分子診斷技術(shù)是指以DNA和RNA為診斷材料，用分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)檢測(cè)基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，從而對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的技術(shù)。其基本原理是檢測(cè)DNA或RNA的結(jié)構(gòu)是否變化、量的多少及表達(dá)功能是否異常，以確定受檢者有無(wú)基因水平的異常變化，對(duì)疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。
按技術(shù)原理，可以將上市分子診斷技術(shù)大致劃分為PCR技術(shù)、分子雜交、基因測(cè)序、核酸質(zhì)譜、生物芯片5大類。
核酸質(zhì)譜，顧名思義是一種能檢測(cè)核酸的質(zhì)譜，它是基于MALDI-TOF MS質(zhì)譜發(fā)展起來(lái)的一種相較于傳統(tǒng)的熒光定量PCR，一代測(cè)序和二代測(cè)序，它有什么優(yōu)勢(shì)呢？
基因檢測(cè)目前在遺傳性疾病，傳染病、腫瘤檢測(cè)和用藥指導(dǎo)等中發(fā)揮著重要作用，但是這些技術(shù)也存在著明顯的不足，比如熒光定量PCR，檢測(cè)通量小，面對(duì)多基因多位點(diǎn)的疾病檢測(cè)時(shí)，就如同小馬拉大車，心有余力不足！而一代測(cè)序耗時(shí)耗力，二代測(cè)序解決了通量問(wèn)題，但是耗物，耗錢(qián)，耗時(shí)更費(fèi)人。
所以核酸質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)在于成本低，通量大，檢測(cè)速度快，同時(shí)檢測(cè)多基因多位點(diǎn)不在話下。
核酸質(zhì)譜是一把高精度的天平，可區(qū)分單個(gè)堿基的質(zhì)量差異(G>A>T>C)，而核酸質(zhì)量又與堿基組成與長(zhǎng)度有關(guān)，因此在PCR預(yù)處理過(guò)程中，使用不同方法形成堿基質(zhì)量有差異的質(zhì)譜待測(cè)物，則可實(shí)現(xiàn)核酸分子的不同檢測(cè)目的。如通過(guò)單堿基延伸和分子切割的兩種生物化學(xué)技術(shù)，使得核酸質(zhì)譜可用于SNP檢測(cè)和甲基化分析。
(1)SNP檢測(cè)
單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，其在遺傳疾病的診斷和篩查以及用藥種類及劑量指導(dǎo)等方面有著極其重要的作用。
MassARRAY?可通過(guò)精確區(qū)分4種堿基的分子量差異，對(duì)SNP進(jìn)行檢測(cè)。其在PCR過(guò)程中采用了兩輪擴(kuò)增，從而生成了可用于質(zhì)譜分析的單堿基延伸產(chǎn)物，詳細(xì)技術(shù)原理如下：
①在跨越SNP位點(diǎn)的上下游區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該對(duì)引物的5’端帶有10 mer tag(ACGTTGGATG)，其目的是使第一輪PCR引物≥30bp（質(zhì)譜圖峰檢測(cè)的范圍是4500~9000 Da之間，而堿基平均分子量為300 Da，因此對(duì)應(yīng)的核苷酸檢測(cè)范圍為13~30bp，這樣第一輪PCR引物即使未能被后面的SAP完全消化，也不會(huì)出現(xiàn)在質(zhì)譜圖中）。該過(guò)程也可針對(duì)不同SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)成多重PCR，目前單個(gè)反應(yīng)可達(dá)10~60重檢測(cè)。由此擴(kuò)增出含有SNP位點(diǎn)的第一輪PCR產(chǎn)物，加入蝦堿性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)去除剩余的dNTP后，為第二輪PCR做準(zhǔn)備。
②針對(duì)每個(gè)靶點(diǎn)，在緊挨其SNP位點(diǎn)處設(shè)計(jì)一條單堿基延伸引物，并在體系中加入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，以第一輪PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行延伸，使得延伸引物在SNP位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基后即終止，由此每個(gè)SNP的等位基因延伸產(chǎn)物僅有末端一個(gè)堿基的差異。
③將第二輪PCR產(chǎn)物與樹(shù)脂混合，通過(guò)離子交換去除液體中吸附于DNA片段上的離子，再在系統(tǒng)上進(jìn)行質(zhì)譜分析獲得圖譜，根據(jù)延伸產(chǎn)物分子量的不同，于對(duì)應(yīng)各自的分子量位置查看檢測(cè)峰圖。
(2)甲基化分析
在人類基因組中，DNA甲基化一般發(fā)生在CpG位點(diǎn)（胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤位點(diǎn)），其胞嘧啶會(huì)在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下與甲基基團(tuán)結(jié)合轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶，作為一種重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，在調(diào)控基因表達(dá)、維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及胚胎發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重大作用。
MassARRAY?可通過(guò)對(duì)前期酶處理后的產(chǎn)物分析，根據(jù)堿基G和堿基A之間16 Da的分子量差異區(qū)分出甲基化和未甲基化的C，并利用各自的峰面積計(jì)算出該CpG位點(diǎn)甲基化比例，從而估算整個(gè)檢測(cè)片段內(nèi)的平均甲基化水平，詳細(xì)技術(shù)原理如下：
①通過(guò)亞硫酸氫鹽反應(yīng)將序列中未甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，而甲基化的C保持不變，由此甲基化和未甲基化的堿基分子量便開(kāi)始顯現(xiàn)出差異。
②使用5’末端帶有T7啟動(dòng)子序列的下游引物對(duì)目標(biāo)CpG島區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，形成帶有T7啟動(dòng)子的擴(kuò)增產(chǎn)物，并在擴(kuò)增后加入蝦堿性磷酸酶處理殘余dNTP。
③利用T7轉(zhuǎn)錄酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，形成與反向序列一致的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即未甲基化的C最終變?yōu)锳，而甲基化的C最終變?yōu)镚。
④在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入特異性核糖核酸內(nèi)切酶，如利用RNase A特異性識(shí)別并切割RNA中U堿基3’端的特性，將產(chǎn)物切割成各種帶有CpG位點(diǎn)的小片段RNA，形成不同分子量的檢測(cè)產(chǎn)物。最后不同片段大小的核酸在質(zhì)譜圖上的不同位置顯示，而甲基化不同也會(huì)形成分子量有差異的峰圖。
3.檢測(cè)流程
Agena Bioscience MassARRAY系統(tǒng)的檢測(cè)流程采用了自動(dòng)化高通量操作設(shè)計(jì)，PCR及延伸反應(yīng)完成后，可將PCR反應(yīng)板及SpectroCHIP芯片載入MassARRAY CPM全自動(dòng)系統(tǒng)，進(jìn)行樣品檢測(cè)并實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)分析。其檢測(cè)流程整合了高靈敏度多重PCR→高通量芯片上機(jī)→高精確度質(zhì)譜分析→自動(dòng)化報(bào)告生成，最大限度的降低質(zhì)譜操作要求，減少手工操作帶來(lái)的潛在污染及樣本操作誤差。
我們來(lái)看看核酸質(zhì)譜的應(yīng)用方向
單核苷酸多態(tài)性
人類的好多遺傳性疾病是在SNP上的，單核苷酸多態(tài)性就是單個(gè)的核苷酸序列發(fā)生了變異，引起了DNA序列發(fā)生了多樣性，比例高達(dá)1%。它也是疾病易感基因和藥物反應(yīng)差異性的決定因素。所以通過(guò)分析SNP的變異位點(diǎn)，提供疾病預(yù)測(cè)，診斷和提供用藥指導(dǎo)等。
目前熒光定量PCR適宜于檢測(cè)單基因幾個(gè)位點(diǎn)（2-8個(gè)），但是隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展，涉及到多基因多位點(diǎn)的疾病越來(lái)越多，這時(shí)傳統(tǒng)熒光定量PCR的不足就會(huì)表現(xiàn)出來(lái)，工作量大，檢測(cè)速度慢。而核酸質(zhì)譜高靈敏度、分離速度快、雜質(zhì)干擾少等優(yōu)勢(shì)，可以一網(wǎng)打盡（如耳聾基因，4個(gè)基因20個(gè)位點(diǎn)，核酸質(zhì)譜可以在一個(gè)檢測(cè)孔中解決）。
應(yīng)用：藥物基因組檢測(cè)、腫瘤易感基因
基因突變
基因突變檢測(cè)與SNP檢測(cè)原理相同，區(qū)別在于基因突變檢測(cè)存在的是突變型（發(fā)生突變后的樣子）和野生型（原來(lái)的樣子），這一點(diǎn)與SNP的純合型（比如顯性純合）和雜合型（雜合子）有所區(qū)別。圖譜峰的面積與樣品中分子量所代表的核酸片段含量成正比，故可以通過(guò)突變型/野生型的比值確定突變點(diǎn)的比例，可檢測(cè)到0.5%以上的突變比例，與金標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證技術(shù)符合度＞95%。
應(yīng)用：腫瘤突變（EGFR突變），耳聾基因篩查，地中海型貧血、代謝綜合 征、冠狀動(dòng)脈疾病等
DNA甲基化
人類基因組中含有3-5%的胞嘧啶，會(huì)在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下與甲基基團(tuán)CpG二苷酸的C’5位上，形成一個(gè)CpG島（300-3000bp），這個(gè)CpG島的甲基化水平異常提高，會(huì)抑制抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活或者一些原癌基因被激活。另外DNA甲基化還與記憶缺陷，精神分裂癥、抑郁狂躁等復(fù)雜疾病有關(guān)。
相比較其他方法，核酸質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)就在于可檢測(cè)低至5%的甲基化水平，特異性好，靈敏度高。
應(yīng)用：宮頸癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、食道癌、垂體腺瘤等
基因拷貝數(shù)鑒定
人類的基因組會(huì)出現(xiàn)一段序列缺失或者增加導(dǎo)至序列發(fā)生變化而引起產(chǎn)物變化。這種表型上的差異就是拷貝數(shù)變異（CNV），CNV涉及的DNA片段大小通常介于1kbp-3Mbp之間，在基因組中分布廣泛，其與臨床上罕見(jiàn)病、單基因病相關(guān)，也與很多腫瘤等復(fù)雜病相關(guān)。因此對(duì)CNV的變異研究，能夠?qū)Χ喾N疾病并發(fā)機(jī)制形成新的認(rèn)知，以更好地指導(dǎo)疾病的分子診斷和新治療方法的開(kāi)發(fā)。
核酸質(zhì)譜可以通過(guò)SNP的多態(tài)性等位基因比例（SAR）檢測(cè)技術(shù)對(duì)待檢測(cè)標(biāo)本中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析。
高通量檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證
美國(guó)FDA批準(zhǔn)核酸質(zhì)譜技術(shù)作為二代測(cè)序的驗(yàn)證平臺(tái)，以彌補(bǔ)一代測(cè)序儀靈敏度不足的短板。高通量測(cè)序的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1-5%，因此需要相匹配的驗(yàn)證平臺(tái)，但是一代測(cè)序靈敏度低于15%，無(wú)法提供有效的驗(yàn)證，因此，核酸質(zhì)譜作為兩者結(jié)果差異時(shí)的驗(yàn)證平臺(tái)。
場(chǎng)景一：結(jié)直腸癌KRAS基因低頻突變
解密遺傳變異與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究，質(zhì)譜腫瘤基因突變檢測(cè)分析具有成本低、高通量、高靈敏度和特異性等顯著優(yōu)勢(shì)。
場(chǎng)景二：多呼吸道病毒、多亞型同時(shí)檢測(cè)
巧妙的整合PCR技術(shù)的高靈敏度以及質(zhì)譜技術(shù)的高精確度，開(kāi)創(chuàng)了檢測(cè)精確度高、重復(fù)性強(qiáng)、具有高度自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化特征的全新檢測(cè)時(shí)代?？梢詫?duì)微生物、病毒以及其他單倍體生物方便快捷的進(jìn)行分子分型、物種鑒定、變異物種發(fā)現(xiàn)及歸類等全面分析。
場(chǎng)景三：高血壓用藥指導(dǎo)
檢測(cè)到1%-3%突變等位基因，在個(gè)體化用藥、耐藥及新藥篩選等臨床項(xiàng)目中，可以盡早檢出突變，幫助臨床醫(yī)生改善治療方案。
應(yīng)用領(lǐng)域小結(jié)
目前核酸分析所使用的質(zhì)譜電離技術(shù)主要還是采用 ESI 和MALDI。簡(jiǎn)單來(lái)講，兩種電離技術(shù)都是軟電離，ESI 檢測(cè)的特點(diǎn)是生物大分子帶多個(gè)電荷，質(zhì)荷比范圍基本在2000 Da 以下區(qū)間，從而能檢測(cè)幾萬(wàn)乃至更大的生物分子；而MALDI 常得到單電荷峰，與飛行時(shí)間(TOF)分析器搭配，檢測(cè)范圍可以到幾十萬(wàn)道爾頓。
由于生物樣品的復(fù)雜性，質(zhì)譜技術(shù)還面臨著一些挑戰(zhàn)和困難。但生物質(zhì)譜技術(shù)是科學(xué)研究的有力工具，隨著臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)質(zhì)譜的了解和應(yīng)用不斷的加深，未來(lái)該檢測(cè)平臺(tái)或可成為規(guī)范實(shí)驗(yàn)室不可或缺的標(biāo)準(zhǔn)裝備。分子診斷技術(shù)的應(yīng)用不僅深化對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，而且不斷擴(kuò)大了分子診斷疾病的病種，隨著人類基因組計(jì)劃的完成和蛋白質(zhì)組計(jì)劃的啟動(dòng)，分子診斷方法將極大地推動(dòng)現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，并通過(guò)這些基本技術(shù)的衍生、聯(lián)合產(chǎn)生新的分析方法，從而提高分子診斷的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，為臨床醫(yī)學(xué)診斷和治療提供更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)和信息。
參考文獻(xiàn)
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