姜曉峰
（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱 150001）
摘要：高通量測序又稱下一代測序（NGS），是一種新型的遺傳學(xué)篩查和診斷技術(shù)，它的不斷革新加速了人們對遺傳學(xué)標(biāo)志物及疾病分子機(jī)制的認(rèn)識，特別是針對復(fù)雜遺傳性疾病。NGS技術(shù)的出現(xiàn)促使臨床基因診斷逐漸從單基因時(shí)代跨越到多基因時(shí)代。隨著靶向基因組測序、全外顯子組測序以及全基因組測序項(xiàng)目在臨床中的廣泛應(yīng)用，醫(yī)務(wù)工作者將逐漸改變對復(fù)雜遺傳性疾病的管理策略，最終將依據(jù)遺傳學(xué)檢測結(jié)果對每一位患者進(jìn)行2次分類并給予精準(zhǔn)治療。另外，生物信息學(xué)分析方法的不斷更新和便捷的數(shù)據(jù)分析軟件包也使NGS在臨床診斷中的應(yīng)用更加廣泛。文章中主要論述了現(xiàn)有NGS的主流平臺、現(xiàn)階段NGS在臨床分子診斷中的主要應(yīng)用策略以及應(yīng)用NGS檢測序列變異的數(shù)據(jù)分析方法。
關(guān)鍵詞：高通量測序；復(fù)雜遺傳性疾??；臨床基因診斷；生物信息學(xué)
DNA和RNA測序技術(shù)的發(fā)展加速了人們對遺傳病分子特征的認(rèn)識。應(yīng)用高通量測序，即下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)檢測疾病的遺傳學(xué)特征已經(jīng)成為當(dāng)前精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要組成部分[1-3]。對于單基因遺傳病，以往臨床實(shí)驗(yàn)室主要借助于Sanger測序、等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）、熒光原位雜交、DNA印記雜交等技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。隨著致病基因的不斷發(fā)現(xiàn)，特別是針對癌癥、心血管疾病、腎病、糖尿病等復(fù)雜性疾病，傳統(tǒng)的遺傳學(xué)檢測方法已經(jīng)不能滿足臨床分子診斷對檢測技術(shù)的需求，而NGS技術(shù)以其高效、廉價(jià)的特點(diǎn)則恰恰顯示出在這個(gè)領(lǐng)域的技術(shù)優(yōu)勢。簡單地說，NGS技術(shù)能夠通過1次實(shí)驗(yàn)對多個(gè)基因進(jìn)行檢測，同時(shí)具有所需樣本量小、總體成本低的特點(diǎn)。因此，NGS技術(shù)為疾病的遺傳學(xué)篩查與診斷提供了便捷的途徑。另外，NGS技術(shù)在病原微生物的快速鑒定、藥物的靶向治療以及產(chǎn)前篩查等多個(gè)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用優(yōu)勢[4-5]。
1977年，Sanger團(tuán)隊(duì)里程碑式地解密了首個(gè)噬菌體X174基因組（DNA拼接長度僅5 000多個(gè)堿基）[6]。在過去的幾十年里，Sanger測序無疑已經(jīng)成為一種長期而有效的DNA測序方法。盡管如此，該技術(shù)自身的低通量和高成本限制了其在復(fù)雜遺傳病診斷以及大規(guī)模基因組測序項(xiàng)目中的廣泛應(yīng)用。
自2000年初開始，測序技術(shù)得到了快速的發(fā)展。2004年，美國生命科學(xué)公司應(yīng)用焦磷酸測序方法推出了第1臺NGS儀。2006年，Illumina公司推出了Solexa測序平臺。目前，該公司已經(jīng)推出了多種型號的測序平臺，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列適合于小型基因組測序，HiSeq系列適用于大型基因組測序。2007年，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出SOLiD測序平臺。該平臺采用五輪測序法以4色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連接合成為基礎(chǔ)，測序準(zhǔn)確性得以提高。2010年，美國生命科學(xué)公司和太平洋生物科學(xué)公司分別發(fā)布了半導(dǎo)體測序平臺和第3代單分子實(shí)時(shí)（single molecule realtime，SMRT）DNA測序平臺。這2種測序技術(shù)與以往的基于光學(xué)信號的檢測技術(shù)不同，半導(dǎo)體測序平臺通過半導(dǎo)體芯片直接感應(yīng)在序列合成過程中磷酸二酯鍵3'OH基團(tuán)釋放的質(zhì)子；第3代測序儀通過納米孔技術(shù)記錄單個(gè)聚合酶在不受干擾情況下連續(xù)合成，其中PacBio RS II每次運(yùn)行能夠產(chǎn)生60 000×16條序列，每條序列的平均長度達(dá)8 500 bp[7]。
一般來說，以上每種測序儀在序列讀段長度、準(zhǔn)確性、測序通量、價(jià)格等多個(gè)方面存在一定的差異。焦磷酸測序平臺測序讀段較長，測序通量較低，成本相對較高；Illumina系列平臺產(chǎn)生的讀段相對較短，測序費(fèi)用相對較低，應(yīng)用比較廣泛；SOLiD測序平臺在通量和準(zhǔn)確性方面相對以上2種類型的測序平臺有明顯改善，但是測序長度更短；半導(dǎo)體測序平臺以及SMRT測序平臺相比其他測序平臺運(yùn)行時(shí)間較短，另外單分子測序平臺減少了測序前的擴(kuò)增準(zhǔn)備工作，測序讀段較長，但是測序成本和錯(cuò)誤率都相對較高[8-10]。一些常用的測序儀的測序原理和性能見表1。
表1 部分常用NGS平臺的測序原理和性能概述
平臺 擴(kuò)增方式 測序原理 讀段長度（bp） 運(yùn)行時(shí)間（h） 費(fèi)用/Gb（美元） 錯(cuò)誤率（%）454 GS Junior 乳滴PCR 焦磷酸測序 25～700 20 19 540 0.5 IlluminaMiSeq 橋式PCR 合成測序 300～600 21～55 109～996 0.2 Illumina HiSeq2500 橋式PCR 合成測序 125～250 60～144 30～90 0.2 IlluminaHiSeq X Ten 橋式PCR 合成測序 150 72 7 0.2 SOLiD 5500xl 乳滴PCR 鏈接測序 50～75 144 68 0.1 Ion PGM 乳滴PCR 半導(dǎo)體測序 200～400 2.3～7.3 460～788 1.0 Ion Proton 乳滴PCR 半導(dǎo)體測序 最大200 2～4 11.0～81.6 1.0 PacBio RS II NONE SMRT測序 8 500 4 1 111 15.0
與第1代測序技術(shù)相比，NGS技術(shù)具有以下幾方面的優(yōu)勢：（1）通量高。以HiSeq X Ten為例，每年完成人類全基因組測序的量可達(dá)到18 000個(gè)左右；（2）速度快。特別是半導(dǎo)體測序儀，每次運(yùn)行所需時(shí)間僅數(shù)小時(shí)；（3）測序成本低。應(yīng)用Ion Torrent檢測平臺對數(shù)十個(gè)基因的測序成本與應(yīng)用Sanger技術(shù)對單個(gè)基因的測序成本大致相當(dāng)；（4）敏感性高。特別是對于取樣不均一的樣本，NGS能穩(wěn)定檢測＞1%的突變信息，對于檢測異質(zhì)性相對較高的腫瘤樣本特別重要；（5）所需樣本量少。對DNA樣本的要求僅為ng數(shù)量級?？傊琋GS技術(shù)能夠一次性對多個(gè)靶基因進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，具有所需樣本量小、敏感性高、檢測成本低、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。
在NGS技術(shù)快速發(fā)展的同時(shí)也加速了該技術(shù)在臨床分子診斷中的廣泛應(yīng)用。根據(jù)檢測目的不同，NGS技術(shù)在臨床中的應(yīng)用主要分為以下2種策略：（1）針對已知病因的疾病設(shè)計(jì)合適的芯片，直接對多個(gè)已知的致病基因進(jìn)行靶向基因組測序；（2）針對未知病因的疾病對外顯子組或全基因組進(jìn)行測序。
在臨床應(yīng)用中以上2種測序方式各有優(yōu)缺點(diǎn)。靶向基因組測序的優(yōu)點(diǎn)在于具有較高的測序深度、較低的檢測成本，同時(shí)減輕了臨床醫(yī)生對高通量數(shù)據(jù)分析的壓力，具有較好的應(yīng)用前景，特別適合于復(fù)雜性疾病的臨床分子診斷。缺點(diǎn)是當(dāng)臨床患者實(shí)際需要檢測的基因數(shù)＜芯片中包含的基因數(shù)量時(shí)，會導(dǎo)致資源浪費(fèi)和檢測成本升高。另外，當(dāng)需要將新的基因添加到芯片中時(shí)，需要重新設(shè)計(jì)芯片并再次通過臨床質(zhì)量驗(yàn)證。而外顯子組或全基因組測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于能夠發(fā)現(xiàn)新的致病基因，但是測序成本相對較高。對于檢測到的一些突變信息，有時(shí)還需要對患者進(jìn)行跟蹤隨訪，根據(jù)隨訪信息再確定突變位點(diǎn)是否具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
目前，靶向基因組測序在臨床診斷中最廣泛的應(yīng)用是針對癌癥亞型的臨床診斷與治療。如針對遺傳性癌癥的風(fēng)險(xiǎn)評估，利亞德基因公司針對25個(gè)癌基因中的突變位點(diǎn)開發(fā)了“MyRisk panel”芯片，專門針對乳腺癌、大腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌及黑色素瘤等8種癌型并結(jié)合家系信息進(jìn)行遺傳風(fēng)險(xiǎn)評估和健康管理[11]。針對美國食品與藥品監(jiān)督管理局（U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的臨床藥物，llumina公司針對26個(gè)基因的突變位點(diǎn)開發(fā)了“TruSight Tumor panel”芯片，根據(jù)實(shí)際檢測結(jié)果針對肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、宮頸癌進(jìn)行靶向治療[12]。另外還有“AmpliSeq Cancer Panel V1”芯片[13]、“Truseq Amplicon cancer panel”芯片[14]等。除此之外，NGS還廣泛應(yīng)用于腎病[15]、糖尿病[16]、心血管疾病[17]等其他復(fù)雜疾病的臨床診斷中。而外顯子組和全基因組測序在臨床上廣泛應(yīng)用于篩查潛在致病基因、病原微生物的快速鑒定、產(chǎn)前篩查[18]等方面。目前，在德國采用HiSeq X Ten測序平臺完成1個(gè)人的全基因組測序項(xiàng)目，測序深度～30X的檢測總花費(fèi)為1 411歐元[19]。因此，測序成本已不再是影響全基因組測序應(yīng)用于臨床的主要障礙，重點(diǎn)在于如何對得到的遺傳信息進(jìn)行有效地解讀和實(shí)際應(yīng)用。
盡管以上2種測序方式在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景，但是在測序過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤依然不容忽視[20-21]。產(chǎn)生錯(cuò)誤的原因有文庫的制備、人工操作、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、測序平臺存在的偏好性等。因此，嚴(yán)格的數(shù)據(jù)分析方法和驗(yàn)證方法對避免產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果至關(guān)重要。在當(dāng)前的臨床分子診斷中，針對單個(gè)位點(diǎn)的遺傳學(xué)變異，Sanger測序仍然被認(rèn)為是分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會也建議NGS技術(shù)與Sanger測序技術(shù)二者相結(jié)合共同服務(wù)于臨床遺傳學(xué)診斷。
對DNA或RNA的NGS流程主要分為測序前文庫制備→樣本上機(jī)→測序后數(shù)據(jù)分析3個(gè)步驟。對于測序前的準(zhǔn)備工作，靶向基因組測序或全外顯子測序還需要對特定的基因序列進(jìn)行純化富集。富集方法按照原理的不同分為基于寡核苷酸雜交的富集方法和基于多重PCR的富集方法。方法的選擇由多種因素決定，包括測序平臺的通量、樣本類型（新鮮組織、冰凍組織、石蠟包埋組織）及質(zhì)量等[22]。石蠟包埋的組織樣本包含的DNA質(zhì)量相對較低，因此選擇多重PCR的富集方法比較合適。而血液樣本、骨髓樣本以及新鮮的組織樣本包含的DNA質(zhì)量相對較高，應(yīng)用2種富集方法都能得到很好的效果。對于全外顯子組測序，由于涉及到的基因的數(shù)量太多，只能應(yīng)用基于寡核苷酸雜交的富集方法。
測序工作完成后，如何對得到的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行有效分析是臨床實(shí)驗(yàn)室的又一個(gè)工作重點(diǎn)。一般來講，NGS的數(shù)據(jù)分析流程主要分為以下幾個(gè)步驟。
3.1 堿基識別
測序過程經(jīng)堿基識別將信號轉(zhuǎn)化成FASTA或FASTQ等格式的原始序列數(shù)據(jù)，隨后應(yīng)用FastQC軟件檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量，并去除接頭序列和低質(zhì)量序列，一般認(rèn)為質(zhì)量分值＜Q20的序列為低質(zhì)量序列，＞Q30的為高質(zhì)量序列。對于多個(gè)樣本混合的情況，還需要應(yīng)用FastqMultx或Fastx-toolkit對讀段序列進(jìn)行重新分類。
3.2 序列比對
選擇合適的序列比對工具，如BWA、Bowtie、SOAP2等將得到的序列信息比對到相應(yīng)的基因組參考序列上，按照SAM格式（序列比對/定位）輸出比對結(jié)果。這種格式可以被多種變異檢測工具處理，提供的信息包括序列讀段、序列質(zhì)量、在參考基因組上的位置、序列讀段與參考序列之間的差異。
3.3 識別序列變異
應(yīng)用GATK等軟件識別序列變異，包括單核苷酸變異和插入缺失。運(yùn)行過程包括序列的局部比對→量分值的重新校準(zhǔn)→別變異→列變異過濾等過程。
3.4 變異注釋
通過ANNOVAR或VEP等注釋工具對檢測到的變異進(jìn)行數(shù)據(jù)庫注釋，注釋信息包括變異類型、區(qū)域信息、在不同群體中的發(fā)生頻率以及與已知疾病的確切關(guān)系等。臨床實(shí)驗(yàn)室需要結(jié)合檢測目的選擇適當(dāng)?shù)淖⑨寯?shù)據(jù)庫。常用的注釋數(shù)據(jù)庫信息見表2。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)學(xué)會的標(biāo)準(zhǔn)[42]，實(shí)驗(yàn)室需要結(jié)合序列是否在OMIM/HGMD中有注釋、變異頻率、變異類型、既往報(bào)道等信息將變異主要分成以下4類：（1）已報(bào)道的致病位點(diǎn)；（2）新發(fā)現(xiàn)并預(yù)測為致病的變異位點(diǎn)；（3）新發(fā)現(xiàn)但致病性不明確的變異位點(diǎn)；（4）報(bào)道與臨床表型相關(guān)而致病性不明確的變異位點(diǎn)。最后還需要結(jié)合疾病的遺傳模式以及患者的實(shí)際臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合判斷。
表2 常用基因組注釋數(shù)據(jù)庫信息
數(shù)據(jù)源 描述RefSeq 由NCBI提供的具有生物學(xué)意義的非冗余序列數(shù)據(jù)庫ASAP II 剪切變異體數(shù)據(jù)庫ASPicDB 人類基因剪切模式數(shù)據(jù)庫ASTD 由可變剪切或可變起始或終止位點(diǎn)產(chǎn)生的可變轉(zhuǎn)錄物數(shù)據(jù)庫dbSNP NCBI上的變異體目錄OMIM 人類遺傳疾病及其致病基因數(shù)據(jù)庫SNPeffect 注釋單核苷酸多態(tài)性影響的數(shù)據(jù)庫Swiss-prot 非冗余的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫HGMD 人類基因突變數(shù)據(jù)庫COSMIC 癌癥體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫
目前，NGS的數(shù)據(jù)分析方法已向著便捷化、智能化的方向發(fā)現(xiàn)。一些測序公司針對測序數(shù)據(jù)預(yù)處理及變異檢測已形成較為成熟的生物信息分析流程和軟件包，如美國生命科學(xué)公司的Ion Torrent PGM平臺隨機(jī)攜帶的分析軟件包Torrent Suite和變異識別插件Torrent Variant Caller。另外，一些互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)公司還形成了云服務(wù)等便捷的數(shù)據(jù)分析方式。這些分析軟件和互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的快速發(fā)展也將進(jìn)一步加速NGS技術(shù)在臨床的廣泛應(yīng)用。
NGS技術(shù)的不斷發(fā)展正在推動當(dāng)前的醫(yī)療模式向新的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)模式邁進(jìn)。究其主要原因在于NGS技術(shù)的發(fā)展深化了人們對遺傳性疾病分子特征的認(rèn)識，同時(shí)加速了該技術(shù)在臨床分子診斷中的應(yīng)用。目前，盡管NGS技術(shù)的臨床應(yīng)用具有廣泛的應(yīng)用前景，但尚處于起步階段，國內(nèi)測序技術(shù)的臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，需要加速建立更加完善的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。對臨床科室而言，隨著越來越多的潛在遺傳學(xué)標(biāo)志物的出現(xiàn)，有待臨床醫(yī)生提出新的個(gè)體化治療方案，使更多的患者從精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中獲益。另外，越來越多的NGS數(shù)據(jù)的出現(xiàn)，對臨床實(shí)驗(yàn)室也提出了新的要求：臨床實(shí)驗(yàn)室在能有效處理和分析高通量數(shù)據(jù)的同時(shí)，還應(yīng)該能對獲得的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的存儲，方便將來再次結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，從中挖掘更有效的信息以適用于臨床診斷?？傊?，隨著NGS技術(shù)的持續(xù)發(fā)展和對高通量數(shù)據(jù)處理能力的不斷提高，必將為臨床遺傳性疾病的診斷與治療帶來變革。
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Application and prospect of high-throughput sequencing in clinical molecular diagnosis
JIANG Xiaofeng.
（Department of Clinical Laboratory，the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin150001，Heilongjiang，China）
Abstract：High-throughput sequencing，next generation sequencing（NGS），is a new type of genetic screening technology. Its innovation accelerates the understanding of genetic markers and molecular mechanism，and also promotes clinical gene diagnosis from single gene to multi-genes，especially for complex genetic diseases. As the new sequencing technology used in clinic，doctors will change the management of genetic diseases，and patients will be placed into different groups eventually based on genetic diagnosis. In addition，with the improvement of bioinformatics and package，the application of NGS in clinic will be more routine. This review discusses the major platform and performance of NGS and its application in clinic and the process of NGS analysis of sequence variations.
Key words：High-throughput sequencing；Complex genetic diseases；Clinical gene diagnosis； Bioinformatics
文章編號：1673-8640（2017）04-0250-05
中圖分類號：：R393
文獻(xiàn)標(biāo)志碼：：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.04.002
（收稿日期：2016-09-01）
（本文編輯：范基農(nóng)）
作者簡介：姜曉峰，男，1962年生，博士，主任醫(yī)師，主要從事哮喘的發(fā)病機(jī)制、臨床分子診斷以及復(fù)雜疾病的異質(zhì)性研究。
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