定量PCR又被稱Real-time PCR或是Quantitative Real-time PCR（以下簡稱Q-PCR）?，F(xiàn)在很多實(shí)驗(yàn)室都有涉及到這一實(shí)驗(yàn)技術(shù)，這篇文件將講述Q-PCR的原理，實(shí)驗(yàn)過程以及一些問題分析。
Q-PCR是利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析。
擴(kuò)增曲線：反應(yīng)了Q-PCR動態(tài)進(jìn)程的曲線。如圖1
熒光閾值：前15個(gè)循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），熒光閾值的默認(rèn)設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，如果手動設(shè)置則設(shè)置大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，進(jìn)入指數(shù)期的最初階段。如圖1
CT值：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。如圖1
Ct值定量的數(shù)學(xué)原理
1. 理想的PCR反應(yīng)：
Xn＝X0*2n
n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)；X0起始模板數(shù)量；Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量
2. 非理想的PCR反應(yīng)：
Xn＝X0*(1+En)n
n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)；X0起始模板數(shù)量；Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量；En：擴(kuò)增效率
在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)
（1）XCt＝X0*(1＋En)Ct＝M
XCt:：熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為M
方程式：
（1）兩邊同取對數(shù)得
（2）Log2M＝Log2X0 *(1＋En)Ct
整理方程式（2）：
Log2X0= Log2M - Ct Log2(1＋En)
因此起始模板量的log值與CT值成線性關(guān)系，模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。
常用熒光定量標(biāo)記方法
1. 非特異性熒光標(biāo)記：SYBR Green I
這是一種最為常用的熒光標(biāo)記。它是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，SYBR Green I的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。如圖2
SYBR Green I 染料法——優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)：使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針；具有價(jià)格優(yōu)勢
缺點(diǎn)：無模板特異性；對引物特異性要求較高；不能進(jìn)行多重定量；靈敏度相對較低
2. Taqman 探針法
5’ 端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等。如圖3
3’ 端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)。如圖3
探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，但是Taq酶有5’→3’ 外切核酸酶活性，在PCR進(jìn)行時(shí)，可水解探針將R與Q分開，R就能發(fā)熒光。如圖3
Taqman 探針法——優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)：高度特異性；重復(fù)性好；靈敏度高；可進(jìn)行多重定量
缺點(diǎn)：只適合一個(gè)特定的目標(biāo)；委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高；不易找到本底低的探針
Q-PCR引物設(shè)計(jì)原則（主要是SYBRGreen I 染料法，★數(shù)量代表了優(yōu)先程度）
Q-PCR的流程（主要是SYBR Green I 染料法）
1. RNA抽提：利用試劑盒或是傳統(tǒng)的Trizol抽提樣本總RNA。之后利用NanoDrop或是Qubit對抽提的RNA進(jìn)行濃度測定，并進(jìn)行電泳檢測，確定RNA的完整性。
2. 反轉(zhuǎn)錄：每個(gè)樣本根據(jù)濃度選取相同的量進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍混勻后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3. Q-PCR：更具不同試劑盒所提供的反應(yīng)體系配置。因?yàn)镾YBR Green染料在強(qiáng)光的照射下會對染料造成影響。但是其實(shí)也不用過分的小心。一般來說Q-PCR的操作環(huán)境要求在沒有DNA和RNA污染的環(huán)境且沒有DNA酶。因此需要實(shí)驗(yàn)室有一個(gè)專門的定量房間，如果實(shí)驗(yàn)室條件不允許也可以在超凈臺中進(jìn)行操作，并佩戴無菌乳膠手套。由于染料對光線敏感，操作時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光的照射，如果操作允許，可以適當(dāng)降低環(huán)境燈光亮度，但不必過分擔(dān)心，主要還是操作過程要快。加完樣品后上機(jī)PCR。
4. 數(shù)據(jù)分析：主要是看擴(kuò)增曲線，CT值，以及溶解曲線。
以上就是Q-PCR的一個(gè)大致流程，所有實(shí)驗(yàn)中遇到的試劑或是耗材都要求無菌無RNase以及DNase。
實(shí)驗(yàn)中可能會遇到的問題：
CT值一般來說如何才是理想的？
答：一般來說CT值在30以下都可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的，如果CT值大于30那么基本上可以說明該基因沒有擴(kuò)增。但這也不是絕對的，還可以通過分析產(chǎn)物電泳結(jié)果，也可以分析溶解曲線。
溶解曲線如何分析？
答：一般正常的溶解曲線的峰應(yīng)該出現(xiàn)在80℃以上且有且只有一個(gè)單一的峰，這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。如下圖。
如果出現(xiàn)雙峰，則說明有非特異擴(kuò)增或是有引物二聚體（如下圖），這樣就需要電泳檢測是引物二聚體還是非特異擴(kuò)增。如果是引物二聚體那么可以適當(dāng)降低引物濃度或是提高退火溫度。如果是非特異擴(kuò)增則除了提高退火溫度外還可以重新設(shè)計(jì)新的引物。
為什么我的三個(gè)復(fù)孔間的CT值差異巨大？
答：這可能是因?yàn)榕渲没鞓雍鬀]有充分混勻，導(dǎo)致三個(gè)復(fù)孔間會出現(xiàn)差異。還有一種可能就是引物設(shè)計(jì)缺乏特異性或是引物與模板不匹配，這樣也會導(dǎo)致復(fù)孔的結(jié)果出現(xiàn)差異，建議充分混勻反應(yīng)mix，還是不行則考慮重設(shè)引物。
為什么我的內(nèi)參的CT值也很高超過30？
答：先確定你的引物是否來源于成熟的文獻(xiàn)，也就是排除引物的問題。如果確定引物無為題，那就有可能是RNA的抽提時(shí)出現(xiàn)了降解導(dǎo)致了RNA片段的不完整，這樣就需要重新抽提RNA并反轉(zhuǎn)。如果內(nèi)參基因是自己設(shè)計(jì)的，那就需要重新驗(yàn)證該基因的可行性，盡量選擇成熟有過驗(yàn)證的內(nèi)參基因。
為什么我做的基因包括內(nèi)參基因的溶解曲線都有雙峰？
答：這種情況就說明有基因組DNA的污染。在反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，cDNA需要進(jìn)行簡單的基因組排除驗(yàn)證，利用有跨越內(nèi)含子的引物做PCR。模板利用cDNA以及基因組DNA，看條帶大小。一般來說以cDNA為模版的產(chǎn)物小于基因組的產(chǎn)物。條件允許的可以選擇帶有去基因組酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒。
為什么我同一個(gè)基因做不同的樣本有的樣本的CT特別低，擴(kuò)增曲線很早就起峰？
答：這是由于模板的起始濃度過高，可以嘗試稀釋模板，因?yàn)槟０鍧舛冗^高不利于Q-PCR。
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