本月結(jié)束的2015年度CSCO年會(huì)上，“血液檢測(cè)”在各個(gè)會(huì)場(chǎng)成為熱點(diǎn)話題。“液態(tài)活檢”在腫瘤的早期診斷、用藥監(jiān)控、預(yù)后判斷等方向的重要性日趨明朗，同時(shí)也能感受到從學(xué)術(shù)、臨床到產(chǎn)業(yè)界之間越來越明確的共識(shí)。液態(tài)活檢按照檢測(cè)樣品分類，主要有2大方向：循環(huán)腫瘤核酸（circulating cell-free tumor DNA, ctDNA）和循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTCs）。對(duì)于上述2類對(duì)象，可分為兩種檢測(cè)平臺(tái)：深度測(cè)序和數(shù)字PCR。相比于目前主流的NGS，數(shù)字PCR在如下方面優(yōu)勢(shì)突出：操作快速、簡便（測(cè)序前無需對(duì)來源于CTC的DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增）；無需復(fù)雜的生物信息學(xué)分析；檢測(cè)靈敏度高等。
下面我們以萊斯特大學(xué)（University of Leicester）、倫敦帝國學(xué)院（Imperial College）最近發(fā)表在Clinical Chemistry上的研究成果為文本，梳理ddPCR、NGS和CTC三者在轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人中ESR1（Estrogen Receptor 1，雌激素受體1）突變液態(tài)活檢的具體應(yīng)用和初步結(jié)果。
背景：
超過70%的原發(fā)性乳腺癌患者為ER（雌激素受體）陽性，激素治療對(duì)這類病人在治療初期往往有效。隨著治療的深入，相當(dāng)比例的病人對(duì)抗雌激素或芳香化酶抑制劑（AIs）治療出現(xiàn)耐藥。配合NGS的使用，發(fā)現(xiàn)ESR1基因上p.L536, p.Y537，和p.D538位點(diǎn)的突變是導(dǎo)致耐藥性的主要原因之一。
樣品：
共54名病人，其中48名為ER陽性，持續(xù)接受激素治療；1名病人為原發(fā)癌，原位復(fù)發(fā)；5名病人為ER陰性。其中53名病人都是轉(zhuǎn)移性乳腺癌。
病人2ml血漿中的cfDNA與對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行突變對(duì)比分析。
方法：
通過CellSearch System（目前唯一通過FDA批準(zhǔn)的CTC檢測(cè)設(shè)備）在7.5ml血液中獲得循環(huán)腫瘤細(xì)胞。其中3名病人7.5ml血液中的CTCs超過100個(gè)，可直接通過NGS與對(duì)應(yīng)的cfDNA進(jìn)行比對(duì)，無需經(jīng)過全基因組的預(yù)擴(kuò)增處理。其他獲得的CTC DNA經(jīng)過Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit預(yù)擴(kuò)增后進(jìn)行深度測(cè)序。（GE Healthcare Life Sciences）
采用The Ion AmpliSeq designer 3.0設(shè)計(jì)了23個(gè)擴(kuò)增子的Ion AmpliSeq Panel來分析ESR1（11%的覆蓋率）、TP53、PIK3CA、FGFR1和FGFR2共5個(gè)基因中的熱點(diǎn)突變。擴(kuò)增子產(chǎn)物范圍125～175bp，測(cè)序在316芯片上完成，文庫構(gòu)建核酸起始量分別為1-10ng cfDNA和5ng／淋巴細(xì)胞或CTC DNA。
對(duì)上述經(jīng)NGS測(cè)序發(fā)現(xiàn)的ESR1 p.D538G, PIK3CA p.E545K和TP53 p.R175H位點(diǎn)在Bio-Rad QX200微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)上采用雙重ddPCR進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)計(jì)算各位點(diǎn)的突變率。其中對(duì)于ESR1 p.D538G的檢測(cè)，野生型和突變型的探針進(jìn)行了LNA的修飾，更好地確保檢測(cè)結(jié)果的特異性。（對(duì)于PIK3CA p.E545K和TP53 p.R175H位點(diǎn)，PrimePCR ddPCR Mutation Detection產(chǎn)品系列已經(jīng)有ready-to-use的試劑盒提供，檢測(cè)靈敏度至少可達(dá)1/2000）
同時(shí)對(duì)病人血清進(jìn)行CA15-3（腫瘤相關(guān)抗原）和ALP（堿性磷酸酶）生化分析。
結(jié)論：
48名ER陽性病人cfDNA NGS結(jié)果：3名病人中發(fā)現(xiàn)p.D538G(46.3%), p.Y537S(2.8%), 和p.E380Q (24.4%)突變。其中具有p.E380Q突變的病人同時(shí)為PIK3CA和TP53突變。
5名ER陰性病人cfDNA NGS結(jié)果全部為陰性。
48名ER陽性病人cfDNA ddPCR結(jié)果：對(duì)ESR1 p.D538G位點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)，除NGS發(fā)現(xiàn)的3例病人外，還發(fā)現(xiàn)了6例（突變率都在1%以下），總共9例，使檢出率提高到18.75%。
CTCs和總cfDNA含量高度相關(guān)（P =0.000384）；CTCs和生化指標(biāo)也呈現(xiàn)正相關(guān)，CA15-3（P =0.0010）；ALP（P =0.0168）。但本研究未發(fā)現(xiàn)CTCs和具體位點(diǎn)的突變率呈現(xiàn)相關(guān)性。
通過對(duì)11名乳腺癌轉(zhuǎn)移病人血液樣品連續(xù)監(jiān)控發(fā)現(xiàn)，其中4名病人cfDNA中的突變存在顯著變化。例如一名病人ESR1 p.D538G分別從治療前的3.1%上升至治療5個(gè)月后的46.3%；另一名病人在治療前ESR1 p.D538G為0.4%，治療3個(gè)月后上升至13.6%。
本文觀點(diǎn)：
治療前32個(gè)病人中的CTC<5，與之前的研究一致，在7.5ml血液中CTC數(shù)值是乳腺癌患者的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。
相較于將CTC來源的DNA作為測(cè)序?qū)ο筮M(jìn)行深度測(cè)序，ddPCR對(duì)cfDNA來源的突變直接進(jìn)行檢測(cè)具有更高的靈敏度。
CTC數(shù)值和cfDNA中有無突變（P=0.0026）及cfDNA總含量具有相關(guān)性，但和具體位點(diǎn)的突變率無相關(guān)性。
作為液態(tài)活檢的2大來源，細(xì)胞層面的CTC還是分子層面的cfDNA哪個(gè)在臨床上更具有應(yīng)用價(jià)值還需要深入討論。也許隨著研究的深入、臨床測(cè)試的進(jìn)一步展開，CTC和cfDNA具有各自不同的應(yīng)用價(jià)值。但本研究已經(jīng)明確揭示了“液態(tài)活檢”這個(gè)概念在腫瘤預(yù)防、治療等方面的重要性。
本屆CSCO的幾點(diǎn)體會(huì)：
血液檢測(cè)的分析能夠反映腫瘤病灶的整體水平，思路有點(diǎn)像我們常說的“活要見人，死要見尸”，這里“人”指腫瘤細(xì)胞，“尸”指包含核酸和蛋白在內(nèi)的各種腫瘤標(biāo)志物。目前來看，分子標(biāo)志物的檢測(cè)相對(duì)比較成熟，臨床意義明確。循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及臨床意義還需深入研究，一旦突破，意義重大！因?yàn)槟玫降氖峭暾哪[瘤細(xì)胞。
ctDNA的NGS分析，對(duì)各種腫瘤相關(guān)基因的覆蓋度方面具有優(yōu)勢(shì)，如本文獻(xiàn)中能利用深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)多個(gè)ESR1基因耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)及其他相關(guān)基因的突變。
ctDNA的ddPCR分析，以操作快速、靈敏度高及簡捷的突變率計(jì)算見長。
在ctDNA的檢測(cè)方面，NGS和ddPCR的聯(lián)合使用是大勢(shì)所趨。國際肺癌研究學(xué)會(huì)（IASLC）主席Tony Mok（莫樹錦）會(huì)議期間提及的肺癌相關(guān)基因突變檢測(cè)的方案中就體現(xiàn)了這一趨勢(shì)。（下圖摘自Tony Mok在會(huì)議上的演講）
國內(nèi)也有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在同時(shí)采用ddPCR、NGS和CTC進(jìn)行不同腫瘤的血液檢測(cè)，不久也會(huì)有類似的研究結(jié)果。
本屆CSCO上各參展商的宣傳來看，產(chǎn)業(yè)界的共識(shí)也在逐漸明確：對(duì)付腫瘤需要各種技術(shù)齊上陣，單打獨(dú)斗搞不定。
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