作者 l At.Zhou
編輯 l 小卒子
在今年2月23號，Gilead旗下公司Kite與Sangamo Therapeutics達成全球合作，使用Sangamo的鋅指核酸酶ZNFs技術(shù)平臺開發(fā)下一代腫瘤學離體細胞治療。根據(jù)協(xié)議的條款，Sangamo將獲得1.5億美元的預(yù)付款，并有資格獲得高達30.1億美元的潛在付款。這并不是CAR-T與基因編輯的第一次合作，早在2015年1月，Novartis宣布與Intellia Therapeutics展開一項長達5年的研發(fā)合作計劃，主要致力于加速發(fā)展CRISPR/Cas9技術(shù)在CAR-T細胞治療的應(yīng)用；同年5月，Juno與Editas簽訂了一項為期三年的合作協(xié)議，將借助Editas公司開發(fā)的CRISPR/Cas9技術(shù)輔助公司現(xiàn)在開發(fā)的CAR-T療法和TCR療法治療更多類型的腫瘤類型，這項協(xié)議包括了4700萬美元預(yù)付款和6億9千萬美元的里程碑獎金。
2017年可以被稱為細胞免疫治療元年，Novartis的CAR-T產(chǎn)品Kymriah和Kite的產(chǎn)品Yescarta的獲批上市，極大地推動了細胞免疫治療研發(fā)的熱情，而CAR-T與基因編輯合作，其碰撞的火花將會促進新一代細胞免疫治療的發(fā)展。
現(xiàn)在絕大多數(shù)的CAR-T臨床實驗都是使用的自體型CAR-T，但是病人自身的T細胞通常都存在質(zhì)量與數(shù)量的缺陷；且自體型CAR-T的生產(chǎn)成本更加昂貴，大約為通用型CAR-T的五倍；自體型CAR-T需要私人定制，而通用型CAR-T能夠做到現(xiàn)貨供應(yīng)（off-the-sheff），節(jié)約時間。然而異體型T細胞上的抗原受體TCR可能會識別接受者體內(nèi)的異體抗原，從而引發(fā)移植物抗宿主病（GVHD）；此外，異體T細胞上的HLA表達也會迅速地引起宿主免疫細胞排斥反應(yīng)。因此使用ZFNs，TALENs以及CRISPR/Cas9等基因編輯工具，敲除異體T細胞上的TCR，MHC以及相關(guān)信號通路基因，從而防止異體型CAR-T的宿主排斥反應(yīng)，是實現(xiàn)通用型CAR-T的關(guān)鍵一步。此外敲除PD1與CTLA4等T細胞抑制信號分子，能夠進一步增強CAR-T細胞的功能。
此次與Kite達成合作的Sangamo是ZFNs技術(shù)的專利擁有者，Sangamo目前有多項使用ZFNs基因編輯治療罕見病臨床試驗正在進行中。Editas Therapeutics與Intellia Therapeutics則是基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9的領(lǐng)跑者，其創(chuàng)始人分別為學術(shù)大牛張峰和Jennifer Doudna。而走在通用型CAR-T研發(fā)最前沿的是法國公司Cellectis，其利用自身Talens技術(shù)平臺研發(fā)的UCART已處于臨床階段。本文將主要介紹UCART的產(chǎn)品和生產(chǎn)過程，以及CRISPR/Cas9技術(shù)用于編輯CART細胞的最新進展。
UCART產(chǎn)品介紹
UCART與自體型CAR-T有一些共同特征：它們都由慢病毒轉(zhuǎn)染從而攜帶識別腫瘤上特定抗原的嵌合抗原受體CAR；它們通過CAR識別腫瘤細胞從而發(fā)揮殺傷作用。UCART的獨特點在于原材料是健康捐獻者的血液，并不依賴于病人的淋巴細胞；并非定制的細胞療法，而是能夠現(xiàn)貨供應(yīng)，為更多的病人提供治療；UCART通過TALEN基因編輯技術(shù)，敲除TCR等相關(guān)基因，避免移植物抗宿主病，敲除PD1等免疫檢查點，進一步增強CAR-T細胞的功能。
▲ Cellectis公司UCART簡介
目前Cellectis公司有兩款UCART產(chǎn)品正處于臨床實驗階段，UCART19和UCART123。其中UCART19攜帶靶向CD19的CAR，主要用于治療急性淋巴白血?。ˋLL）；UCART123攜帶靶向CD123的CAR，CD123主要在急性髓細胞性白血病（AML）以及BPDCN的白血病細胞上表達。
▲ UCART19和UCART123
UCART19和UCART123都采用的是第二代CARs，使用了鼠源的scFV，含有41BB和CD3ζ兩個共激活結(jié)構(gòu)域；此外在CAR上還添加了一個RQR8基因，RQR8是一個136aa的蛋白，它能夠被CD34的抗體QBEnd10識別，因此能夠通過Miltenyi CliniMACS的CD34篩選系統(tǒng)進行臨床級別的分選；此外RQR8還含有兩個利妥昔單抗的模擬表位，能夠在發(fā)生安全問題時，通過利妥昔單抗迅速清除CAR-T細胞。
▲ UCART的CAR構(gòu)建設(shè)計
此外，對于UCART19和UCART123，它們都是用了TALEN技術(shù)敲除了TRAC基因，從而降低了移植物抗宿主病的風險。在UCART19中還額外敲除了CD52基因，由于在注射UCART19細胞前，急性淋巴細胞白血病ALL患者通常需要接受淋巴細胞耗竭的化療與anti-CD52（alemtuzumab）血清療法，因此UCART中敲除CD52基因能夠避免UCART產(chǎn)品受到alemtuzumab的影響。
▲ UCART19 TALEN設(shè)計與TALEN轉(zhuǎn)染后蛋白表達水平
UCART GMP 生產(chǎn)過程
UCART的生產(chǎn)過程與自體CART大體上類似，不同點在于UCART的原材料是健康捐獻者的血液而非病人自身的血液，其次UCART生產(chǎn)過程中多了一步，引入基因編輯工具敲除某些特定基因。在目前的自體型CART生產(chǎn)工藝中，Kite的工藝最為簡便，周期也最短，為10天左右；Novartis的生產(chǎn)工藝最為標準，經(jīng)過后期優(yōu)化后周期仍有22天；Juno的生產(chǎn)周期在14-18天左右。目前UCART的GMP生產(chǎn)周期大約為19天，其具體過程如下。
▲ UCART GMP生產(chǎn)過程
UCART初始材料：健康捐贈者細胞
首先從健康的美國捐獻者血液中分離單核細胞（MNCs），這些捐獻者血液來自FDA批準的，加利福尼亞州批準的，美國血庫協(xié)會（AABB）認可的，臨床試驗標準（CLIA）認證的血庫。
所有的捐獻者都需要經(jīng)過挑選，篩選（采集前的14天內(nèi)）和檢測（采集的當天）。
所有的人類細胞的捐獻，獲得，檢測，加工和存儲都遵循歐盟和美國的相關(guān)法規(guī)和指導(dǎo)意見。
從MNCs中分離淋巴細胞（一般的產(chǎn)量大于4x109 cells），一次UCART生產(chǎn)的初始細胞數(shù)目通常為收集到細胞的1/5-1/3（109 cells左右）。
Day1到Day4：第一次T細胞改造（慢病毒感染）
使用識別CD3/CD28的抗體偶聯(lián)beads激活T細胞。
使用GMP級別的，由第三代慢病毒載體包裝的慢病毒感染激活的T細胞，使得RQR8與相應(yīng)的CAR在T細胞中表達。
Day5: 第二次細胞改造（TALEN介導(dǎo)的基因編輯）
將GMP級別的TALEN編碼的mRNA通過電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入到經(jīng)過第一次改造的T細胞中，使TALEN瞬時表達。
TALEN能夠識別和切割TRAC與CD52基因組DNA，形成的DNA雙鍵裂斷由非精準的NHEJ修復(fù)方式修復(fù)從而導(dǎo)致TRAC與CD52基因的敲除。
Day6到Day17：細胞擴增
在可控的培養(yǎng)系統(tǒng)中將細胞擴增到1011 cells左右。
Day18-19：細胞純化與分裝
使用抗體-磁珠偶聯(lián)的beads，分選純化出TCRαβ陰性的T細胞。（此為一個重要的放行標準）
細胞的分裝與凍存。每個產(chǎn)品一般都會有2-3種劑量形式，用以滿足可能的劑量遞增需求。
UCART的QC標準
雖然現(xiàn)在還沒有詳盡的法規(guī)來規(guī)定CART產(chǎn)品的QC標準，但是CART產(chǎn)品還是需要一系列的質(zhì)量檢測。其中產(chǎn)品的純度，即≥97%的TCRαβ陰性細胞是一個重要的放行標準。此外產(chǎn)品的無菌性，內(nèi)毒素，支原體，以及是否含有可復(fù)制的慢病毒都需要進行一系列檢測。產(chǎn)品對于目標細胞的響應(yīng)（包括相關(guān)細胞因子的釋放與細胞殺傷活性）也應(yīng)該被檢測。
▲ UCART的QC標準
UCART19與UCART123臨床結(jié)果
在2017年12月的ASH會議上，Cellectis公布了UCART19的兩個臨床實驗的初步結(jié)果。在CALM (UCART19 in Advanced Lymphoid Malignancies)劑量爬坡實驗中，6名成人R/R B-ALL患者接受了低劑量的UCART19治療，該劑量為自體型CART實驗中劑量的1/10。實驗中UCART19顯示出了可控的安全性和較好的緩解率，只有一名出現(xiàn)了1級的GvHD。所有的6名患者都出現(xiàn)了細胞因子釋放風暴（CRS），其中5人為輕度的1-2級，但能夠通過IL6R抑制劑tocilizumab克服；其中一名患者出現(xiàn)了4級CRS和敗血癥，并在第15天后死亡。另外的兩個高劑量會在接下來的實驗中進行。在PALL(Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia)實驗中，5名患兒接受了固定劑量的UCART19（2x107 total cells or 1.1 to 2.3x106 cells/kg），所有患兒都在4-8天都出現(xiàn)了1-3級的細胞因子釋放CRS，但是是可以克服的。在第28天，所有的患兒都取得了完全的緩解，但是在3個月后，兩個患兒復(fù)發(fā)，并且分別在第7個月和第八個月死亡。另一個患兒死于血栓性微血管病，腎炎等移植并發(fā)癥。剩下的兩個患兒目前分別在移植2個月和2.5個月的緩解期。
然而UCART123的臨床實驗頗為不順，在2017年9月UCART123在治療BPDCN一期臨床試驗中出現(xiàn)了一例病人死亡，該病人在第8天經(jīng)歷了5級的CRS和4級的CLS，并在第9天死亡。在UCART123在治療AML的一期臨床試驗中，一位病人在第9天經(jīng)歷了3級的CRS和4級的CLS，但最終脫離了生命危險。目前UCART123的兩個臨床實驗已經(jīng)被FDA叫停。UCART123的安全性問題可能出在靶點CD123上，由于CD123雖然在腫瘤細胞過度表達，但正常細胞也有表達。強生和Genmab的CD123/CD3雙特異抗體JNJ63709178去年發(fā)生一例嚴重毒副反應(yīng)，臨床試驗被暫時叫停。Stemline的免疫毒素（CD123/白喉毒素）年初也在一個BPDCN臨床試驗中造成三例CLS死亡事件。
安全性問題一直是CAR-T細胞治療中的重中之重，2017年JUNO的CAR-T產(chǎn)品就因為出現(xiàn)兩次病人死亡情況被FDA叫停，從而被Novartis和Kite超越。而對于通用型CART，其面臨的安全性問題壓力更大，UCART123被叫停，UCART19雖然還未出現(xiàn)與產(chǎn)品相關(guān)的嚴重副作用，但是臨床試驗中也出現(xiàn)了多名患者死亡。因此，通用型CAR-T的設(shè)計和優(yōu)化，以及臨床實驗中出現(xiàn)的CRS等都應(yīng)該被小心對待。
CRISPR/Cas9與T細胞編輯
CRISPR/Cas9是現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛，研究最深入的基因編輯工具。與TALENs和ZFNs相比，CRISRP/Cas9的精確性更高，能降低脫靶效應(yīng)帶來的副作用；設(shè)計簡單，更利于規(guī)?；a(chǎn)。雖然Novartis和Juno早在2015年就開始與CRISPR相關(guān)公司合作開發(fā)下一代CAR-T產(chǎn)品，但是現(xiàn)在還沒有更多進展更新被報道。采用CRISPR/Cas9編輯T細胞基因組是相當困難的，CRISPR/Cas9的delievry方法主要包括慢病毒，腺病毒，AAV等病毒載體遞送，使用質(zhì)?；蛘吆颂呛说鞍識NP電轉(zhuǎn)，或者是使用編碼Cas9的mRNA與sgRNA共電轉(zhuǎn)。雖然使用質(zhì)粒DNA核轉(zhuǎn)能夠編輯T細胞基因，但是DNA核轉(zhuǎn)對于T細胞的毒性非常大，不利于T細胞編輯的大規(guī)模應(yīng)用。
在2015年，研究者們使用CRISPR首次成功編輯了T細胞，他們使用的是Cas9蛋白與sgRNA的RNP復(fù)合物電轉(zhuǎn)，其編輯效率能夠達到55%。隨后研究者們使用了編碼Cas9的mRNA與sgRNA共電轉(zhuǎn)，其編輯效率也能夠達到60%以上。雖然研究者們也成功使用了慢病毒，AAV等病毒載體遞送CRISRP/Cas9進行T細胞編輯，但是其編輯效率很低。目前病毒載體在T細胞中效率低的原因還不得而知，可能的一個猜測是在T細胞中，需要快速大量的表達Cas9蛋白。
▲ 利用不同方法遞送CRISPR/Cas9進行T細胞編輯
▲各種CRISRP/Cas9的遞送方式在編輯T細胞時的比較
T細胞編輯的一個挑戰(zhàn)是如何能在較短的時間窗口，完成高效的基因編輯。由于激活的T細胞比na?ve T細胞更容易接受外源的核酸與蛋白質(zhì)，但是多次刺激T細胞會導(dǎo)致T細胞衰竭，腫瘤殺傷能力降低，因此在生產(chǎn)T細胞產(chǎn)品時需要優(yōu)化好實驗步驟，以達到高效的編輯。目前比較通用的方法是在T細胞激活后的Day1，使用慢病毒轉(zhuǎn)染表達CAR，在Day3和Day4使用RNPs或者編碼Cas9的mRNA與sgRNA進行電轉(zhuǎn)，最終得到的CART產(chǎn)品中能達到>70%的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與>60%的基因編輯效率。
此外，為了達到敲除多個基因的目的，使用多個sgRNA共轉(zhuǎn)T細胞可能會產(chǎn)生較高的細胞毒性；使用Cas9 RNP多元復(fù)合物會降低細胞毒性，但是會損失一定的編輯效率。有研究者開發(fā)了One-shot CRISPR system，將多個sgRNA組裝進了CAR所在的慢病毒載體中，這樣就只需要在Day3單獨電轉(zhuǎn)Cas9的mRNA就能夠達到編輯的效果，從而減少多個共轉(zhuǎn)造成的細胞毒性。此外，如何提高慢病毒或者AAV遞送CRISPR/Cas9編輯T細胞的效率，也是降低通用型CART生產(chǎn)成本，擴大生產(chǎn)規(guī)模的重要因素。
小結(jié)
安全性問題一直是CAR-T細胞治療中的重中之重，通用型CAR-T面臨著更大的安全性考驗。在能保證安全性的條件下，通用型CAR-T與自體型CAR-T相比有著明顯的優(yōu)勢。希望Cellectis的UCART臨床實驗帶來更多令人振奮的結(jié)果與信息，希望CRISPR/Cas9技術(shù)能在T細胞編輯上有更大地突破，也希望CAR-T巨頭和基因編輯公司的強強聯(lián)合，早日為我們帶來新一代的免疫細胞療法。
參考資料：
1. Cellectis公司官網(wǎng)資料
2. Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells，2017
3. Multiplex Genome-Edited T-cell Manufacturing Platform for 'Off-the-Shelf' Adoptive T-cell Immunotherapies, 2015
4. A highly compact epitope-based marker/suicide gene for easier and safer T-cell therapy, 2015
5. Multiplex Genome Editing to Generate Universal CAR T Cells Resistant to PD1 Inhibition, 2016
6. CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T cells, 2017
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