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  人類胚胎的難獲得性阻礙了對(duì)人類早期胚胎發(fā)育和相關(guān)疾病的研究，然而人類多能干細(xì)胞的應(yīng)用提供了在培養(yǎng)皿中研究人類胚胎發(fā)育的途徑。本文作者開發(fā)了一種三維培養(yǎng)策略，通過連續(xù)的譜系分化和自組裝，在體外構(gòu)建囊胚樣結(jié)構(gòu)。將這些結(jié)構(gòu)稱為“人類類囊胚”，它們?cè)谛螒B(tài)、大小、細(xì)胞數(shù)量以及不同細(xì)胞譜系的組成和分配方面與人類囊胚相似，單細(xì)胞RNA測(cè)序分析也揭示了類囊胚與囊胚在轉(zhuǎn)錄水平上的相似性。類囊胚可以由胚胎和胚胎外干細(xì)胞衍生而來，在體外可以進(jìn)一步發(fā)育成圍著床期的胚胎樣結(jié)構(gòu)。利用化學(xué)干擾證明了蛋白激酶C的特定同工酶在類囊胚腔形成過程中起著關(guān)鍵作用。類囊胚為研究人類早期發(fā)育、妊娠丟失和早期發(fā)育缺陷提供了一種容易獲得、多用途和可操作的囊胚替代方法。

  人的na?ve胚胎干細(xì)胞（ES）具有向胚胎和胚外細(xì)胞譜系分化的潛能，na?ve WIBR3人ES細(xì)胞具有分化為類似囊胚的所有細(xì)胞譜系的能力。作者將TSM與5i/L/A培養(yǎng)基以1:1的比例混合(稱為滋養(yǎng)層分化培養(yǎng)基，TDM)，用內(nèi)胚層培養(yǎng)基(HDM)+TDM(HT法)或TDM+HDM(TH法)連續(xù)處理WIBR3細(xì)胞能夠產(chǎn)生囊胚樣結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)具有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)樣和滋養(yǎng)外胚樣(TE)的區(qū)分，具有可見的腔，將這些結(jié)構(gòu)稱為人類類囊胚，并且根據(jù)形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)將類囊胚的形成率進(jìn)行了量化（圖1）。所以，作者開發(fā)出了一種3D連續(xù)分化策略，使na?ve人多能干細(xì)胞（PSCs）能夠在體外自組裝成囊胚樣結(jié)構(gòu)。

  接下來作者通過免疫熒光確定類囊胚的譜系組成。外層細(xì)胞(滋養(yǎng)外胚層或滋養(yǎng)層樣細(xì)胞，TLCs)的幾個(gè)滋養(yǎng)外胚層marker染色呈陽性，OCT4在ICM樣細(xì)胞中高表達(dá)，但在TLC中保持低的熒光強(qiáng)度。ICM樣細(xì)胞表達(dá)外胚層樣細(xì)胞(ELCs)marker SOX2或內(nèi)胚層樣細(xì)胞(HLCs)marker GATA6，這與已報(bào)道的人類E6-E7囊胚結(jié)果一致。三重共染色顯示SOX2、SOX17和GATA3在囊胚和類囊胚中的表達(dá)模式相似（圖1）。這些結(jié)果證實(shí)了類囊胚中存在類似于外胚層、滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞，并表明這些細(xì)胞與人類囊胚具有相似的空間組裝能力。

為了確定類囊胚細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，作者進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)。細(xì)胞聚類顯示了不同譜系marker基因的特異性表達(dá)，包括SOX2(外胚層)、COL4A1(內(nèi)胚層)和GATA2(滋養(yǎng)外胚層)等。與已發(fā)表的人類植入前胚胎單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，類囊胚細(xì)胞在發(fā)育過程中與來自胚胎的三個(gè)譜系細(xì)胞能夠聚類在一起。用兩種結(jié)構(gòu)之間的重疊來識(shí)別和注釋最接近胚胎細(xì)胞狀態(tài)的類囊胚細(xì)胞。類囊胚的一個(gè)細(xì)胞亞群能與來自E3-E4人類胚胎的細(xì)胞聚類在一起，這些細(xì)胞尚未分化為外胚層、內(nèi)胚層或滋養(yǎng)外胚層譜系。為了評(píng)估類囊胚細(xì)胞發(fā)育的時(shí)間特性，作者將這些數(shù)據(jù)與已發(fā)表的體外培養(yǎng)的人類植入前和植入后胚胎以及已建立的干細(xì)胞系進(jìn)行了比較。每一個(gè)類囊胚細(xì)胞譜系表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)模式，這與植入前胚胎相應(yīng)的譜系是一致的。第9群細(xì)胞表達(dá)極滋養(yǎng)外胚層marker(CYP19A1，MUC15，OVOL1)，表明它們是極滋養(yǎng)外胚層樣細(xì)胞。

  為了確定不同時(shí)間類胚胎分化的進(jìn)程，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(HT法，第3、6、9天)。使用HDM培養(yǎng)3天后，ELCs(SOX2⁺)和HLC(COL4A1⁺)發(fā)育正常。相反，TLCs(GATA2⁺)只有在TDM培養(yǎng)(第6天和第9天)后才出現(xiàn)。細(xì)胞狀態(tài)軌跡分析表明，ELCs、HLCs和TLCs可能來自未分群的細(xì)胞群體。U6群包含少量來自早期(E3-E4)人類胚胎的細(xì)胞，并顯示出多個(gè)譜系marker的表達(dá)，表明這些U6細(xì)胞代表了早期的過渡狀態(tài)的細(xì)胞。U2群和U3群可能代表對(duì)TDM生長(zhǎng)條件有反應(yīng)但沒有正確建立囊胚樣狀態(tài)的細(xì)胞。U5、U7、U13、U15和U16群表達(dá)內(nèi)胚層細(xì)胞marker，并且和HLC聚類較近?；隗w內(nèi)的數(shù)據(jù)，一些未分類的簇包含少量來自人類植入前胚胎的細(xì)胞。

  應(yīng)用5i/L/A，TS培養(yǎng)基以及NACL等條件，研究人員成功將na?ve ES細(xì)胞，滋養(yǎng)層干細(xì)胞以及na?ve 胚外內(nèi)胚層細(xì)胞系從類囊胚中建立起來。單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果顯示這些細(xì)胞系分別聚類，并分別表達(dá)不同譜系標(biāo)記物SOX2，GATA6，GATA3。為確認(rèn)這些干細(xì)胞系的多能性，研究人員進(jìn)行體外分化實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)細(xì)胞譜系標(biāo)記分子的免疫熒光染色及RNA水平檢測(cè)，確認(rèn)滋養(yǎng)層干細(xì)胞可成功分化為絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞以及合體滋養(yǎng)層。對(duì)nEND，研究人員將其分化為胚外間質(zhì)樣細(xì)胞及臟內(nèi)胚層細(xì)胞和卵黃囊內(nèi)胚層樣細(xì)胞。Na?ve ES細(xì)胞則可以分化為primed ES細(xì)胞，產(chǎn)生三胚層細(xì)胞。為進(jìn)一步確認(rèn)譜系分化，研究人員將類胚胎源的干細(xì)胞顯微注射到小鼠囊胚中，隨后進(jìn)行體外培養(yǎng)，5-6天后，23.9%，8.0%，15.8%胚胎中分別有源于滋養(yǎng)層干細(xì)胞，nEND細(xì)胞，na?ve ES細(xì)胞在其相應(yīng)譜系中。以上結(jié)果說明，人類類囊胚可以產(chǎn)生多種干細(xì)胞，并且這些類囊胚源的干細(xì)胞可進(jìn)一步分化為其相應(yīng)的下游細(xì)胞類型。

為了探究類囊胚是否可以自組裝成植入前胚胎類似結(jié)構(gòu)，研究人員應(yīng)用體外培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，40-50%類囊胚貼附到培養(yǎng)皿中，變?yōu)楸馄綘罱Y(jié)構(gòu)，這與體外培養(yǎng)的胚胎很類似。隨著體外培養(yǎng)，細(xì)胞譜系也隨之分化，SOX2⁺細(xì)胞位于中心，周圍為GATA6⁺和GATA3⁺的細(xì)胞。類囊胚中SOX2⁺與GATA6⁺分離也與人類囊胚中一致，體外培養(yǎng)第四天，類囊胚呈現(xiàn)10%的outgrowth，與體外培養(yǎng)的胚胎相類似:（1）形成羊膜腔樣結(jié)構(gòu);（2）形成卵黃囊腔樣結(jié)構(gòu);（3）分泌HCGB并形成多核細(xì)胞。根據(jù)以上結(jié)果，人類類囊胚可以自組裝成圍植入期人類胚胎結(jié)構(gòu)。

   囊胚產(chǎn)生囊胚腔對(duì)于其發(fā)揮功能至關(guān)重要。囊胚腔以緊密連接聯(lián)系密封滋養(yǎng)層細(xì)胞，盡管在小鼠中對(duì)于緊密連接研究較多，但在人類胚胎中研究比較有限。研究人員在類囊胚形成過程中連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞的微絲和緊密連接蛋白ZO1進(jìn)行免疫熒光染色，ZO1在第5天開始的外側(cè)細(xì)胞中表達(dá)，但在ICM樣的細(xì)胞中呈點(diǎn)狀表達(dá)，說明類囊胚經(jīng)歷腔隙形成，并且在滋養(yǎng)層樣細(xì)胞中緊密連接發(fā)揮功能。蛋白激酶C（PKC）調(diào)節(jié)緊密連接功能，因而對(duì)于囊胚腔形成十分關(guān)鍵。全PKC抑制劑（G?6983）可抑制類囊胚中腔隙形成，而選擇性抑制PKCα與PKCβ的抑制劑的抑制效果則不是很顯著。為識(shí)別哪一種PKC亞型發(fā)揮腔隙抑制功能更為顯著，研究人員應(yīng)用亞型特異肽抑制劑進(jìn)行抑制研究，抑制PKCδ ，PKCη ，PKCζ阻止類囊胚中囊胚腔形成，并且GATA3+細(xì)胞中幾乎不表達(dá)ZO1，PKCδ與PKCη在滋養(yǎng)層樣細(xì)胞中與ZO1重疊，因此，特異PKC亞型在類囊胚中囊胚腔形成以及功能維持發(fā)揮作用。未來仍需要大量研究去探討PKC亞型的功能發(fā)揮。

  綜上，通過利用naive人多能干細(xì)胞的胚胎及胚外雙潛能性，研究人員經(jīng)自組裝及多向譜系分化，建立了類囊胚結(jié)構(gòu)。該類囊胚的形態(tài)，細(xì)胞譜系組成以及轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)均與人類囊胚相似，并且通過體外培養(yǎng)可再現(xiàn)圍植入期胚胎發(fā)生的形態(tài)。但此模型也有待優(yōu)化，例如類囊胚形成效率因初始細(xì)胞狀態(tài)及方法的不同而不同；類囊胚形成周期長(zhǎng)且不同步；一些類胚胎與囊胚不匹配以及產(chǎn)生著床后胚胎結(jié)構(gòu)效率較低等，基于此，仍需進(jìn)一步優(yōu)化類囊胚模型。盡管如此，類囊胚仍可作為囊胚的替代模型去研究人類胚胎發(fā)生，早期發(fā)育缺陷，早期妊娠丟失及新型避孕藥。