從臨床疾病的landscape或atlas構(gòu)建到實驗室每一個具體的研究項目，單細(xì)胞基因測序（Single Cell Sequencing）技術(shù)逐漸影響著生物醫(yī)學(xué)研究的方方面面。腫瘤的異質(zhì)性揭示：針對腫瘤組織總體水平的研究可能掩蓋掉一些惡性的腫瘤亞群特征，單細(xì)胞RNA測序技術(shù)可以從單個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平、基于PCA (principal component analysis)和t-SNE (t-distributed stochastic neighbour embedding )等常見的降維算法將混合細(xì)胞分群；通過分析不同亞群細(xì)胞的特征性基因，探索腫瘤、非腫瘤類的其他疾病或非疾病狀態(tài)下一些生命科學(xué)現(xiàn)象的分子機(jī)制。我們相信單細(xì)胞測序技術(shù)必將應(yīng)用到生物醫(yī)藥領(lǐng)域的各個研究方向，未來也可能真正應(yīng)用于臨床實踐中。
年齡所致的慢性炎癥是衰老的一個重要標(biāo)志，但其對特定細(xì)胞的影響尚不清楚。成纖維細(xì)胞存在于大多數(shù)組織中，有助于傷口愈合。同時，它也是應(yīng)用最廣泛的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)重編程的細(xì)胞類型，對再生醫(yī)學(xué)和再生策略有重要意義。2019年10月23日發(fā)表在 《Nature》的一篇題為“Heterogeneity in old fibroblasts is linked to variability in reprogramming and wound healing”的文章，作者利用單細(xì)胞RNA-seq技術(shù)（single-cell RNA sequencing）確定了老年小鼠傷口愈合中發(fā)揮不同作用的成纖維細(xì)胞亞群，它們具有不同的細(xì)胞因子表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。我們一起來就看看這篇研究。
研究解決什么科學(xué)問題？
研究需要解決的問題是：年齡是否影響成纖維細(xì)胞（fibroblast）炎癥特征及其iPS（induced pluripotent stem）細(xì)胞重編程能力？成纖維細(xì)胞亞群構(gòu)成在傷口愈合中的作用是怎樣的？
研究采用的模型
研究采用3個月青壯年小鼠和28-29個月老年小鼠耳部的fibroblast作為研究模型，分別檢測小鼠血漿、原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基、原代成纖維細(xì)胞iPS細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞因子的表達(dá)譜（圖1）。
圖1. 單細(xì)胞測序?qū)嶒災(zāi)Ｐ驮O(shè)計及樣本來源
研究發(fā)現(xiàn)了什么？
發(fā)現(xiàn)老年小鼠無論是血清或fibroblast來源樣本的細(xì)胞因子表達(dá)均顯著高于青壯年小鼠（圖2）。
圖2. 上：年齡依賴的不同種類細(xì)胞因子（促炎因子、抗炎因子、趨化因子、生長因子）在3種不同樣本中的表達(dá)水平。ND：未檢出。下：年齡對原代小鼠成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基中細(xì)胞因子表達(dá)譜的影響。MFI：平均熒光強(qiáng)度。
單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)老年小鼠的fibroblast表現(xiàn)出更多的炎癥激活狀態(tài)且與細(xì)胞的重編程能力相關(guān)（圖3）。
圖3. 來源于青壯年小鼠、老年小鼠（根據(jù)誘導(dǎo)重編程效率分為Good old、Bad old1、Bad old2 3組）成纖維細(xì)胞的PAGODA（pathway and gene set overdispersion Analysis）聚類分析
盡管傷口中位愈合率不受年齡的影響，但年老小鼠之間的傷口愈合率變異卻增加了，和年輕小鼠相比，有些年老小鼠的傷口愈合速度快，有些則慢（圖4）。
圖4. 不同分組（年輕、年老愈合快、年老愈合慢）小鼠的傷口愈合實驗（檢測不同時間點(diǎn)傷口面積、記錄愈合時間）
由于活化的THY1+PDGFRα+成纖維細(xì)胞本質(zhì)上較非活化狀態(tài)的THY1?PDGFRα+ 成纖維細(xì)胞重編程效率低。本文接著探索活化的成纖維細(xì)胞是如何影響重編程效率的，通過單細(xì)胞RNA-seq進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：不同的fibroblast亞群比例在年輕和年老小鼠中是不一樣的（圖5）。
圖5. 流式分選小鼠創(chuàng)傷模型組織中重編程能力較強(qiáng)的PDGFRα+Lin? 非活化成纖維細(xì)胞，單細(xì)胞測序分析成纖維細(xì)胞的亞群比例
為了明確創(chuàng)口邊緣的細(xì)胞組成特征，通過單細(xì)胞RNA-seq技術(shù)分析年老快速愈合和年老慢速愈合的小鼠傷口邊緣細(xì)胞的構(gòu)成情況，發(fā)現(xiàn)愈合緩慢的老年小鼠的傷口中成纖維細(xì)胞含量更高，而愈合快的老年小鼠的傷口中免疫細(xì)胞含量更高（圖6）。
圖6. 流式分選愈合好、愈合差小鼠創(chuàng)口邊緣活細(xì)胞，單細(xì)胞測序分析2組細(xì)胞亞群分類情況
綜上，單細(xì)胞測序技術(shù)可助力科研工作者解決一些實際性問題，如本文發(fā)現(xiàn)衰老與小鼠體內(nèi)細(xì)胞重編程和傷口愈合的變異性增加有關(guān)，發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子（如：TNF）是影響重編程效率的關(guān)鍵因素等。
成纖維細(xì)胞是老年人慢性炎癥的一個重要來源，可促進(jìn)免疫細(xì)胞的募集。活化的成纖維細(xì)胞(增殖)和老化的成纖維細(xì)胞（表現(xiàn)出細(xì)胞周期的永久停滯）分泌部分重疊但不完全相同的細(xì)胞因子。細(xì)胞因子之間可能以復(fù)雜的方式相互作用，最終影響細(xì)胞的重新編程和創(chuàng)傷愈合能力。傷口愈合對老年人來說至關(guān)重要，有缺陷的傷口愈合（可導(dǎo)致潰瘍）或過度的傷口愈合（可導(dǎo)致纖維化）均會不同程度地?fù)p害老年人的健康。隨著年齡的增長，成纖維細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子的組成變化可能導(dǎo)致傷口的愈合不良。這也為創(chuàng)傷患者的個體化治療提供了新的策略，以有效地促進(jìn)老年人的創(chuàng)傷愈合。
進(jìn)一步了解單細(xì)胞測序技術(shù)和應(yīng)用
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【參考文獻(xiàn)】
Heterogeneity in old fibroblasts is linked to variability in reprogramming and wound healing. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1658-5. Nature | Vol 574 | 24 OCTOBER 2019.
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