專利名稱生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物領(lǐng)域，特別涉及生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法。
木質(zhì)素是地球上主要的可再生芳香族化合物。估計植物光合作用所固定碳中的25％為木質(zhì)素，所以木質(zhì)素在植物從太陽中所捕獲的能量中占很大比例。它是地球上僅次于纖維素的第二豐富資源，然而，對它的利用研究卻很少，是天然高分子中尚待開發(fā)的領(lǐng)城[BusweLL,J.A.et aL.,CRC生物技術(shù)評論，1987,6(1):1-10]。八十年代初發(fā)現(xiàn)了木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶(MnP)以后，近十幾年來，在木質(zhì)素酶和木質(zhì)素生物降解上取得了一定進(jìn)展。但木質(zhì)素微生物轉(zhuǎn)化降解研究中仍存在許多問題。(1)由于木質(zhì)素酶解是一種非專一性的、是以自由基為基礎(chǔ)的鏈反應(yīng)過程，因此，木質(zhì)素酶在化學(xué)工業(yè)，煤化學(xué)和環(huán)境保護方面具有很大的開發(fā)前景；而現(xiàn)有木質(zhì)素酶的制備方法大多采用合成培養(yǎng)基，以液態(tài)發(fā)酵法制得[Kirk,TK.,et aL.,酶和微生物技術(shù)，1986,8:27-32]，因這種合成培養(yǎng)基中必需添加昂貴的黎蘆醇，且發(fā)酵周期長，故生產(chǎn)成本很高，離實際應(yīng)用尚有很大距離，急需研究高效低成本體系。(2)大多研究是以木質(zhì)素模擬物作白腐菌降解特性研究，很難反映出降解過程，木質(zhì)素生物降解機制仍不清楚。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)在生產(chǎn)木質(zhì)素酶時存在的原料昂貴、生產(chǎn)成本高的缺點，提供一種新的生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法，以期達(dá)到有效利用纖維質(zhì)資源，并實現(xiàn)其生物量全利用的目的。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下以汽爆處理的纖維質(zhì)原料(以草類為好)為主要培養(yǎng)料，按一定配方制成發(fā)酵用培養(yǎng)基，以白腐菌為菌種，用固態(tài)發(fā)酵的方式生產(chǎn)木質(zhì)素酶，所產(chǎn)生的木質(zhì)素酶酶活較高，木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)為2600U/L，錳依賴木質(zhì)素過氧化物酶(Mnp)為1100U/L,Lip和Mnp生產(chǎn)率分別達(dá)到了21.667U/L.h和11.458U/L.h(以汽爆麥草為原料)，推翻了通常文獻(xiàn)[AddLeman,K.,and ArchibaLd,F.，應(yīng)用環(huán)境微生物，1993,59:266-273]報道的固態(tài)發(fā)酵幾乎不產(chǎn)生木質(zhì)素酶的結(jié)論。
本發(fā)明生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法，其特征在于該方法為(重量百分比)向75-90％汽爆處理的纖維質(zhì)原料和10-25％麩皮中，加入水溶液制成發(fā)酵培養(yǎng)基，固液比為(W/V)1∶1.5-2.5，其中所述的水溶液含有0-0.2％吐溫80,0-0.1％谷氨酸鈉，0-0.1％硫酸鎂；用無機酸調(diào)pH值4.5-6.5；滅菌，接入相對于固體料重10％(V/W)的白腐菌液體種子，以固態(tài)發(fā)酵方式發(fā)酵汽爆處理后的纖維質(zhì)原料；將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物加蒸餾水浸提5小時后，離心去除固形物，上清液為所得酶液即本發(fā)明木質(zhì)素酶。
所說的爆碎處理是指在汽爆罐中裝入粗切的纖維質(zhì)原料，于1.3-1.7MPa的蒸汽壓力下對纖維質(zhì)原料處理5-15分鐘，瞬間減壓釋放；所說的纖維質(zhì)原料是指麥草、稻草或玉米稈；所說的白腐菌是指黃孢原毛平革菌；所說的固態(tài)發(fā)酵方式是指淺盤式固態(tài)發(fā)酵。
本發(fā)明所選用的汽爆秸稈不僅為白腐菌提供了易利用的營養(yǎng)物質(zhì)如半纖維素水解物，且由于木質(zhì)素已部分被降解，其降解產(chǎn)物具有誘導(dǎo)木質(zhì)素酶產(chǎn)生的物質(zhì)，完全可以取代通常液態(tài)發(fā)酵必需添加的昂貴的黎蘆醇。這樣由于發(fā)酵原料簡單廉價，不必添加昂貴的藜蘆醇，且所得木質(zhì)素酶產(chǎn)品酶活高，產(chǎn)率高，從而，大大降低了生產(chǎn)成本。使得木質(zhì)素酶的工業(yè)化生產(chǎn)成為現(xiàn)實。
下面通過實施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。
附圖說明圖1．本發(fā)明的工藝流程示意圖；圖2．本發(fā)明固態(tài)產(chǎn)酶的動態(tài)過程示意圖。
圖中標(biāo)號■.LiP●.MnP(1)本工藝流程中，蒸汽爆碎處理是指先將原料粗切至20-30mm長，再裝入汽爆罐，于1.3-1.7MPa壓力下維壓5-15分鐘，瞬間減壓釋放即得汽爆料。
(2)本工藝流程中，發(fā)酵用培養(yǎng)基配方是指75-90％汽爆纖維質(zhì)料，10-25％麩皮，加入水溶液，固液比為1∶1.5-2.5。其中水溶液含有0-0.2％吐溫80,0-0.1％谷氨酸鈉，0-0.1％硫酸鎂，用無機酸調(diào)pH值4.5-6.5。
(3)本工藝流程中，滅菌方法為常規(guī)蒸汽滅菌方式。
(4)本工藝流程中，菌種為黃孢原毛平革菌(Phanerochate chrysosporiumEM-446)。
(5)本工藝流程中，制備酶液的方法為將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物加蒸餾水浸提5小時后，離心去除固形物，上清液為所得酶液。
(6)本工藝流程中，酶活測定按文獻(xiàn)[Tiem,M.,et aL.，國家科學(xué)學(xué)會會刊，1984,81:2280-2284.MichaeL,H.G.,etaL.，酶學(xué)方法，1988,161:258-264]。另外，為了消除色素在紫外區(qū)干擾酶活測定，我們又采用了天青蘭和酚紅在可見光測定，結(jié)果相同。實施例1汽爆麥草固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木質(zhì)素酶1．汽爆麥草將已粗切至約25mm長的麥草80kg裝入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.5MPa，維壓10min，打開放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆麥草。
2．發(fā)酵用培養(yǎng)基的制備及滅菌(重量百分比)向80％汽爆纖維質(zhì)料和20％麩皮中加入水溶液，固液比1∶2，其中水溶液含有0.1％吐溫80，0.05％谷氨酸和0.05％硫酸鎂，用0.1mol的鹽酸調(diào)pH值4.5-6.5。于大型滅菌鍋中滅菌，在0.1MPa壓力下維持50分鐘。
3．接種及裝盤發(fā)酵將已滅菌的培養(yǎng)基打散，于無菌室接入黃孢原毛平革菌液體種子(相對于固體料重為10％的接種量)，混勻，裝入已滅菌的搪瓷盤，上面覆蓋已滅菌的紗布。移入發(fā)酵室，39℃靜置培養(yǎng)5天得發(fā)酵產(chǎn)物。
4．酶液的制備發(fā)酵產(chǎn)物加20倍的蒸餾水浸提5小時，離心除去固形物，上清液為木質(zhì)素酶液。
5．利用汽爆秸稈為原料發(fā)酵生產(chǎn)木質(zhì)素酶方法的主要條件結(jié)論。
(1)．利用汽爆秸稈作發(fā)酵原料，其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的木質(zhì)素酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液態(tài)發(fā)酵(表1)。而且在兩種發(fā)酵方式中，沒有添加黎蘆醇。這說明所選用的汽爆麥草不僅為生產(chǎn)菌提供了易利用的營養(yǎng)物質(zhì)如半纖維素水解物，而且具有誘導(dǎo)木質(zhì)素酶的物質(zhì)，完全可以取代黎蘆醇。這樣，我們就可以用簡單培養(yǎng)料生產(chǎn)木質(zhì)素酶，使生產(chǎn)成本大大降低。
表1利用汽爆秸稈固態(tài)與液態(tài)發(fā)酵木質(zhì)素酶(39℃，5天)
(2)由于麩皮中含有一定量的淀粉和維生素，有利于菌體生長，加入麩皮量較大時，菌絲生長旺盛，而酶活卻最低。說明白腐菌的生長與產(chǎn)酶成反比關(guān)系。因此，汽爆麥草與麩皮之比為5∶1，木質(zhì)素酶活最高。
表2汽爆麥草與麩皮不同比對產(chǎn)酶的影響(39℃，5d，液比1∶2)
(3)利用汽爆秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木質(zhì)素酶發(fā)酵過程如圖2所示。MnP酶產(chǎn)生較早，在第四天就達(dá)到了高峰(2600U/L)；而LiP在第五天出現(xiàn)了一個產(chǎn)酶高峰(1100U/L)。LiP和MnP生產(chǎn)率分別達(dá)到了21.667U/L.h和11.458U/L.h。
實施例2汽爆玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木質(zhì)素酶1．汽爆玉米秸稈將已粗切至約25mm長的80kg玉米秸稈裝入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.7MPa，維壓5min，打開放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆麥草。
2．發(fā)酵用培養(yǎng)基的制備及滅菌(重量百分比)向80％汽爆纖維質(zhì)料和20％麩皮中加入水溶液，固液比1∶2，其中水溶液含有0.1％吐溫80和0.05％谷氨酸，用0.1mol的鹽酸調(diào)pH值4.5-6.5。于大型滅菌鍋中滅菌，在0.1MPa壓力下維持50分鐘。
3．接種及裝盤發(fā)酵將已滅菌的培養(yǎng)基打散，于無菌室接入黃孢原毛平革菌液體種子(相對于固體料重為10％的接種量)，混勻，裝入己滅菌的搪瓷盤，上面覆蓋已滅菌的紗布。移入發(fā)酵室，39℃靜置培養(yǎng)4-5天。
4．酶液的制備發(fā)酵產(chǎn)物加20倍的蒸餾水浸提5小時，離心除去固形物，上清液為木質(zhì)素酶液。利用汽爆玉米秸稈為原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木質(zhì)素酶活LiP和MnP分別為1534.08u/L和2006.22u/L。
實施例3汽爆麥草固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木質(zhì)素酶1．汽爆麥草將已粗切至約25mm長的80kg麥草裝入IM3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.3MPa，維壓15min，打開放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆麥草。
2．發(fā)酵用培養(yǎng)基的制備及滅菌(重量百分比)
向90％汽爆纖維質(zhì)料和10％麩皮中加入水溶液，固液比1∶2，其中水溶液含有0.1％吐溫80，用0.1mol的鹽酸調(diào)pH值5.5。于大型滅菌鍋中滅菌，在0.01MPa壓力下維持50分鐘。
3．接種及裝盤發(fā)酵將已滅菌的培養(yǎng)基打散，于無菌室接入黃孢原毛平革菌液體種子(相對于固體料重為10％的接種量)，混勻，裝入已滅菌的搪瓷盤，上面覆蓋已滅菌的紗布。移入發(fā)酵室，39℃靜置培養(yǎng)5天。
4．酶液的制備發(fā)酵產(chǎn)物加20倍的蒸餾水浸提5小時，離心除去固形物，上清液為木質(zhì)素酶液。利用汽爆玉米秸稈為原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木質(zhì)素酶活LiP和MnP分別為1485.00u/L和1900.00u/L。實施例4汽爆玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木質(zhì)素酶1．汽爆玉米秸稈將已粗切至約25mm長的80kg玉米秸稈裝入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.5MPa，維壓10min，打開放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆麥草。
2．發(fā)酵用培養(yǎng)基的制備及滅菌(重量百分比)向80％汽爆纖維質(zhì)料和20％麩皮中加入水溶液，固液比1∶2。于大型滅菌鍋中滅菌，在0.01MPa壓力下維持50分鐘。
3．接種及裝盤發(fā)酵將已滅菌的培養(yǎng)基打散，于無菌室接入黃孢原毛平革菌液體種子(相對于固體料重為10％的接種量)，混勻，裝入己滅菌的搪瓷盤，上面覆蓋已滅菌的紗布。移入發(fā)酵室，39℃靜置培養(yǎng)4-5天。
4．酶液的制備發(fā)酵產(chǎn)物加20倍的蒸餾水浸提5小時，離心除去固形物，上清液為木質(zhì)素酶液。利用汽爆玉米秸稈為原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木質(zhì)素酶活LiP和MnP分別為1600.00u/L和2100.00u/L。
權(quán)利要求1．一種生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法，其特征在于該方法為(重量百分比)向75-90％汽爆處理的纖維質(zhì)原料和10-25％麩皮中，加入水溶液制成發(fā)酵培養(yǎng)基，固液比為(W/V)1∶1.5-2.5，其中所述的水溶液含有0-0.2％吐溫80,0-0.1％谷氨酸鈉，0-0.1％硫酸鎂；調(diào)pH值4.5-6.5；滅菌，接入白腐菌液體種子，以固態(tài)發(fā)酵方式發(fā)酵汽爆處理后的纖維質(zhì)原料；將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物加水浸提并去除固形物，上清液為所得酶液即本發(fā)明木質(zhì)素酶。
2．如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法，其特征在于所說的爆碎處理是指在汽爆罐中裝入粗切的纖維質(zhì)原料，于1.3-1.7MPa的蒸汽壓力下對纖維質(zhì)原料處理5-15分鐘，瞬間減壓釋放。
3．如權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法，其特征在于所說的纖維質(zhì)原料是指麥草、稻草或玉米稈。
4．如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法，其特征在于所說的白腐菌是指黃孢原毛平革菌。
5．如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法，其特征在于所說的固態(tài)發(fā)酵方式是指淺盤式固態(tài)發(fā)酵。
6．如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法，其特征在于所說的白腐菌液體種子的接入量為相對于固體料重的10％。
全文摘要本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物領(lǐng)域,特別涉及生產(chǎn)木質(zhì)素酶的方法。該方法為(重量百分比):向75－90%汽爆處理的纖維質(zhì)原料和10－25%麩皮中,加入水溶液制成發(fā)酵培養(yǎng)基,固液比為1∶1.5－2.5,其中所述的水溶液可含有吐溫80、谷氨酸鈉及硫酸鎂;調(diào)pH值后滅菌,接入白腐菌液體種子發(fā)酵;將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物加水浸提,上清液為本發(fā)明木質(zhì)素酶。本發(fā)明所用培養(yǎng)原料廉價,發(fā)酵方式簡單,木質(zhì)素酶產(chǎn)率高,大大降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N9/42GK1307127SQ0010071
公開日2001年8月8日 申請日期2000年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月1日
發(fā)明者陳洪章, 劉健, 李佐虎 申請人:中國科學(xué)院化工冶金研究所
