Mining the Human Gut Microbiota for Immunomodulatory Organisms

移植人類常見的腸道微生物后，小鼠的免疫系統(tǒng)如何變化？

研究背景

腸道微生物對宿主免疫系統(tǒng)的教化必不可少，但哪些特定菌與宿主的哪些免疫成分進行對話，我們的所知非常有限。常見的研究方法是采用微生物組與疾病的關(guān)聯(lián)分析，鑒定出群體中某種菌跟疾病表型具有顯著相關(guān)性，從而推斷兩者之間可能存在著調(diào)控作用。

本文作用采用了一種更為直接的做法：將53種人類腸道菌群分別定植到無菌小鼠體內(nèi)，分析隨后的宿主免疫表型和轉(zhuǎn)錄組的變化。這種做法雖然忽略掉了菌和菌之間的相互作用對宿主的影響，但單菌的移植穩(wěn)定性要強于多菌群體的移植穩(wěn)定性，并且引起的表型可追溯，因果關(guān)系的說服力更強。

研究方案

1.動物模型：四周齡無菌C57BL/6小鼠用于單菌定植。兩周后評估小鼠腸道免疫細胞及相關(guān)細胞因子的改變。

2.定植菌種：涵蓋人類腸道中最主要的5大門類：Bacteroidetes，Firmicutes，Proteobacteria，Actinobacteria，Fusobacteria，共53種。最終能成功定植于小鼠胃腸道內(nèi)的共46種。

3.免疫系統(tǒng)效應評價：腸固有層、派爾淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)（mLNs）和系統(tǒng)淋巴器官（SLOs，包括脾臟和皮下淋巴結(jié)）處18種免疫細胞和5種典型的細胞免疫因子（其中IL-22分為固有免疫來源和適應性免疫來源兩種，如下圖：）

主要結(jié)果

無菌小鼠的固有免疫系統(tǒng)和腸屏障功能發(fā)育不完整，正好可以用于評價各種菌的遷移能力。絕大部分（88%）能移位至近端的淋巴結(jié)并存活，近半數(shù)（47%）能在遠端的皮下淋巴組織等系統(tǒng)淋巴器官中存活。移位能力不存在特殊的種類偏性。

圖：移位至腸系膜淋巴結(jié)（mLN）和系統(tǒng)淋巴器官（SLO）的微生物數(shù)量和分布。

免疫細胞在單菌定植后發(fā)生的改變是多種多樣的。一些固有免疫細胞主要表現(xiàn)為數(shù)量擴張(如CD103 DCs)，另一些主要表現(xiàn)為數(shù)量收縮(如CD11b F4/80 巨噬細胞和單核吞噬細胞)，還有一些免疫細胞則是兩者兼有。近年來的研究熱點固有免疫淋巴細胞ILC3s，僅有極少的菌能影響其數(shù)量變化，這與先前發(fā)現(xiàn)的腸道菌主要通過改變ILC3s的IL-22分泌，而不是改變ILC3s的數(shù)量發(fā)揮作用是吻合的。作為免疫系統(tǒng)的第二道防線，適應性免疫系統(tǒng)的免疫細胞則表現(xiàn)為應答的“遲鈍”，細胞數(shù)量的變動也較為平穩(wěn)。Treg細胞是例外，多種單菌移植能顯著擴張Treg的細胞數(shù)量，提示免疫耐受可能是菌群移植后的主要發(fā)育方向。

從細菌的這一側(cè)看，某些菌對免疫系統(tǒng)的影響可能是隱性的，例如Peptostreptococcusmagnus 和Bacteroidessalanitronis，僅對極少數(shù)免疫細胞的增殖；有一些則是免疫調(diào)控的活躍菌，如Bacteroidesuniformis，在調(diào)控的免疫細胞種類和數(shù)量改變的強度上都表現(xiàn)得十分明顯。

除了影響免疫細胞數(shù)量，細胞因子的改變也可以體現(xiàn)菌對免疫系統(tǒng)的效應。例如大家熟知的分節(jié)絲狀菌SFB對Th17細胞釋放IL-17的調(diào)節(jié)。研究人員還發(fā)現(xiàn)了之前未有觀察到的潛在調(diào)控關(guān)系，包括Coprobacillus與小腸T細胞的IL-10釋放，Bifidobacteriumlongum與Th1細胞的IFNγ分泌。受菌調(diào)節(jié)最明顯的當屬ILCs分泌的IL-22，能調(diào)節(jié)其變化的菌譜非常廣泛，且不同菌引起的效應差異也很大。這也部分解釋了為什么無菌小鼠和SPF小鼠體內(nèi)的IL-22會有那么大的差別。

最后，IgA的生成總量與針對特定菌的IgA生成量存在顯著的正相關(guān)，說明定植的微生物作為免疫原直接誘導了IgA的生成，而不僅僅在該抗體生成過程中發(fā)揮旁觀者效應。與前面的結(jié)果一樣，對IgA的誘導生成作用沒有發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育分類上的偏性。

同一類型免疫細胞，在小腸組織的變化和在大腸組織中的變化具有較強的相關(guān)性，說明同種菌在不同部位引起相似的免疫應答模式；而那些不同類型免疫細胞之間出現(xiàn)的強關(guān)聯(lián)，則可能暗示它們來自于相同的免疫應答通路，如γδT和Helios CD8 T細胞之間，CD4 T和B細胞之間都存在較強的相關(guān)性。按相關(guān)系數(shù)對微生物進行聚類，所得類也不存在系統(tǒng)發(fā)育分類水平上的偏性。

細菌對更遠端的腸系膜淋巴結(jié)和淋巴器官內(nèi)的固有免疫細胞影響力有所減弱，僅對單核細胞有較為明顯的效應；淋巴器官的適應性免疫類細胞大多都不受細菌暴露的影響。更詳細的分析發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)淋巴器官的免疫細胞與腸固有層的免疫細胞間大多具有較為一致的變化趨勢。

與脂肪組織和肌肉組織相比可以發(fā)現(xiàn)，無菌小鼠的腸組織部位的基因表達具有很大的個體差異。在細菌定植后，個體間表達差異大的基因數(shù)量減少了許多，表明腸道菌有穩(wěn)定基因表達的作用。有意思的是，與無菌小鼠相比，那些在細菌移植后表達差異顯著的基因，沒有一個是朝單一方向變化的。不存在只被單種菌調(diào)控的基因，對同一基因有調(diào)控作用的菌不存在門分類水平上的偏性，這與上述提到的菌調(diào)控免疫表型的無偏性相呼應。

GO分析發(fā)現(xiàn)顯著差異表達的基因富集于特定的細胞，如B細胞，基底細胞，巨噬細胞，干細胞，主要發(fā)揮的是抗菌肽反應應答、細胞外基質(zhì)構(gòu)建、營養(yǎng)物質(zhì)（維生素，氨基酸）代謝以及免疫應答等功能。不過，常見的典型免疫因子中，除了Il18稍有提升外，Il1a,Il1b, Il6, Il22,TNF, Il12, 和IFNs多沒有出現(xiàn)顯著的表達差異。

作者最后從免疫細胞、轉(zhuǎn)錄因子和菌三個角度各舉一例典型做具體的講解。包括：

①漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs）在細菌定植后的免疫表型波動，以及I型干擾素（IFNs）相關(guān)通路基因轉(zhuǎn)錄組的改變，能一定程度上解釋pDCs在對應疾病中變化不一致的問題；

②通過抗菌肽（AMPs）在細菌定植后不同部位的變化模式和種類差異，找到脂類代謝和營養(yǎng)運輸是驅(qū)動AMPs表達的關(guān)鍵；

③免疫調(diào)控的活躍菌之一可變梭桿菌（Fusobacteriumvarium）所調(diào)控免疫表型和腸組織轉(zhuǎn)錄具有獨特的特征，包括抑制T4(CD4 )和 T8(CD8 )群體的增殖，同時促進結(jié)腸雙陰性T細胞CD4^-CD8^-TCRβ 的數(shù)量擴張等；而同為梭菌屬的具核桿菌能引起的機體應答則相對“平靜”得多，展現(xiàn)出了相同屬中的不同菌的功能差異可以十分巨大。

討論

多樣化的微生物種類，帶來多樣化的免疫調(diào)控。同時，對宿主的免疫和轉(zhuǎn)錄改變不存在微生物系統(tǒng)發(fā)育上的種屬偏性，而同種菌中的不同株的效應也存在差別，說明人類腸道菌群的免疫調(diào)節(jié)既多樣化，又有功能冗余。這一特性也許能緩沖腸道菌群波動對免疫系統(tǒng)的沖擊。另外，同種不同株的差異，說明在功能研究中將分辨率提高至株水平的必要性。

亮點

1.將不同的細菌獨立出來考察，獲得了各個單菌對免疫調(diào)節(jié)的基線數(shù)據(jù)，可以為將來研究菌間相互效應提供了基礎(chǔ)；

2.考察的物種數(shù)量多，且全部來自于人類腸道的常見菌，具有實用性；

3.檢測的免疫指標也較多，涵蓋了固有免疫和適應性免疫的關(guān)鍵組分，非常全面。