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同一個研究如何產(chǎn)出3篇高分文章

題目:蓖麻籽lnc-RNAs表達網(wǎng)絡與遺傳模式的差異分析

影響因子:5.901

合作單位:中科院昆明植物研究所

 

小知識

1

轉(zhuǎn)錄本


基因轉(zhuǎn)錄后通過可變剪切形成多種轉(zhuǎn)錄本,包含編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本(protein-codinggenes,PCgenes),以及不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本,如lncRNAs(long non-coding RNAs)。

2

種子結(jié)構(gòu)


一般由種皮、胚和胚乳三部分組成,胚為2倍體,發(fā)育為植株,胚乳為3倍體,提供營養(yǎng);蓖麻籽具有持久且發(fā)育穩(wěn)定的胚乳,可用于基因組劑量效應等研究。

3

甲基化


是DNA的修飾途徑之一,植物中存在CG,CHG,CHH三種常見的甲基化類型。

 

研究背景


模式植物中數(shù)以千計的lncRNAs被鑒定,目前僅有少量lncRNAs的功能已知,但已呈現(xiàn)出復雜多樣的功能特征和調(diào)控機制。在開花植物中,種子的發(fā)育受到十分關(guān)鍵、精細的遺傳和表觀遺傳控制。


蓖麻是非常重要的經(jīng)濟作物,此前作者與基迪奧合作已經(jīng)收獲了兩篇高分文章,文章1進行了蓖麻籽基因組印記的研究(IF:8.8)(戳這里),文章2 進行了胚與胚乳甲基化差異機制的研究(IF:6.8)(戳這里)。


這一次,走在熟悉的蓖麻籽小路上,作者緊跟lncRNAs的研究熱點,首先從lncRNAs差異表達及功能特征揭示其對胚與胚乳發(fā)育的調(diào)控,然后將文章1、文章2研究思路應用于lncRNAs的研究,從甲基化和基因組印記角度進一步揭示lncRNAs的差異機制。


該系列研究從2013年啟動以來,基迪奧生物長期持續(xù)地為合作方提供個性化生物信息服務,有力輔助了該項目持續(xù)產(chǎn)出三篇文章。

 

實驗方法


1

測序


ZB107和ZB306是蓖麻的兩個品系,收獲ZB107,ZB306自交和正反交(F1: ZB107×ZB306 and F1': ZB306×ZB107)授粉25天后(25DAP)的種子,以及ZB306×ZB107授粉35天后(35DAP)的種子。所有種子取胚和胚乳分別構(gòu)建鏈特異性文庫。

2

甲基化驗證


使用有/無5-氮胞苷(抑制DNA甲基化)的MS培養(yǎng)基處理胚,qRT-PCR定量lncRNAs。

3

lncRNAs驗證


差異表達lncRNAs定量測序;印記lncRNAs定量測序。

 

研究思路


圖1.研究思路

 

1

lncRNAs功能分析


1.1 lncRNAs特征


10個樣本序列組裝過濾后獲得5356lncRNAs,平均長度為803 nt。與擬南芥、水稻、等已知lncRNAs相比,蓖麻籽lncRNAs序列保守性極低,但位置保守性較高。16.3% lncRNAs與轉(zhuǎn)座子序列重疊(TE-lncRNAs)。

 

1.2 lncRNAs與PCgenes關(guān)聯(lián)


胚、胚乳組織中,lncRNAs的表達量顯著低于PCgenes的表達量。作者鑒定了順式(500 bp < 距離="">< 5kb)和反式(距離=""> 5 kb)lncRNAs與PCgenes、PCgenes啟動子的pair(圖2c),相關(guān)性分析呈現(xiàn)了較強的正相關(guān)(圖2d、2e)。

 

圖2 lncRNAs與PCgenes pair數(shù)目和相關(guān)性

 

1.3 胚、胚乳轉(zhuǎn)錄本表達量差異


相對于PCgenes,lncRNAs的組織特異性更高(圖3a),暗示胚、胚乳的發(fā)育差異源于轉(zhuǎn)錄本的表達量差異,尤其是lncRNAs。權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡分析(WGCNA)獲得13個模塊(圖3b),其中2個模塊(圖3c)與胚和胚乳的關(guān)聯(lián)最顯著:


1)模塊darkorange含在胚中高表達的轉(zhuǎn)錄本,主要為核糖體合成組裝,RNA剪切、轉(zhuǎn)運、降解等代謝,4種核心lncRNAs(圖3e)關(guān)聯(lián)的PCgenes與調(diào)控胚發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子相關(guān);   


2)模塊orange含在胚乳中高表達的轉(zhuǎn)錄本,主要為碳、氮、氨基酸、黃銅合成等代謝,核心lncRNAs關(guān)聯(lián)的PCgenes與糖酵解相關(guān)。


圖3 胚、胚乳中轉(zhuǎn)錄本(lncRNAs和PCgenes)共表達分析

a.轉(zhuǎn)錄本基因表達量熱圖  b.WGCNA分析的層次聚類樹 c. 模塊與組織特征的相關(guān)性 e.darkorange模塊的部分網(wǎng)絡圖,藍色與綠色分別表示lncRNAs和PCgenes

 

2

DNA甲基化對lncRNAs的調(diào)控

除了從lncRNAs功能角度分析樣本差異,作者還從lncRNAs被調(diào)控的角度更深入揭示上游DNA甲基化對樣本差異的影響。


胚乳中l(wèi)ncRNAs與PCgenes的 CG和CHG甲基化水平都低于胚,但胚乳和胚中CHH甲基化水平相近(圖4a)。比較lncRNAs及其上下游2kb區(qū)域內(nèi)甲基化水平與表達量的關(guān)系,作者發(fā)現(xiàn)lncRNAs表達量與三種甲基化水平都呈負相關(guān)(圖4b)。同時,胚體外實驗證明,去甲基化處理后84.4%的lncRNAs表達量上調(diào)(圖4c)。

圖4 a.胚、胚乳中轉(zhuǎn)錄本(lncRNAs和PCgenes)甲基化水平分析(En, 胚乳;Em,胚)

b. lncRNAs表達量與甲基化水平對比

c.胚體外甲基化實驗lncRNAs表達量

3

lncRNAs的遺傳模式


除了被DNA甲基化影響,作者認為lncRNAs的表達也有自己的遺傳模式,如基因組劑量效應、親源效應等。

 

3.1 基因組數(shù)量與來源對lncRNAs的影響


基于SNPs分子標記統(tǒng)計不同親本來源lncRNAs表達量,結(jié)果顯示,胚乳中,部分符合預期母本與父本2:1的比例(因為胚乳為3倍體,含母本基因組2份,父本1份)(圖6a),暗示基因組劑量效應對lncRNAs表達量有影響。對于小部分的偏差,作者補充了親源效應分析(圖6b),發(fā)現(xiàn)當親本中l(wèi)ncRNA表達量差異很大時,就會影響子代中母本與父本來源lncRNAs表達量的比例。


圖6 不同雜交系胚乳中等位lncRNAs的表達量

 

3.2 印記lncRNAs的鑒定與聚類


研究獲得20個母本印記lncRNAs,以及新的56個親本印記PCgenes。4種 lncRNAs驗證實驗顯示,3個符合預期的母本印記,1個表現(xiàn)出不完全印記(圖7)。

  

圖7 印記lncRNAs的表達量驗證

 

小結(jié)

作者充分利用前兩篇文章中甲基化與基因組印記的成果和經(jīng)驗,在此篇文章中結(jié)合lncRNAs數(shù)據(jù)進行了全面系統(tǒng)的差異分析,使生物學問題的研究更加充分深入,獲得主要成果如下:


1. 從lncRNAs豐度和功能角度初步揭示了造成胚、胚乳差異發(fā)育的原因;


2. 從DNA甲基化水平初步揭示了lncRNAs差異表達的原因;


3. 從基因組劑量效應、親源效應、基因組印記方面揭示了lncRNAs的遺傳模式。

參考文獻

 

Xu W, Yang T, Wang B, et al. Differentialexpression networks and inheritance patterns of long non‐coding RNA s in castorbean seeds[J]. The Plant Journal, 2018.


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