Trizol 中，Trizol 變清亮透明為止。如果裂解不徹底， 增加 Trizol 的量，確保一定要將所有細(xì)胞全部裂解。
用注射器吹打力度會(huì)比移液器的大，效果更好（注射器的剪切力更大，而 RNA 分子比較小，對剪切力有好的忍受力）。
4. 用 1 ml 槍頭吸入 15 ml 離心管，漩渦振蕩 30 秒，離心，將上清轉(zhuǎn)移至 3 個(gè) 1.5 mlEP 管中（2×1 ml+0.5 ml），放置于-80℃ 冰箱（室溫下可以儲(chǔ)存數(shù)小時(shí)，-60℃to-80℃ 下樣品可儲(chǔ)存至少一個(gè)月），或者馬上進(jìn)入下一步的 RNA 提取操作。
注意
1. Trizol 并不能馬上穿透細(xì)胞并保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的 RNA。這時(shí)細(xì)胞內(nèi)的 RNA 酶可以很輕易的降解尚在細(xì)胞內(nèi)的 RNA。所以必須盡快的讓細(xì)胞溶解。
2. 有些細(xì)胞比較難溶解，吹打的時(shí)間需要適當(dāng)延長。
3. 最高轉(zhuǎn)速離心的目的是為了去除一些沒有溶解的細(xì)胞（特別是當(dāng)細(xì)胞量太大，或者處理細(xì)菌時(shí)）。
4. 有效保存在 Trizol 中的 RNA 在常溫中可以放置 24 小時(shí)而 RNA 不降解， 建議采用干冰運(yùn)輸。
5. 如果細(xì)胞量多（大于 5x106 細(xì)胞量），建議取 200 uL 作為該樣本的備份。
RNA 提取簡要步驟
離心機(jī)預(yù)冷→樣品 1 ml，氯仿 200 μl（混勻靜置 2～3 min）→離心 12000 g/15 min（可以此時(shí)去配膠）→等體積異丙醇（靜置 10 min）→離心 12000 g/10 min→75% 乙醇 1 ml（揮發(fā)）（-20 ℃ 放一年，4 ℃ 放置 1 周）離心→RNase Free 水 30～50μl→Nano drop 測濃度→電泳→RNA -80 ℃ 儲(chǔ)存。
RNA 提取的詳細(xì)步驟
1. 離心機(jī)空轉(zhuǎn) 15 min 預(yù)冷至 4 ℃。
2. 取出 RNA 專用的氯仿、異丙醇、75% 乙醇、RNA free 水、1.5 mlEP 管及兩管樣品（Trizol 剛剛處理好或者處理好后凍存于 -20 ℃ 的細(xì)胞）、離心管架、EP 管架，紫外燈照射 30 min。
3. 加入 200μl 氯仿劇烈振蕩混勻 15 s，室溫靜置 2～3 min，分為 3 層，上層是水相、中層是變性蛋白、下層是有機(jī)層 （鮮紅色下層，含有蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸、細(xì)胞碎片和少量 DNA）。
注意
1. 1 mlTrizol 處理過的樣品加入 200 μl 氯仿。
2. 氯仿很重，請先靠近被加樣容器后再加樣。
3. 禁用漩渦振蕩器，否則基因組 DNA 易斷裂。
4. 離心 12 000 g，15 min，4 ℃。（準(zhǔn)備新的無 RNA 酶 EP 管）。
5. 離心之后有分層，上層含有 RNA，占總體積的 50%，傾斜 EP 管 45 度，吸出水相（注意不要吸到壁上的蛋白質(zhì)和下層的紅色液體）至新的 EP 管中，注意槍頭不要貼近管壁，分多次吸取，第二及第三次吸的過程小心不要吸到有機(jī)相吸至離有機(jī)相 2～3 mm 處即可。若同時(shí)提取 DNA 和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于 4℃ 冰箱， 若只提 RNA，則棄下層酚相。
6. 加入 500μl 異丙醇，混勻，靜置 10 min。
7. 離心 12 000 g，10 min，4 ℃，離心后底部有透明略白色的沉淀（太白是蛋白質(zhì)）輕輕倒掉液體，底部液可輕輕吸出（或直接用槍吸去，小心不要吸到底部沉淀）。
8. 加入 1 ml 75% 乙醇沉淀 RNA，輕輕混勻（此時(shí) -20 ℃ 下能存放一年，4 ℃ 下能存放一周），以洗去鹽離子（此時(shí)沉淀不會(huì)全部溶解）7 500 g，5 min，4 ℃ 底部有沉淀，棄去液體，靜置讓乙醇揮發(fā) （5～10 min）， 但不要讓 RNA 徹底干燥，這樣會(huì)導(dǎo)致它失去可溶性， 可用 200 μl 槍頭吸去殘余液體。
9. 加入 20～25 μl RNA Free 水/TE Buffer/0.5%SDS，RNA 沉淀立即溶解，或者 55～60 ℃ 水浴 5～15 min 。
注意
1. H2O、TE 或 0.5%SDS 均須用 DEPC 處理并高壓。
2. 如果 RNA 樣品是用于酶反應(yīng)，不要用 0.5% SDS 溶解 RNA。
10. 準(zhǔn)備 2 管 0.2 ml EP 管均分裝 1.5μl 的溶有 RNA 的溶液，帶上標(biāo)記筆、筆記本、小槍及小槍頭測濃度。
Nanodrop 測濃度
打開電源，開機(jī)→用 RNase 水洗兩遍→打開程序，選單位 ng/μl →滴加 RNase 水 2.5μl→點(diǎn)擊 blank→滴加樣品 1μl→點(diǎn)擊 measure（重測時(shí)需要用水洗后再測，不然曲線會(huì)重疊，不用再校正）。
11. 電泳的上樣量為 100ng ，RNA 濃度過高可用 RNase Free 水 調(diào)整 RNA可以用普通的電泳緩沖液，但是必須要更換新的電泳緩沖液，190v/10～20 min 評價(jià) RNA 的提取質(zhì)量。
A260/A280=1.8-2.0，太大說明 RNA 有降解，太小說明有蛋白質(zhì)污染；分成 2-3 條帶，5S 18S 28S，其中兩條的亮度為 1:2，上樣孔若有條帶則有基因組 DNA 污染。
12. RNA 的提取質(zhì)量比較好時(shí)將 1.5 ml EP 管內(nèi)的 RNA 儲(chǔ)存于 -80 度。
注意
1. 記得及時(shí)將濃度結(jié)果文件拷到優(yōu)盤，或者拍照。
2. 樣品吸出后，離心管里所剩樣品不多時(shí)，直接將槍頭打至離心管底部，不用再打至廢液缸中。
3. 離心機(jī)離心管，開蓋側(cè)朝下，要配平。
4. 吸水相時(shí)，不要傾斜太多，會(huì)吸到有機(jī)相，吸到就棄去不用或者再次離心。
5. 氯仿室溫放置就好，會(huì)揮發(fā)使整個(gè)冰箱都有氣味。
6. DEPC 劇毒物，活性很強(qiáng)，小心在通風(fēng)柜中使用。
7. 如果用于 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，即使有少量的基因組 DNA 也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)使用 Recombinant DNase I 進(jìn)行處理。
8. 選擇一個(gè)不會(huì)被空調(diào)風(fēng)或者其他外界氣流影響到的位置來操作 RNA 提取步驟。
DEPC 水用于配制電泳緩沖液和溶解 RNA（晚上操作比較好）。
1. 準(zhǔn)備：2L 平底試劑瓶，2L 量筒， 磁力攪拌子（合適的，不要太大也不要太小，太大轉(zhuǎn)不動(dòng)，太小旋轉(zhuǎn)的力度小，行成的漩渦小），DEPC，去離子水，黑色塑料袋/錫箔紙。
2. 加 2 mlDEPC 于裝有 2L 雙蒸水的遮光試劑瓶中（里面有磁力懸浮子，瓶子用袋子或者錫箔紙遮光），磁力攪拌器攪拌 12 h 以上（正好過夜）。
3. 第二天早上去掉黑色袋子，擰松蓋子，貼上高壓滅菌指示帶固定瓶口，高壓蒸汽滅菌 20 min，使殘余 DEPC 失活。
4. 將提籃從高壓鍋中取出靜置冷卻（大約一個(gè)上午），太燙拿出來會(huì)有大氣泡（CO2）冒出，擰緊瓶蓋室溫放置。
相關(guān) Protocol
細(xì)菌 DNA 提取
文章來源：Yolander
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