摘 要：目的 研究青礞石對戊四唑（pentylenetetrazol，PTZ）點燃癲癇大鼠腸道菌群的影響，從腸道微生態(tài)環(huán)境視角探討青礞石治療癲癇疾病可能的作用機制。方法 以青礞石粉末為研究對象，用PTZ點燃法建立大鼠癲癇動物模型，實驗分為對照組、模型組、卡馬西平組和青礞石組（高劑量組為臨床用量的20倍、低劑量組為臨床用量的5倍）。給藥4周后，取各組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物，通過16S rRNA測序?qū)Ω鹘M大鼠腸道菌群的多樣性進行分析，利用UPARSE、SPSS 18.0等對結(jié)果進行生物信息學及統(tǒng)計學分析。結(jié)果 α多樣性分析可知，模型組大鼠腸道菌群的Chao1、Ace豐富度指數(shù)與對照組相比沒有顯著性變化；與對照組、模型組相比，青礞石組尤其是高劑量組對細菌群落豐富度有顯著影響（P＜0.05）。Shannon、Simpson群落多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示，模型組與對照組無顯著性差異；青礞石組對群落多樣性干預不明顯。青礞石主要干預腸道菌群的豐富度、卡馬西平主要干預腸道菌群的多樣性。β多樣性各組層級聚類均能較好地分開，其中青礞石高劑量組與低劑量組部分樣本不能明顯分開，2組樣本可歸為一類，對照組、模型組可歸為一類，卡馬西平組單獨歸為一類。3D-主成分分析（3D-principal componentanalysis，3D-PCA）、3D-主坐標分析（3D-principalco-ordinates analysis，3D-PCoA）結(jié)果顯示，各組菌群結(jié)構(gòu)輪廓均能明顯分開，青礞石低劑量組介于對照組和模型組之間，菌群結(jié)構(gòu)輪廓部分與模型組、對照組有重合交叉，且有偏向?qū)φ战M的明顯趨勢。非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析結(jié)果顯示，對照組、模型組、青礞石組集中在一個區(qū)域，青礞石組與模型組、對照組有重合交叉，青礞石高劑量組、低劑量組對腸道菌群結(jié)構(gòu)有相似的干預效果。物種組成門水平分析可知，各組大鼠的優(yōu)勢菌群主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其中厚壁菌門占比最大，其次是擬桿菌門。模型組疣微菌門相對豐度較對照組顯著增加（P＜0.01），模型組變形菌門的相對豐度最高；青礞石干預后疣微菌門相對豐度下降，變形菌門相對豐度有不同程度降低。屬水平分析可知，與對照組相比，模型組中norank_f__Muribaculaceae（P＜0.05）、Akkermansia菌屬（P＜0.01）相對豐度顯著增加，乳桿菌屬顯著減少（P＜0.05）；青礞石干預后可降低Akkermansia菌屬、升高乳桿菌屬Lactobacillus的相對豐度。另外，線性判別分析效應大小（lineardiscriminant analysis effect size，LEfSe）分析可知厚壁菌門的瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）在模型組中顯著富集，給予青礞石干預后，瘤胃球菌科相對豐度顯著降低。結(jié)論 青礞石對PZT點燃癲癇大鼠腸道菌群物種組成的豐富度、多樣性具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可有效干預腸道微生態(tài)的重建。
青礞石Chloriti Lapis始載于宋《嘉祐補注神農(nóng)本草經(jīng)》（簡稱《嘉祐本草》），屬鎂類礦物藥，系變質(zhì)巖類黑云母片巖（biotite schist）或綠泥石化云母碳酸鹽片巖（mica carbonate by chloritization）。其性平，味甘、咸，歸肺、心、肝經(jīng)；具墜痰下氣、平肝鎮(zhèn)驚之功效，用于頑痰膠結(jié)、咳逆喘急、癲癇發(fā)狂、煩躁胸悶、驚風抽搐[1-3]。的關(guān)鍵通路，腸道菌群和大腦可以通過中樞和腸道神經(jīng)系統(tǒng)以及內(nèi)分泌、免疫和代謝途徑實現(xiàn)雙向溝通
在前期研究的基礎(chǔ)上[13-14]，青礞石對癲癇臨床療效可靠，本研究采用16S rDNA高通量測序技術(shù)對大鼠腸道菌群的多樣性進行分析，研究青礞石對PTZ點燃癲癇大鼠腸道微生物的影響，探討青礞石治療癲癇疾病可能的作用機制。1 材料
1.1 動物
清潔級雄性SD大鼠購于浙江省醫(yī)學科學院，合格證號：SCXK（浙）2019-0002，共40只，體質(zhì)量180～220 g。大鼠購入后適宜條件下適應性喂養(yǎng)1周，自由飲食飲水，動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，12 h晝夜交替，室溫20～24 ℃，相對濕度50%左右。動物實驗通過南京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的批準，批準文號為201910A0291.2 藥材與試劑
青礞石藥材由亳州礦石專營店提供（批號20140412），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室吳德康教授鑒定為青礞石ChloritiLapis，經(jīng)南京大學地球科學與工程學院孔慶友教授鑒定為變質(zhì)巖類黑云母片巖，樣品留存于南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室?？R西平片（批號X1395，北京諾華制藥有限公司）；戊四唑（pentylenetetrazol，PTZ）（批號1002905179，美國Sigma公司）；E.Z.N.A.? soil DNA試劑盒（Omega Bio-tek，美國）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，美國）；聚乙二醇400（PEG 400，化學純，上海凌峰化學試劑有限公司）。1.3 主要儀器
ABI GeneAmp?9700型基因擴增儀（ABI，美國）；NanoDrop2000超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）；DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠）。2 方法
2.1 動物模型的建立
2.2 給藥樣品的制備
卡馬西平片溶于生理鹽水，配成質(zhì)量濃度為0.02 g/mL的卡馬西平溶液。青礞石藥材去除石英等雜質(zhì)，置瑪瑙研缽中研磨成細粉，過藥典6號篩，用PEG 400為介質(zhì)配成0.5 g/mL青礞石混懸液，每次給藥前超聲混勻。2.3 分組、給藥與采樣
2.4 小腸內(nèi)容物DNA提取和高通量測序
依據(jù)E.Z.N.A.? soil DNA試劑盒說明書進行細菌總DNA提取，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000超微量分光光度計進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）擴增細菌16S rRNA的V3-V4可變區(qū)。PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠進行回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST檢測定量，Illumina Miseq平臺進行測序。本研究的測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。2.5 生物信息學和統(tǒng)計分析
2.6 統(tǒng)計分析
實驗數(shù)據(jù)以表示，應用SPSS 18.0進行分析，2組間比較采用LSD檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。3 結(jié)果
3.1 大鼠一般情況及模型建立
各組大鼠體質(zhì)量隨時間增加，增速相似，無明顯差異。造模大鼠1周左右毛色逐漸發(fā)黃，第2周開始出現(xiàn)Ⅱ級驚厥反應，造模第4周，大鼠出現(xiàn)Ⅱ級及以上驚厥反應；造模測試中，大鼠多出現(xiàn)連續(xù)5次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥反應，達到PTZ點燃癲癇大鼠模型標準。32只大鼠用于PTZ模型制備，過程中死亡8只，造模成功率為75.0%。3.2 OTU及稀釋曲線分析
對各組大鼠腸道內(nèi)容物樣品中細菌16S rRNA（V3-V4區(qū)）進行PCR擴增和測序分析，共得到1 360 324條有效序列。物種OTU數(shù)目排序等級與豐度曲線顯示，各組曲線平滑下降，表明各組大鼠內(nèi)容物菌群物種豐富、多樣性程度較高，物種均勻度較好，見圖1-a。Pan物種分析顯示隨著樣本數(shù)目的增加，各組總OTU數(shù)目增加趨勢逐步減緩并趨于恒定（曲線上升趨于平緩），見圖1-b；Core物種分析顯示隨著樣本數(shù)目的增加，各組樣本共有的OTU數(shù)目逐漸下降并趨于恒定（曲線下降趨于平緩），見圖1-c。采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與其所能代表各分類學水平的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，結(jié)果物種數(shù)目在2000以上時，Shannon稀釋曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，提供樣本足夠多，測序深度可靠，見圖1-d。
3.3 腸道菌群α多樣性分析
各組大鼠Chao 1、Ace細菌群落豐富度指數(shù)和Shannon、Simpson群落多樣性指數(shù)，見圖2。結(jié)果顯示，模型組大鼠細菌群落的Chao 1、Ace豐富度指數(shù)與對照組相比沒有顯著性變化；與對照組、模型組相比，青礞石組尤其是高劑量組對群落豐富度有較大影響，卡馬西平組對群落豐富度沒有顯著性影響。Shannon、Simpson群落多樣性結(jié)果顯示，模型組與對照組無顯著性差異；與對照組、模型組相比，卡馬西平組有顯著性影響，青礞石組對群落多樣性干預不明顯。結(jié)果表明，用PTZ點燃法制備癲癇大鼠模型對其腸道菌群的豐富度、多樣性沒有顯著性影響；青礞石主要干預腸道菌群豐富度、卡馬西平主要干預腸道菌群的多樣性。3.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)β多樣性分析
在OTU水平對大鼠腸道菌群進行層級聚類分析及3D-PCA、3D-PCoA、NMDS分析，見圖3。層級聚類結(jié)果顯示，對照組、模型組、卡馬西平組及青礞石組樣本基本能分開歸類，對照組、模型組可歸為一類，青礞石高、低劑量組可歸為一類，卡馬西平組單獨歸為一類，部分模型組樣本與青礞石組歸為一類。說明各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變化，且青礞石高、低劑量組對腸道菌群結(jié)構(gòu)有相似的干預效果。3D-PCA、3D-PCoA分析結(jié)果顯示，對照組、模型組、卡馬西平組、青礞石組菌群結(jié)構(gòu)輪廓均能明顯分開，除少數(shù)樣本外，各組多數(shù)樣本能較為集中分布，大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。青礞石低劑量組介于對照組和模型組之間，部分與模型組、對照組重合交叉，且有向?qū)φ战M偏離的明顯趨勢。說明青礞石、卡馬西平對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)均有明顯的干預作用，青礞石低劑量組對腸道菌群結(jié)構(gòu)的干預更趨近于對照組。卡馬西平組、青礞石高劑量組對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響差異性更大。NMDS分析結(jié)果顯示，對照組、模型組、青礞石組集中在一個區(qū)域，青礞石低劑量組與高劑量組、模型組、對照組均有交叉重合，說明青礞石高、低劑量組對腸道菌群結(jié)構(gòu)有相似的干預效果，且有利于PTZ癲癇大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)恢復與重建。以上結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致。3.5 腸道菌群物種組成分析
如圖6所示，在屬水平上，各組大鼠中主要優(yōu)勢菌群有28種（圖6-a），其中具有顯著差異的菌群有7種（圖6-b），分別是norank_f_Muribaculaceae、乳桿菌屬Lactobacillus、unclassified_f_ Lachnospiraceae、梭菌屬Clostridium_sensu_stricto_ 1、unclassified_f_Ruminococcaceae、擬桿菌屬Bacteroides、Turicibacter菌屬。與對照組大鼠相比，模型組大鼠中norank_f_Muribaculaceae、Akkermansia相對豐度顯著增加，乳桿菌屬顯著減少（圖7-a）。給予青礞石、卡馬西平干預后，乳桿菌屬相對豐度顯著升高，Akkermansia菌屬相對豐度降低。乳桿菌屬的相對豐度各組存在顯著差異（對照組25.14%，模型組10.00%，卡馬西平組38.06%，青礞石高劑量組15.56%，青礞石低劑量組16.41%，P＜0.01）。青礞石對癲癇大鼠中乳桿菌屬、Akkermansia菌屬具有趨向?qū)φ战M的調(diào)節(jié)作用（圖7-b、c）。3.6 LEfSe多級物種差異判別分析
采用線性判別效應大小LEfSe分析（linear discriminant analysis）方法，比較各組大鼠從門到屬的菌群變化，分析青礞石與癲癇可能相關(guān)的特定菌，見圖8。結(jié)果顯示，各組大鼠腸道菌群差異顯著，不同劑量青礞石干預后大鼠腸內(nèi)的擬桿菌門相對豐度顯著增加。疣微菌門及Akkermansia菌屬在降低，接近對照組。厚壁菌門瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）微生物在模型組大鼠腸內(nèi)呈顯著富集，青礞石給藥后富集程度均降低。4 討論
4.1 青礞石對PTZ點燃癲癇大鼠腸道菌群的干預
青礞石對PTZ點燃癲癇大鼠腸道菌群的物種組成的豐富度、多樣性具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可達到腸道微生態(tài)的重建。3D-PCA、3D-PCoA分析結(jié)果顯示，各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，菌群結(jié)構(gòu)輪廓明顯分開，青礞石組對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有明顯的干預作用。模型組大鼠腸道內(nèi)容物中檢測的疣微菌門比例較對照組大鼠顯著增加（P＜0.01），青礞石、卡馬西平干預后，疣微菌門比例均顯著減少（P＜0.05），與相關(guān)研究結(jié)果一致，疣微菌門與神經(jīng)性疾病密切相關(guān)，可能是影響癲癇的發(fā)生、發(fā)展的重要菌門之一，疣微菌門對癲癇的發(fā)生、發(fā)展具有促進作用[18-19]。青礞石能顯著降低癲癇大鼠變形菌門的相對豐度，變形菌門的異常高表達在癲癇大鼠體內(nèi)可引起炎癥反應，主要物種組成的厚壁菌門和擬桿菌門尚可通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸對腸道免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生積極的調(diào)節(jié)作用[20]。癲癇大鼠中乳桿菌屬相對豐度顯著降低，Akkermansia菌屬顯著增加，給予不同劑量的青礞石后，乳桿菌屬的相對豐度顯著上升，Akkermansia菌屬顯著降低。乳桿菌能夠增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的含量，控制神經(jīng)元的異常放電，從而抑制癲癇的發(fā)作，乳Bagheri等[23]給予癲癇大鼠益生菌干預后發(fā)現(xiàn)GABA增加，癲癇的發(fā)展程度顯著降低。Akkermansia菌屬與神經(jīng)疾病有關(guān)，對癲癇的發(fā)作、發(fā)展具有重要的影響[18-19]。在Lum等[24]研究中模型組大鼠中瘤胃球菌科相對豐度也顯示出升高趨勢，治療組大鼠中瘤胃球菌科相對豐度有不同程度地降低。本研究LEfSe分析結(jié)果顯示，瘤胃球菌科屬于厚壁菌門，青礞石干預后能降低癲癇大鼠瘤胃球菌科相對豐度。瘤胃球菌科與谷氨酸、谷氨酰胺呈正相關(guān)[25]，谷氨酸作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對癲癇的發(fā)生具有促進作用。癲癇的發(fā)作涉及神經(jīng)元電活動的異常陣發(fā)性變化，并與興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的不平衡有關(guān)[26]。青礞石可能通過對癲癇大鼠免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生了積極的調(diào)節(jié)作用，通過降低體內(nèi)的炎癥反應或調(diào)節(jié)興奮性、抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，最終達到干預癲癇的發(fā)作、發(fā)展過程。4.2 礦物元素與腸道菌群密切相關(guān)
青礞石屬于鎂類礦物藥，主要為含K、Mg、Fe、Al的硅酸鹽 [K(Mg·Fe)2(A1Si3O10)(OH,F)2]，主含Si、Fe、Mg、Al、Ca、K、Na，尚含Li、Ba、Ni、Zn、Ti、Sr、Se、Mo、Mn、Co、V、Sn等多種金屬元素[27-29]。研究表明，礦物元素與腸道菌群存在復雜的協(xié)同拮抗作用，對腸道微生態(tài)的重建有重要的影響[30-32]。研究發(fā)現(xiàn)，Wilson病患者腸道內(nèi)厚壁菌門豐度與糞便Cu濃度呈負相關(guān)，擬桿菌門豐度與糞便中Cu濃度呈正相關(guān)[30]。梭菌屬、擬桿菌屬、Alistipes屬、嗜膽菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、Cloacibacillus屬、博代氏桿菌屬和Kerstersia屬等腸道微生物具有一定的砷抗性，Fe可改變結(jié)腸腸道微生物結(jié)構(gòu)從而影響砷的甲基化和毒性[31]。給予仔豬含過量Fe的飼料，通過檢測其腸道菌群含量的變化，發(fā)現(xiàn)由于存在大量Fe2+仔豬腸道通透性增加，炎癥加劇，增強了細菌的易感性[32]。4.3 癲癇與“腦-腸軸”
癲癇的發(fā)作常伴有胃腸道功能異常，如惡心、嘔吐、腹瀉等，癲癇患者腦電圖中的點纖薄與腸道蠕動波具有相關(guān)性[33-34]，這些均說明癲癇的發(fā)作、發(fā)展與胃腸道系統(tǒng)密切相關(guān)。腸道菌群不僅通過神經(jīng)系統(tǒng)，而且通過內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)對大腦產(chǎn)生影響，這種腸道和大腦之間的雙向通信稱之為“腦-腸軸”[8]?！澳X-腸軸”是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）和多種腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）將大腦和腸道功能聯(lián)系起來的雙向應答系統(tǒng)。例如，腸道微生物可產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)，通過迷走神經(jīng)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)；腸道微生物可作用于免疫系統(tǒng)，使血液中促炎細胞因子和抗炎細胞因子水平發(fā)生改變，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，改變腦功能；腸道微生物通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)細胞激素的分泌，如腦腸肽、瘦素等物質(zhì)直接作用于腦，實現(xiàn)腦和腸之間的信息交流[35-36]。有研究對PTZ點燃癲癇大鼠給予益生菌處理，與模型組相比，益生菌處理后的大鼠癲癇發(fā)作程度顯著下降，水迷宮結(jié)果更優(yōu)且具有顯著性，腦組織中GABA濃度顯著提升[22]。黃曉利等[37]研究癲癇兒童腸道微生物、Th17細胞水平和血清中白細胞介素-6（interleukin，IL-6）、IL-17A等含量的變化，結(jié)果顯示模型組較對照組在屬水平上菌群呈顯著差異，模型組雙歧桿菌、擬桿菌、放線菌比例顯著低于對照組，厚壁菌、變形菌比例及阪崎腸桿菌比例顯著高于對照組（P＜0.05），其中阪崎腸桿菌感染可導致發(fā)育緩慢及癲癇、腦膜炎等發(fā)生，可能是引發(fā)癲癇的原因之一。與炎癥反應有關(guān)的Th17細胞、IL-6及IL-17A水平在模型組中顯著升高，而雙歧桿菌數(shù)量顯著降低，研究表明雙歧桿菌可降低Th17細胞表達和IL-17A的分泌，雙歧桿菌的減少可促進癲癇的發(fā)展。大量研究證實，人體內(nèi)存在的“腦-腸軸”是大腦和胃腸道之間關(guān)鍵調(diào)控通路，而腸道菌群為該通路的重要參與者，腸道菌群可通過“腦-腸軸”的3條途徑（免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌和迷走神經(jīng)）對大腦發(fā)揮作用，影響大腦發(fā)育、功能和行為。腸道微生物青礞石中礦物元素通過對腸道菌群的影響，干預“腦-腸軸”這一關(guān)鍵調(diào)控通路，對大腦發(fā)揮作用。腸道微生物群對外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，導致腸軸”雙向通信途徑產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)、相關(guān)炎癥因子及Na+、K+、Ca2+等離子通道變化減緩神經(jīng)細胞去極化反應及爆發(fā)性放電可能為青礞石治療癲癇、發(fā)揮效應的關(guān)鍵因素。利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
參考文獻（略）
來 源：袁 鵬，馬瑜璐，劉圣金，房 方，楊文國，卞 勇，徐晨昱，張志杰，奧·烏力吉，段金廒．礦物藥青礞石對戊四唑點燃癲癇大鼠腸道菌群的影響 [J]. 中草藥, 2021, 52(7): 2011-2023 .
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