揭開這些機(jī)制可能是找到CRISPR-Cas系統(tǒng)新的生物技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。例如，最受歡迎的CRISPR-Cas9是II型系統(tǒng)，它采用的是從間隔序列轉(zhuǎn)錄的RNA分子指導(dǎo)酶切割入侵的病毒或質(zhì)粒DNA。但是在去年6月發(fā)現(xiàn)的VI型系統(tǒng)中的酶切割的是RNA，而不是DNA。另外IV型系統(tǒng)包含一些與CRISPR-Cas相關(guān)的基因，但缺乏重復(fù)和插入間隔序列的機(jī)制。
Francisco Mojica不是第一個發(fā)現(xiàn)CRISPR的，但他可能是第一個為它神魂顛倒的科學(xué)家。他記得1992年的那一天，當(dāng)他第一次看到這個即將開啟生物技術(shù)革命的微生物免疫系統(tǒng)。當(dāng)時他正在審視嗜鹽微生物Haloferax mediterranei的基因組序列數(shù)據(jù)，并注意到14個不尋常的DNA序列，每個30個堿基長。這些序列大致相同，正向和和反向，每35堿基左右重復(fù)一次。很快，他發(fā)現(xiàn)了更多這樣的序列。Mojica為此著迷，并以此作為他在西班牙阿利坎特大學(xué)的一個研究焦點(diǎn)。
這是一個不一般的決定，Mojica實(shí)驗(yàn)室多年來缺乏資金。在各種會議上，Mojica會“逮住”每個可以找到的重要人物，詢問他們對這些奇怪的小重復(fù)序列的看法。但他們警告Mojica說，“不要太在乎這些重復(fù)。在許多生物體中有很多重復(fù)，很多年前我們就已經(jīng)知道了，但仍不清楚它們中有多少是有用的。”
如今，科學(xué)家們越來越了解這種被命名為CRISPR（成簇規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列） 的元件，并且將其作為了一種研究工具，然而雖然大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)的研究人員更關(guān)注的是CRISPR-Cas9如何用于編輯基因，但是Mojica和其他微生物學(xué)家仍然 希望了解有關(guān)這個系統(tǒng)的一些基本問題及工作原理：它是如何演變的？如何影響微生物進(jìn)化的？為什么一些微生物中有這一系統(tǒng)，而其它的則不呢？也許CRISPR還有其它未知的基本生物學(xué) 功能？
“媒體大多將注意力放在了作為一種技術(shù)的CRISPR系統(tǒng)，當(dāng)然這有很好的理由，這也是我們發(fā)現(xiàn)的令人難以置信的作用和機(jī)會。但是與此同時，還有很多有趣的基礎(chǔ)生物學(xué)研究。”加州大學(xué)伯克利分校生物學(xué)家Jennifer Doudna說，她是首位將CRISPR-Cas作為一種基因編輯工具的科學(xué)家之一。
CRISPR-Cas的生物學(xué)優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)很清楚了。原核生物，包括細(xì)菌和古細(xì)菌（一類不太知名的單細(xì)胞生物，其中許多生活在極端環(huán)境中）都需要面對遺傳侵略者的不斷攻擊。病毒的數(shù)量可能比原核生物多出十倍，據(jù)說每兩天能殺死全世界一半的細(xì)菌。原核生物還會交換被稱為質(zhì)粒的DNA碎片，其中包括寄生生物，它們從宿主中獲取資源，如果宿主試圖驅(qū)逐它們，機(jī)體分子就會迫使其自毀。這世界上似乎沒有什么地方是安全的，從土壤到海洋，再到地球上最荒涼最不適合生存的地方，遺傳入侵者們一直都存在。
原核生物在進(jìn)化過程中已經(jīng)發(fā)展出了許多武器來應(yīng)對這些威脅。例如，在特定識別序列處或附近用于切割DNA的酶。但這些防御 并不靈敏，每種酶被需要編程才能識別某些序列，而且只有當(dāng)微生物具有正確基因的拷貝時才受到保護(hù)。CRISPR-Cas動態(tài)性更強(qiáng)，這類似于人體抗體感染后 發(fā)展出的長期免疫方式，能進(jìn)化和記住特殊的遺傳入侵者。
荷蘭瓦赫寧根大學(xué)的微生物學(xué)家John van der Oost說：“我們首次聽說這個假說時，認(rèn)為這對于簡單的原核生物來說太復(fù)雜了?！?/p>
Mojica等人從位于與病毒基因組有時匹配的CRISPR回文重復(fù)之間的DNA序列中，推導(dǎo)出CRISPR-Cas的功能。從那時起，研究人員就發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌和古細(xì)菌暴露于特定的病毒或質(zhì)粒后，某些CRISPR相關(guān)（Cas）蛋白會將這些間隔序列添加到基因組中。由這些間隔序列生成的RNA能指導(dǎo)其它Cas蛋白切斷所有匹配序列的入侵DNA或RNA。
那么細(xì)菌和古細(xì)菌如何出現(xiàn)這種復(fù)雜的免疫系統(tǒng)的呢？
這個問題還沒有答案，但多數(shù)人認(rèn)可的是，這個系統(tǒng)來自轉(zhuǎn)座子，也就是可以從基因組中的一個位置跳到另一個位置的“跳躍基因”。美國國家衛(wèi)生研究院的進(jìn)化生物學(xué)家Eugene Koonin在馬里蘭州貝塞斯達(dá)和他的同事發(fā)現(xiàn)了一類編碼蛋白Cas1的可移動遺傳元件，Cas1參與間隔序列插入基因組的過程。這些“casposons（轉(zhuǎn)座子元件，生物通注）”可能就是CRISPR-Cas免疫的起源。研究人員現(xiàn)在正在努力了解這些DNA如何從一個地方跳到另一個地方，之后他們還會追蹤這種機(jī)制如何演化成復(fù)雜的CRISPR-Cas機(jī)制的。
近年來的一些研究已經(jīng)解釋了關(guān)于Cas蛋白如何添加到間隔序列中的許多分子細(xì)節(jié)，但是病毒DNA在化學(xué)上幾乎與宿主DNA相同。那么在包裝有DNA的細(xì)胞中，蛋白如何指導(dǎo)是哪些DNA添加到了CRISPR-Cas“記憶”中？
這種風(fēng)險很高：如果一種細(xì)菌不小心添加了一種自己的DNA，它可能會通過自身免疫自殺。正如立陶宛維爾紐斯大學(xué)的生物化學(xué)家Virginijus Siksnys所說的：“這些酶是一把雙刃劍?！?/p>
來自北卡羅來納州立大學(xué)的微生物學(xué)家 Rodolphe Barrangou認(rèn)為，這可能是因?yàn)榧?xì)菌和古細(xì)菌的龐大群體能承受一些錯誤：一些細(xì)胞自殺可能無關(guān)緊要，只要其它細(xì)胞可以在病毒攻擊后繼續(xù)茁壯成長就行。
事實(shí)上，當(dāng)病毒入侵一個細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)時，通常1000萬個細(xì)菌中只有大約一個細(xì)菌能正確獲得一個間隔序列用以自衛(wèi)?？赡苄?這么低，因此針對驅(qū)動間隔序列的因素進(jìn)行研究很困難。
同樣，要了解為什么只有這個細(xì)胞能夠成功也很困難?！霸趯?shí)際發(fā)生時很難捕獲這個‘成功的’細(xì)菌，”洛克菲勒大學(xué)微生物學(xué)家Luciano Marraffini解釋道。
尋找確定合適間隔序列的方法，并提高它們的整合速率，將會有助于解開這個謎題。一些研究表明包含有CRISPR-Cas機(jī)制的細(xì)胞或許將其作為一種記錄裝置，對它們所遇到的DNA和RNA序列進(jìn)行分類。這也許同樣也能讓研究人員追蹤一段時間內(nèi)接觸環(huán)境化學(xué)物質(zhì)后細(xì)胞的基因表達(dá)。
此外研究人員還希望能了解如何修剪舊的記憶，大多數(shù)帶有CRISPR-Cas系統(tǒng)的微生物都含有幾十個間隔序列，也有的只有一個。相反，古細(xì)菌Sulfolobus tokodaii則擁有5個CRISPR-Cas系統(tǒng)，包括458個間隔序列，占用了其基因組的1％之多。看起來好像沒有必要一直保留舊的間隔Spacer，因?yàn)槿绻《就ㄟ^突變以逃避CRISPR-Cas，那么間隔序列就會過時。而且保留額外的DNA可能會成為微生物的負(fù)擔(dān)?！耙环N細(xì)菌不能無限制地擴(kuò)張其基因組，”以色列魏茨曼科學(xué)研究所遺傳學(xué)家Rotem Sorek說。
No.3 CRISPR還有其它的作用嗎？
一些間隔序列的起源帶來新的問題：目前觀察到的間隔序列中能與DNA數(shù)據(jù)庫中任何已知序列匹配的不超過3％。
這也就是說我們對病毒可能還知之甚少，大多數(shù)測序工作都集中在那些會感染人，牲畜或作物的病毒上。佐治亞大學(xué)的RNA生物學(xué)家Michael Terns說：“我們對細(xì)菌的敵人，特別是古生菌的敵人知之甚少?！?/p>
還有一種可能是，一些間隔序列是病毒的“鬼魂”，也就是已經(jīng)不存在的，或者經(jīng)過突變“認(rèn)不出了”的序列。第三種可能性則越來越引發(fā)關(guān)注，研究人員也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些例子：CRISPR-Cas系統(tǒng)的功能并不限于防范遺傳入侵者。在一些細(xì)菌中，CRISPR-Cas組分能調(diào)控DNA修復(fù)，基因表達(dá)和生物膜的形成。它們還可以決定細(xì)菌感染他人的能力，比如說引起軍團(tuán)?。↙egionnaires' disease）的Legionella pneumophila必須具有Cas蛋白Cas2，才能感染其天然宿主變形蟲。
“一個主要的問題是：除了防御外敵它還具有多少生物學(xué)功能？”麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院的分子生物學(xué)家Erik Sontheimer指出，“這是未來幾年的關(guān)注焦點(diǎn)?！?/p>
Sontheimer還補(bǔ)充說，CRISPR也有可能成為另一個類似RNA干擾的發(fā)現(xiàn)，RNA干擾是一種在植物，動物和 其它非原核生物中沉默基因表達(dá)的系統(tǒng)，RNA干擾在早期也被認(rèn)為是防御機(jī)制，只是到后來研究人員才注意到其在調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)中的重要作用。
這也可以解釋為什么一些間隔區(qū)不匹配已知的病毒或質(zhì)粒，荷蘭代爾夫特理工大學(xué)的微生物學(xué)家Stan Brouns說：“這些系統(tǒng)并不完美，它們捕獲病毒DNA同時也捕獲自己的DNA。只要它們不死，一旦開始捕獲新的DNA片段，就可以獲得新的功能 ?！?/p>
No.4 為什么只有一些微生物采用這一系統(tǒng)？
無論CRISPR-Cas具有什么其它功能，顯然只有一些微生物采用這一系統(tǒng)。超過90％的古細(xì)菌具有基于CRISPR的免疫系統(tǒng)，但只有約三分之一的已測序細(xì)菌出現(xiàn)了這一系統(tǒng)。所有的非原核生物，甚至單細(xì)胞生物，都沒有發(fā)現(xiàn)有CRISPR-Cas。
一種被稱為Nanoarchaeum equitans的古細(xì)菌作為寄生生物，寄生于另一個生活在接近沸點(diǎn)的水中的古細(xì)菌上，其基因組已經(jīng)刪去了與能量產(chǎn)生和一般細(xì)胞管理相關(guān)的許多基因。然而在其微小的只有490,000個堿基的DNA中，N. equitans還保留了約30個間隔序列的CRISPR-Cas系統(tǒng)?！耙淮蟛糠值幕蚪M仍然放在CRISPR上，”英國圣安德魯斯大學(xué)的分子生物學(xué)家Malcolm White說：“CRISPR一定具有什么重要作用，但我們竟不知道其中的原因。”
英國?？巳卮髮W(xué)微生物學(xué)家Edze Westra認(rèn)為，這種差異表明一定存在有某些傾向于CRISPR-Cas系統(tǒng)的關(guān)鍵生態(tài)因素，使得病毒防御或其它益處比細(xì)胞自殺的風(fēng)險更為重要。極端環(huán)境似乎有利于CRISPR-Cas系統(tǒng)，但Westra也指出， 在更舒適環(huán)境的細(xì)菌中，這種系統(tǒng)的出現(xiàn)頻率也不相同。比如當(dāng)一種禽類的病原體（Mycoplasma gallisepticum）的宿主從雞轉(zhuǎn)換為野生雀類時，這種細(xì)菌就丟棄了其CRISPR-Cas設(shè)備。為什么這個系統(tǒng)在雞中就很有用，而在雀類中就不好用， 目前還不清楚。
數(shù)學(xué)模型和一些早期的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)只有幾種類型的病毒競爭時，CRISPR-Cas可能更有優(yōu)勢。在添加的DNA序列還沒有成為基因組負(fù)荷時，CRISPR-Cas間隔序列可以記錄有限數(shù)量的病毒序列。如果環(huán)境中的病毒多樣性大大超過可能的間隔序列數(shù)量，那么CRISPR-Cas系統(tǒng)可能沒有什么用處。
另一種可能性是在極端環(huán)境中的古生菌不能過度依賴其它防御手段。細(xì)菌阻止入侵者的一種常見方式是讓自身外殼中稱為包膜的蛋白質(zhì)發(fā)生突變。然而，衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)對于在惡劣條件下生物的生存至關(guān)重要，因此一些古生菌可能難于修改這些衣殼蛋白。
No.5 有多少種CRISPR-Cas？
多數(shù)人傾向于CRISPR-Cas9系統(tǒng)，因?yàn)樗捎糜诨蚪M編輯中，并且簡單且具有多樣性，但是微生物不喜歡。相反，他們傾向于混合和匹配不同的系統(tǒng)，迅速從其它細(xì)菌中學(xué)習(xí)新的細(xì)胞并丟棄舊的細(xì)胞。
研究人員已正式確認(rèn)了6種不同類型的CRISPR系統(tǒng)，其中又有19種亞型?！拔覀兤鋵?shí)只知道它們中的一小部分如何發(fā)揮作用的。”Marraffini說。
揭開這些機(jī)制可能是找到CRISPR-Cas系統(tǒng)新的生物技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。例如，最受歡迎的CRISPR-Cas9是II型系統(tǒng)，它采用的是從間隔序列轉(zhuǎn)錄的RNA分子指導(dǎo)酶切割入侵的病毒或質(zhì)粒DNA。但是在去年6月發(fā)現(xiàn)的VI型系統(tǒng)中的酶切割的是RNA，而不是DNA。另外IV型系統(tǒng)包含一些與CRISPR-Cas相關(guān)的基因，但缺乏重復(fù)和插入間隔序列的機(jī)制。
III型系統(tǒng)是自然界中最常見的CRISPR-Cas系統(tǒng)之一，但卻是研究人員了解最少的一類系統(tǒng)。迄今為止的證據(jù)表明，它們響應(yīng)的不是入侵的DNA或RNA本身，而是響應(yīng)將DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的過程。如果證明是這種情況，這將是一種新的調(diào)控形式，可以擴(kuò)展基因組編輯的CRISPR-Cas工具箱。
此外，在研究人員將其搜索范圍從培養(yǎng)的微生物擴(kuò)展到來自環(huán)境DNA樣品的遺傳序列時，也有可能會突然出現(xiàn)其它系統(tǒng)。
對于Mojica來說，探索這種多樣性，解答關(guān)于CRISPR系統(tǒng)的基本問題，比研究它們引發(fā)的技術(shù)革命更有趣。這讓他的許多同事感到困惑，他說。Mojica沉浸在CRISPR-Cas生物學(xué)中已經(jīng)25年了，雖然有很多資金涌向編輯基因組研究的科研人員，但是投入到他所做的工作的資金卻很少。
Mojica說：“我知道這是一個偉大的工具。夢幻般的可用于治療疾病，但這不是我的事。我想知道系統(tǒng)如何開始，又是如何結(jié)束的”。
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