娃娃魚微藻生態(tài)因子與培養(yǎng)方法
第一節(jié)微藻在大鯢繁殖重要地位
微藻在大鯢繁殖與養(yǎng)殖中占有重要地位，它不僅是娃娃魚優(yōu)良天然餌料，亦是娃娃魚性腺發(fā)育成熟的物質(zhì)基礎(chǔ)。娃娃魚生長發(fā)育取決于藻相營養(yǎng)成分，特別是一些特殊營養(yǎng)成分如氨基酸、脂肪酸、維生素及礦物質(zhì)的含量則顯得更為重要。娃娃魚產(chǎn)卵量與質(zhì)量，娃娃魚精液質(zhì)量取決于藻相中必需氨基酸和多不飽和脂肪酸籌。
當親體餌料中富含ω- 3 高度不飽和脂肪酸(尤其是EPA 和D HA) 的 藻相時,娃娃產(chǎn)卵量和孵化率都顯著地提高( P < 0. 01) ,表明了餌料中適量的EPA 和D HA 是親體正常繁殖所必需,娃娃魚屬只有有限的能力對18 碳脂肪酸進行鏈增長和增不飽和度而成為EPA 和D HA, 因而如餌料中只含18 碳多不飽和脂肪酸而無EPA 和D HA 是不能滿足親體正常繁殖的需要的,一些研究表明,D HA 對魚卵的孵化有促進作用,Shimma 等[ 1977 ]發(fā)現(xiàn)了當鯉魚卵中D HA 的含量少于10 %時,卵的孵化率很低。娃娃魚餌料中若不含EPA 和D HA ,親體即不產(chǎn)卵,高度不飽和脂肪酸是娃娃魚屬卵黃產(chǎn)生所必需的。
娃娃魚親體的產(chǎn)卵量與卵中的EPA 含量有相關(guān)性, 而卵中的D HA含量與卵的孵化率有相關(guān)性, 這說明EPA 在與親體產(chǎn)卵有關(guān)的卵巢發(fā)育過程中起重要的作用,而D HA 在胚胎的發(fā)生發(fā)育中起某種特別的作用,而與卵孵化率有關(guān)。它們起誘導(dǎo)細胞分化的作用,這兩種磷脂酰膽堿分子分別包含了16∶0 加22∶6ω3 和18∶1ω9 加22∶6ω3 ,這些學(xué)者提出含有D HA的脂肪或D HA 本身在細胞分化和胚胎發(fā)育過程中起一種重要的作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的產(chǎn)生和發(fā)育是所有動物胚胎發(fā)育的一個重要組成部分,一些研究表明,ω- 3 高度不飽和脂肪酸,特別是D HA 在魚類胚胎發(fā)生過程中,對腦和神經(jīng)的發(fā)育至關(guān)重要[Moure nte 和Toche r 1992 ;Toche r 等1992 ] ,哺乳類動物也同樣[Neuringe r 等1986 ; Ka nazawa 等1991 ] ,ω- 3 高度不飽和脂肪酸也是甲殼類的胚胎發(fā)育過程中的重要因素, D HA 在胚胎發(fā)育過程中的這兩方面的作用有助于解釋卵中D HA 含量與孵化率之間的相關(guān)關(guān)系。
娃娃魚親體的產(chǎn)卵,卵質(zhì)和餌料中的脂肪酸種類密切相關(guān),若在餌料中只含有18 碳ω- 3 和ω- 6 多不飽和脂肪酸,飼喂的親體不能維持正常的卵巢發(fā)育和產(chǎn)卵量,也不能保證卵胚胎的正常發(fā)育和正常的卵孵化率。娃娃魚的18 碳ω - 3 不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化成20 碳至22 碳高度不飽和脂肪酸的能力非常有限,因此親體餌料中必需含有適量的長鏈高度不飽和脂肪酸,特別是EPA 和D HA 。
娃娃魚在性腺發(fā)育前積累的大量脂類，除了為生殖等活動提供代謝能外，還是雌性生殖細胞發(fā)育過程中必需儲存的重要能源和結(jié)構(gòu)物質(zhì)，其中必需脂肪酸(EFA)是磷脂和固醇類(生物膜主要結(jié)構(gòu)成分)生物合成中的重要結(jié)構(gòu)組分或轉(zhuǎn)運因子，它對胚胎發(fā)育進程及早期仔魚的存活至關(guān)重要¨ 。繁殖期間若缺乏EFA，會影響親魚的產(chǎn)卵數(shù)以及卵的發(fā)育質(zhì)量，導(dǎo)致魚卵孵化率下降。
對于雌性親魚，來自藻相中的的天然脂類、體內(nèi)儲存的脂肪以及重新合成的脂類，通過卵黃蛋白原(vitellogenin，富含極性脂)和其它脂蛋白(富含非極性脂，主要是TAG) 轉(zhuǎn)移到卵母細胞中，因此通過卵黃蛋白原或卵黃蛋白的含量變化可以了解娃娃魚性腺的成熟度及其變化情況 。娃娃魚是卵脂儲存在脂蛋白中。脂蛋白脂主要是極性脂，特別是卵磷脂(Pc)和磷脂酰乙醇胺(PE)以及以二十二碳六烯酸(22：6n一3，DHA)為主的n一3系列高不飽和脂肪酸(n一3HUFA)；油球由甘油三酯(TAG)、蠟酯(wax ester)等中性脂組成，并含單不飽和脂肪酸(MUFA) 。蠟脂的形成，可能為從氨基酸和葡萄糖前體快速轉(zhuǎn)化成脂類的一種生化機制 ，它的作用是運輸和儲存分子(尤其當碳骨架受限制時)、提高浮性(蠟脂的比重小于甘油三酯)以及調(diào)控通透性和作為能量儲存 。娃娃魚的研究結(jié)果顯示：脂類組成的季節(jié)變化與性腺的成熟 ，和其卵黃的脂類組成、積累和利用有關(guān) 。貯存在魚卵和仔魚中供能用的脂的質(zhì)和量，以及高不飽和脂肪酸的含量，都與產(chǎn)卵前的性成熟過程中的營養(yǎng)攝入有關(guān)，并直接來自親魚在性腺發(fā)生過程中儲存的脂類¨ 。
第二節(jié)微藻生態(tài)因子
1 、溫度
溫度是影響微藻脂肪含量和脂肪酸種類的重要因子之一(Ackman et a1．1968；Thompson et a1．1992a、b)。早期研究表明，在極端高溫或低溫條件下，微藻合成脂肪的量減少(Aaronson 1973；Opute 1974)。Opute(1974)認為存在脂肪合成的最適溫度，且因種而異。他指出極端溫度下合成受限可能是相關(guān)的酶發(fā)生不可逆損傷所致。在水環(huán)境中，溫度一個極為重要的生態(tài)因子。生物的生長需要有一定的溫度范圍，在這一溫度范圍內(nèi)，生物才能進行其正常的生長繁殖等生命活動，稱為適溫范圍。在適溫范圍內(nèi)，又可分為最適溫度范圍、最低適應(yīng)溫度（低限）和最高適應(yīng)范圍溫度（高限）。最適溫度范圍是指生物生長繁殖最快、生命活動最理想的溫度范圍。若溫度超出最低適溫和最高適溫，生物的生命活動就要受到影響。微藻生長的最適溫度范圍也不是一成不變的，可隨著光照強度和某些營養(yǎng)物質(zhì)的濃度而改變。連續(xù)培養(yǎng)新月菱形藻發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)液中硝酸鹽和磷酸鹽濃度相似于天然淡水中的濃度時其生長最適溫度低，當它們的濃度高于天然淡水中的濃度時，其最適溫度范圍較高。當溫度變化超出適溫范圍時，即對生物產(chǎn)生嚴重的危害作用，甚至死亡。但在高溫條件下影響更嚴重，死亡更快。一些生態(tài)學(xué)家認為，高溫對生物的危害是化學(xué)性的，而低溫對生物的危害是機械性的。硅藻的適溫范圍是8--25度，在25度時，能在一天內(nèi)保持恢復(fù)繁殖的能力.
2、
光照微藻和所有的綠色植物一樣，只有在有光照的條件下，才能進行光合作用。光在微藻培養(yǎng)中是影響生長最重要的因子之一。
（1）光源
微藻培養(yǎng)光源主要是太陽光，其次可利用人工光源。使用人工光源，光照時間和光照強度都容易控制，但成本高，一般只在實驗室使用。在生產(chǎn)中，只有陰天下雨陽光不足時，才補充人工光源。常用的人工光源有日光燈、白熾燈、碘鎢燈、生物效應(yīng)燈等。微藻的光合作用以及藻體的生長發(fā)育，受到光照強度的影響，微藻在進行光合作用時，對光照強度的適應(yīng)，有一定的范圍。光照強度用照度計測定，其單位是勒克斯（lx），也可用米燭光來表示。1勒克斯=1米燭光
表11---1
表11--2五種硅藻中各種脂肪酸占總脂肪酸的比例%
硅藻種類 舟形MMDL 大菱形藻 舟形藻 舟形藻 雙眉藻
C14:0 3.35 4.99 5.67 3.02 9.16
C15:0 0.52 0.26 0.27 — —
C16:0 52.28 27.34 45.27 29.44 6.88
C16:1(n-7) 25.35 45.92 36.20 33.56 38.55
C18:0 0.15 — 0.16 — —
C18:1(n-9) 1.44 1.07 0.79 2 .14 2.86
C18:2(n-6) 1.63 0.34 1.31 0.931.94
硅藻種類 舟形藻M 大菱形藻 舟形藻a 舟形藻n 雙眉藻
C18:3(n-3) — 0.61 0.83 — —
C20:1(n-9) — — — — —
C20:4(n-6) 3.28 0.90 0.47 2.80 0.78
C20:5(n-3) 2.48 5.32 2.08 4.01 17.04
C22:6(n-3) 0.17 — 0.17 — —
其他脂肪酸成分 9.35 13.27 6.79 24.10 22.79
總脂肪酸/% (DW) 6.16 9.21 12.92 4.39 7.99
表11---3
表11--4綠藻干燥藻體中含有之營養(yǎng)素
綠藻100g中的成含量
主要營養(yǎng)素
熱 量
395 kcal
蛋 白 質(zhì)
68.5 g
脂 肪
11.8 g
灰分
8.4 g
糖
0 g
膳食纖維
7.5 g
其它營養(yǎng)素
葉綠素
2,480 mg
類胡蘿卜素
347 mg
葉黃素 (Lutein)
72.6 mg
β -胡蘿卜素
53 mg
CGF含量
2.4 (A260/mg)
維生素
維生素A
3,800 μg
維生素B1
2,020 μg
維生素B2
6,620 μg
維生素B6
3,170 μg
維生素B12
46 μg
維生素C
42,000 μg
維生素D
186 μg
維生素E
5,500 μg
維生素K1
711 μg
煙堿酸
34,500 μg
葉酸
3,300 μg
泛酸
3,700 μg
生物素
313 μg
礦物質(zhì)
鈉
106 mg
鈣
441 mg
鐵
216 mg
鎂
337 mg
磷
2,010 mg
鉀
1,270 mg
錳
9.26 mg
鋅
2.16 mg
（2）適光范圍
適光范圍是指微藻細胞能進行正常生長繁殖的光照強度范圍。不同微藻的適光范圍不同，在適光范圍內(nèi)，光照強度增加，光合作用速度加快，光合作用或細胞分裂速率達到最大值時的光照強度稱為最適光照強度或稱飽和光照強度。達到飽和光照強度后，光照強度增加，光合作用反而減弱以至受到抑制。適光范圍的低限，是補償光照強度。在這樣光照強度下，微藻呼吸作用消耗的氧氣與光合作用放出的氧氣恰好相等，此時細胞只能維持基礎(chǔ)代謝，不能生長，只有當光照強度高于補償光照強度時，微藻才能生長，光強度低于補償光照強度時，不僅不能生長，而且還消耗體內(nèi)儲存物質(zhì)，使細胞干重下降。
水生植物吸收營養(yǎng)元素的一般規(guī)律
（3）米氏方程
——微藻細胞對營養(yǎng)鹽的吸收是一個復(fù)雜的生物化學(xué)酶促反應(yīng)過程，其反應(yīng)速度和底物濃度的關(guān)系符合一般酶促反應(yīng)的動力學(xué)方程——Michaelis-Monten方程。
式中V為酶促反應(yīng)速度，即底物消失速度或產(chǎn)物生成速度；
S為限制性底物的濃度；
Vmax為最大反應(yīng)速度，即[S]足夠大時的飽和速度；
Km為米氏常數(shù)，又稱為半飽和常數(shù)。
（2）半飽和常數(shù)的意義
半飽和常數(shù)值可作為微藻細胞能正常生長所需維持水中有效形式營養(yǎng)鹽的臨界濃度，也可用于比較不同浮游植物吸收營養(yǎng)鹽能力的大小。
在光強、水溫及其它條件適宜而營養(yǎng)鹽含量較低時，Km值越小的浮游植物越容易發(fā)展成為優(yōu)勢種；Km值越大的浮游植物會因缺乏營養(yǎng)鹽使生長受到限制。而當營養(yǎng)鹽過于豐富時，浮游植物群落結(jié)構(gòu)會發(fā)生明顯變化，可能導(dǎo)致某些有害浮游植物的迅速繁殖。 通過試驗，測定不同種類浮游植物對營養(yǎng)鹽吸收反應(yīng)的半飽和常數(shù)值具有重要意義。 與 之間具有線性關(guān)系.當 ，即可得 值。
米氏方程僅符合于正常微藻細胞對營養(yǎng)鹽的吸收規(guī)律。
(3)光強
光是單胞藻培養(yǎng)中影響其生長及生化成分變化的最重要的因子之一。小新月菱形藻(Nitzschiaclosterium f．minutissima)和等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke)8701的研究發(fā)現(xiàn)，低光下兩種藻的脂肪含量多而高光下則相反(石娟等2004)。在對其它餌料微藻的研究中得到了相似的結(jié)果(Emdadi el a1．1989)。有實驗表明，增加光強能夠促進脂肪酸含量的增加，如Chlorella vulgaris和Euglena gracilis中多不飽和脂肪酸16：2(n一6)、16：3(n-6)、16：4(n-3)、18：2(n一6)和18：3(n一3)(Pohl el a1．1979)；Chaetoceros gracilis中的16：2(n一4)、16：3(n一4)(Mortenson ela1．1988)。然而更多的研究顯示，生長在高光強下的微藻，其不飽和脂肪酸的比例降低，
（4）其它因素的影響
光照對進行光合作用細胞的作用是復(fù)雜的，在分析光對微藻細胞生長的作用時，必須考慮各種因素之間的綜合作用。 首先，受溫度的影響十分顯著。溫度通過對微藻細胞新陳代謝速度的影響，而影響微藻細胞對光照強度的要求。在低溫下，新陳代謝緩慢，要求的補償光照強度較低，造成有害作用的光照強度也較低。例如：在7攝氏度時，光照強度為2000lx，小球藻顏色變淡?！∑浯危瑺I養(yǎng)鹽濃度對其影響也較大。在低光照時，營養(yǎng)鹽濃度對生長率無影響。在中光下，則表現(xiàn)出營養(yǎng)鹽濃度增加，光合作用加強的趨勢，而且高營養(yǎng)鹽濃度可使細胞在較強的光照下快速生長。 另外，二氧化碳的供給、酸堿度等環(huán)境因子對光照的作用也有重要影響。
3、鹽度
水是一種富含各種鹽類的溶液，地球上不同水域的水，含鹽量的差別很大。淡水水域的含鹽量在0.01-0.5之間，半咸水含鹽量為0.5-16.0，淡水水域的含鹽量為16.7-47.0，超鹽水域的含鹽量在47.0以上，大洋水和徑流降水較少的海區(qū)的鹽度一般在35左右。 水中含鹽量的表示方法有多種，而“鹽度”是最常用的。鹽度是每千克淡水中所含溶質(zhì)的總克數(shù)。淡水的鹽度、氯度和比重之間有密切關(guān)系，可互相換算。 淡水鹽度對微藻的影響，主要表現(xiàn)在滲透壓和比重兩個方面。也有適鹽范圍、最適鹽范圍、適鹽高限和適鹽低限等。以骨條藻為例，其適鹽范圍為7-50，最適鹽度范圍為25-30，適鹽低限和適鹽高限分別為7和50。
4、營養(yǎng)鹽
微藻的營養(yǎng)元素分為大量元素、微量元素和輔助生長物質(zhì)三部分。微藻生長必須的每一種元素都有一個最低量（低限），如果低于最低限，則對生長繁殖起抑制作用。但當某種營養(yǎng)萬分含量過高（超出高限）時，也會對微藻產(chǎn)生毒害作用，影響其生長繁殖，甚至死亡，后者的危害比前者更為嚴重。需要特別注意的是，微量元素的適量和致毒量之間的幅度很小。
5、二氧化碳
培養(yǎng)微藻的水環(huán)境中，二氧化碳呈現(xiàn)各種形式，即游離態(tài)二氧化碳（CO2）、碳酸（HCO-3）、碳酸氫鹽（HCO-3）和碳酸鹽（CO2-3），各種存在形式在水中可互相轉(zhuǎn)化。微藻在光合作用中，對二氧化碳的吸收，以游離態(tài)二氧化碳為主，也可吸收以HCO-3和CO2-3形式存在的二氧化碳。水中二氧化碳不足，會影響光合作用的效率。通常淡水中所有形式二氧化碳的總濃度是充足的，在天然水域中不會限制微藻的光合作用。但在人工培養(yǎng)微藻的情況下，微藻細胞的密度很大，白天光合作用進行頻繁，二氧化碳的供應(yīng)往往不足，成為光合作用的限制因子，影響微藻細胞的生長繁殖。水中二氧化碳的來源，主要來自有機物的分解，在微藻培養(yǎng)中，使用有機肥料對保證二氧化碳的供應(yīng)有一定的作用。此外在生產(chǎn)性的培養(yǎng)中還可采用以下措施。（1）通入含1%-5%二氧化碳的混合空氣，效果好，但要防止過量致毒。（2）通入普通空氣（含二氧化碳0.03%），通過微小氣泡增加水和空氣的接觸面，使空氣中的二氧化碳溶入培養(yǎng)液中。（3）通過攪拌增加水與空氣的接觸面，使空氣中的二氧化碳溶于培養(yǎng)液中。（4）向培養(yǎng)液中添加碳酸鹽。第一種方法效果最好，但成本高設(shè)備復(fù)雜。目前生產(chǎn)上一般采用第二種方法。
6、（酸堿度）
各種微藻對酸堿度都有一定的適應(yīng)范圍。如扁藻的適應(yīng)PH值為5-9.5，最適PH值范圍為7.0-8.5。天然淡水中的PH值比較穩(wěn)定，一般為8.1-8.3。但在人工培養(yǎng)條件下，由于各種營養(yǎng)元素的影響和微藻代謝作用的影響，PH值變化較大，有可能超出其適應(yīng)范圍，影響微藻細胞的生長。最常見的是由于微藻光合作用吸收二氧化碳及利用碳酸鹽而造成的PH值上升現(xiàn)象。在微藻培養(yǎng)中，測定、了解PH值的變化，以便其變化超出微藻細胞的適應(yīng)范圍時采取相應(yīng)的措施，是十分必要的。元素與食物鏈及生物鏈。就物理學(xué)的基本論述，宇宙里所有生物、植物與眼見的物項，全部都是由元素所組成，當物項被其它元素衍化（如氧化）后，所有的元素還是會回到大自然，最顯見的案例：
(1).生物死亡后肉身腐敗后僅剩毛發(fā)與骨頭，有的在幾年內(nèi)就會全數(shù)消失，有的則經(jīng)百年后亦全部消滅殆盡，于百年還能存在的一般都是因地殼變動入土離氧成化石或經(jīng)人為保存如木乃伊。死掉的生物尸體之所以會消失，只要的因素是組成軀體的元素在組織敗壞后氧化再度回歸大自然，只是這些元素非單位元素它是屬復(fù)方元素，復(fù)方元素的形成與轉(zhuǎn)換與衍化須借助有組織功能的軀體，當軀殼消滅后復(fù)方元素也會隨組織的回歸大自然。有大量復(fù)方元素的地方比較容易產(chǎn)生流行性病菌毒，因為病菌毒中的元素成份就是衍生病菌毒的養(yǎng)源。
(2).植物死亡后的植物只要不是離氧由地底保存的地表植物體，死亡后也一樣不出百年都會腐敗與消失，植物體也是由元素組成，因此死亡后的植物體也會因氧化將組織元素回歸大自然。在植物成長過程如曾下過藥物品，物品亦會將組織樹體的元素轉(zhuǎn)為復(fù)方元素，長久性生存于復(fù)方元素的植物，會改變原本植物的有機值。最明顯的案例就是：臺灣有人將大陸的當歸移植于臺灣種植，因地表土質(zhì)與水質(zhì)的元素不相同原產(chǎn)地，回臺灣后移植的當歸還是有收成 但其效果僅原產(chǎn)地的1/10。
(3).礦石土壤與石塊等也是由元素組成，土壤與礦石因為它不是生物，不像生物與植物可供觀察，但所有的礦石還是會因氧而分解與腐朽后，土壤元素亦回歸大自然，無論是已成型或未成型的物項都是元素，如地底下的巖漿，地球上至今已發(fā)現(xiàn)120種左右的單位元素，這些元素就是組成地球動植物初始的基本要項，也是基本養(yǎng)源，生物衍化與成長全部都是操控在這些元素里，各種元素有它基本的比重與酸堿值，元素里的酸堿是主導(dǎo)該水域長出哪一種水中生物或陸上生物的必要條件. 因此你們能在漢中抓到國寶級娃娃魚，你不可能在其它水域也取的國寶級娃娃魚，白人與黑人的分際點不是因為白人住在寒冷地帶所以長為白人，而黑人就是長在熱帶所以便成黑人，之所以有黑白人明顯之分，也是來自當?shù)貐^(qū)的土壤與水中元素，之所以會有高低鼻梁之分際也是來自于元素。因此找出產(chǎn)地魚的初始水質(zhì)，首重工作就是由酸堿值著手，這是水中生物繁殖不可泯滅的定理，因為只有產(chǎn)地的水里才會有單位元素不是復(fù)方元素。簡單講就是未被其它藥物品或空氣所污染的水質(zhì)檢測出的酸堿值，才是繁殖娃娃魚的基本水質(zhì)，因為該水質(zhì)里沒有病菌毒的共同養(yǎng)源，源自水中沒有另類的復(fù)方元素。
7、生物因子
微藻的生長繁殖除受環(huán)境的理化因子影響外，還必須考慮生物之間相互關(guān)系的影響因為在生產(chǎn)性培養(yǎng)中是有細菌存在的，同時要絕對防止其它生物的污染是很困難的，這些污染生物與培養(yǎng)微藻的關(guān)系和對培養(yǎng)微藻的影響，應(yīng)該作為一種環(huán)境因子看待，叫做生物因子。 生物因子對微藻的影響有促進生長和抑制生長兩個方面。 促進生長的例子：某些微藻（如日本星桿藻、骨條藻等）必須在有細菌存在的條件下才能生長良好，否則，即使加了許多營養(yǎng)物質(zhì)和添加劑，生長也不好。 危害生長的例子：吞食、寄生和抗生等。微藻在代謝過程中能產(chǎn)生某些物質(zhì)（稱為抗生素）能夠抑制另外一種微藻或其它生物的生長繁殖。例如實球藻培養(yǎng)液能抑制小球藻和菱形藻的生長。 一種抗生素對不同生物的抑制效果是不同的，有些種類可能受強烈抑制，而另一些種類又可能影響極弱。此外抗生素濃度越大，抑制能力就越強。所以在微藻培養(yǎng)中，只要培養(yǎng)微藻占優(yōu)勢，就能產(chǎn)生大量的抗生物質(zhì)，抑制其它可能性污染生物的生長。相反，如果培養(yǎng)微藻生長不好，在培養(yǎng)液中不能占優(yōu)勢，污染生物就有可能大量繁殖，最后把培養(yǎng)微藻壓下去，造成培養(yǎng)的失敗。
第三節(jié)微藻培養(yǎng)液的成分
一、主要元素
微藻培養(yǎng)液中包括的主要營養(yǎng)元素（即大量元素）有氮（N）、磷（P）、鐵（Fe)、鉀（K）、鎂（Mg)、硫（S）、鈣（Ca)，硅藻培養(yǎng)液中還有硅（Si)。
1、氮（N）
氮是生物細胞中蛋白質(zhì)的主要組成物質(zhì)，約占蛋白質(zhì)含量的16%-18%，氮源是否充足對微藻的培養(yǎng)至關(guān)重要。常見的氮源有硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、尿素、發(fā)酵人尿等，其中以硝酸鈉和硝酸鉀最常用。不同的微藻對硝酸態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收利用情況是不同的，需要根據(jù)不同的微藻選擇合適的氮源。氮元素的用量為5×10-6—80×10-6，常用量為15×10-6—30×10-6 ；換算成硝酸鹽的用量約為100×10-6—200×10-6 。
2、磷（P）
磷在生物體內(nèi)主要參與蛋白質(zhì)和磷脂的組成，也是許多酶和維生素的組成元素。此外，無機態(tài)磷也存在于植物體內(nèi)，并對其代謝活動有重要意義。常見的磷肥有：磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉。微藻培養(yǎng)中磷元素的常用量為1×10-6-4×10-6，換算成磷酸二氫鉀的用量為10×10-6。
3、鐵（Fe)
鐵在植物體內(nèi)有促進葉綠素合成的作用，也是許多氧化酶的重要組成成分。生產(chǎn)上常用的鐵肥是檸檬酸鐵銨的。無機鐵在培養(yǎng)液中易形成膠體復(fù)合物而產(chǎn)生沉淀，不易于保持一定的濃度，因此盡管鐵在數(shù)量上所需很少，但要滿足微藻的需要卻很困難。
4、鉀（K）
在生物體內(nèi)，鉀的作用主要不是結(jié)構(gòu)功能，而是代謝功能。常用的鉀肥有氯化鉀、硝酸鉀、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等。自然淡水中鉀元素的含量較高（380×106 ），用淡水配制培養(yǎng)液時，一般不需另施鉀肥。
5、鎂（Mg)
鎂是葉綠素主要組成物質(zhì)之一，同時又與磷酸結(jié)合，對植物的生命過程起調(diào)節(jié)作用。自然淡水中鎂的含量較高（1200毫克/升以上），一般不需另加。如需加則用硫酸鎂或氯化鎂，可以單獨使用一種，也可兩種同時使用。
6、硫（S）
硫是蛋白質(zhì)的重要組成成分之一，培養(yǎng)液中的硫元素一般可在加入其它元素的硫酸鹽類（如硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鐵等）的同時獲得。
7、鈣（Ca）培養(yǎng)興高采烈中鈣的來源，常加入氯化鈣或硝酸鈣。
硅（Si)微藻的生命活動需要較多的硅，硅藻培養(yǎng)液中常添加硅酸鈉來補充對硅的需求，一般用量為10--15×10-6。
二、微量元素
微藻培養(yǎng)液中常用的微量元素有以下十余種，其用量一般為0.5×10-9—50×10-9?，F(xiàn)將其名稱及所使用的化合物列入表11-4。
表11--4 微藻培養(yǎng)液中常用微量元素及所使用的化合物
元素名稱
使用的化合物
硼（B）
硼酸（H3BO3），焦性硼酸鈉（Na2B4O7
錳（Mn)
硫酸錳（MnSO4),氯化錳（MnCl2)
鋅（Zn)
硫酸鋅（ZnSO4)，氯化鋅(ZnCl2)
銅（Cu)
硫酸銅(CuSO4)，氯化銅(CuCl2)
鉬(M0)
鉬華(MoO3)，鉬酸銨[(NH4)20·7MoO3]
鈷(Co)
氫化鈷(CoCl2)
鈦(Ti)
氯化鈦(TiCl2)
鎢(W)
鎢酸鈉(Na2WO4)
鉻(Cr)
硫酸鉻鉀[CrK(SO4)2]，鉻酸鉀(K2Cr4)
鎳(Ni)
硫酸鎳(NiSO4)
釩
V)
釩酸鈉(NaVO3)，釩酸銨(NH4VO3)
鎘(Cd)
氯化鎘(CdCl2)
鍶(Sr)
硫酸鍶(SrSO4)
使用微量元素時，常加絡(luò)合劑防止沉淀。由于微藻對微量元素的需
和致毒量的差距一般很小，略超過其需要量即可引起毒害，所以，在使用微量元素時，需注意用量大小。
9、輔助生長有機物質(zhì)
輔助生長有機物質(zhì)能促進微藻細胞的生長繁殖，增強微藻細胞對環(huán)境的適應(yīng)能力，微藻培養(yǎng)中常用的輔助生長有機物質(zhì)有維生素B12、維生素B1（硫胺素）、維生素B2、維生素B6、維生素H（生物素）、檸檬酸、煙酸、對氨安息香酸等。
三、土壤抽取液
土壤抽取液含有微藻生長需要的微量元素和輔助生長有機物質(zhì)，在培養(yǎng)液中加入適量的土壤抽取液，一般能取得良好效果。土壤抽取液的制作簡單，常用的方法有以下2種。
1、土壤抽取液（1）
土壤1千克加1升純水，煮沸60分鐘，暗處放置兩天后過濾，取濾液600毫升加純水400毫升使用。
2、土壤抽取液（2）
土壤1千克加純水1升，再加入NaOH2-3克，煮沸120分鐘，冷卻過濾后作用。
四、絡(luò)合物
絡(luò)合物的作用主要是使之與鐵等微量金屬離子結(jié)合形成絡(luò)離子，以防產(chǎn)生沉淀。絡(luò)合離子可不斷釋放金屬離子為微藻所吸收利用。最常見的是乙二胺四乙酸（EDTA）或其鈉鹽（用量約在50×10-6）。
第五節(jié)常用微藻培養(yǎng)液配方
微藻種類不同，培養(yǎng)液的配制方法也不同，即使同一種類，個人的慣用方法也不同?，F(xiàn)將硅藻、綠藻常用的培養(yǎng)液配方介紹如下：
一、硅微藻培養(yǎng)液
1、 硅藻門
(1)三角褐指藻 Phaeodactylum tricornutum% D2 `- g, R; e( p
【分類】硅藻門，羽紋綱，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻屬
【形態(tài)構(gòu)造】卵形、梭形、三出放射形三種形態(tài)的細胞。這三種形態(tài)的細胞在不同的培養(yǎng)環(huán)境下可以相互轉(zhuǎn)變。在正常的液體培養(yǎng)條件下，常見的是三出放射形細胞和梭形細胞，這兩種形態(tài)的細胞都無硅質(zhì)細胞壁。三出發(fā)射形態(tài)的細胞壁有三個“臂”，臂長皆為6～8微米，細胞兩臂端間的垂直距離約為10～18微米。細胞中心部分有一細胞核和1～3片黃褐色的色素體。梭形細胞長約20微米，有兩個略鈍而彎曲的臂。卵形細胞長8微米，寬3微米，只有一個硅質(zhì)殼面，無殼環(huán)帶，和具有雙殼面和亮環(huán)帶的一般硅藻不同。在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)可出現(xiàn)卵形細胞。三出放射形三角褐指藻 梭形三角褐指藻卵形三角褐指藻。
【繁殖方式】一般為平行分裂，分裂成為兩個形態(tài)相同的細胞，因無硅質(zhì)殼，分裂時細胞不會縮小。; o- `9 ?! k7 e+ k/ o
【生態(tài)條件】生存鹽度為9‰～92‰，最適生長鹽度為25‰～32‰。生長適溫為5℃～25℃，最適溫度為10℃～20℃，超過25℃時停止生長，最終大量死亡。光照強度1000～8000lx，最適光照強度3000～5000lx，切忌陽光直射。pH值在7～10環(huán)境下，均能上生長繁殖，最適pH值為7.5～8.5。
(2)小新月菱形藻 Nitzschia closterium(f. minutissima)
【分類】硅藻門，羽紋綱，雙菱形目，菱形藻科，菱形藻屬4 {4 F# r9 U【形態(tài)構(gòu)造】小新月菱形藻俗稱“小硅藻”，是單細胞浮游硅藻，具硅質(zhì)細胞壁，細胞臂殼面中央膨大，呈紡錘形，兩端漸尖，皆朝同方向彎曲，似月牙形。體長12～23微米，寬2～３微米，細胞中央具一細胞核。色素體2片，位于細胞中央細胞核兩側(cè)。4 m g, j- N7 i& C# q【繁殖方式】主要為縱分裂繁殖。
【生態(tài)條件】新月菱形藻對鹽度的適應(yīng)范圍較廣，鹽度在18‰～61.5‰之間都能生火，最適鹽度25‰～32‰。其生長適溫范圍為5℃～28℃，最適溫度范圍15℃～20℃。當水溫達到28℃以上，藻細胞則停止生長繁殖，藻體大量下沉、凝聚、結(jié)塊，最后變白而大量死亡。最適光照強度為3000～8000lx，切忌陽光直射，否則導(dǎo)致細胞色素體損壞，藻體變白死亡。新月菱形藻對pH值的適應(yīng)范圍較廣，pH值在7～10環(huán)境條件下，均能生長繁殖，pH值最適范圍是7.5～8.5。3 v/ S/ a4 k6 Z7 (3)牟氏角毛藻 Chaetoceros muelleri
【分類】硅藻門，中心綱，盒形藻綱，角毛藻科，角毛藻屬5 F9 @" N$ L【形態(tài)構(gòu)造】牟氏角毛藻細胞小型，多數(shù)呈單細胞，有時2～3個組成群體。殼面橢圓形到圓形，中央部略凸出，殼環(huán)面呈長方形至四角形。細胞大小為（4.0～4.9）×（5.5 ～8.4）微米（環(huán)面觀）。角刺細長，圓弧形，末端稍細，約20微米。色素體1個，呈片狀，黃褐色?！痉敝撤绞健繜o性為二分裂繁殖。當環(huán)境不良時可形成休眠包子，此外，也能形成復(fù)大胞子。
【生態(tài)條件】牟氏角毛藻為沿岸半咸水種類，適宜鹽度范圍為10‰～25‰。本種屬于高溫種類，適宜溫度范圍為5℃～30℃，最適溫度為25℃～30℃。牟氏角毛藻適應(yīng)于較高的光照強度，在10000～12000lx范圍內(nèi)是適宜的。最適pH值為8.0～8.9。
(4)纖細角毛藻 Chaetoceros gracilis6 @* r- w+ ~8 H; G7 X8 C
【分類】硅藻門，中心綱，盒形藻綱，角毛藻科，角毛藻屬- f! M1 k" A 【形態(tài)構(gòu)造】遷細角毛藻細胞小型，多呈單細胞，有時呈２～３個細胞組成鏈狀，大?。怠贰粒次⒚祝ń谴涕L30 ～37微米）。
【繁殖方式】一般是無形而分裂繁殖，在不良環(huán)境下可形成休眠包子，此外也能進行有性繁殖。2 g0 R% |1 M1 S
【生態(tài)條件】最適溫度為28℃～30℃，最適鹽度為15‰～35‰，適宜照度為10000～12000lx。: I0 C$ x, H( ]) l9 E. D
l7 二、 綠藻門
1、扁藻 Platymonas spp. =Tetraselmis spp.5 H' B- k/ h; O: P' 【分類】綠藻門、綠藻綱、團藻目、衣藻科、扁藻屬
【形態(tài)構(gòu)造】常用的有青島大扁藻和亞心形扁藻。藻體一般扁壓，細胞前面觀呈廣卵形，前端較寬闊，中間有一淺的凹陷，鞭毛4條，由凹處伸出。細胞內(nèi)有一大型、杯狀、綠色的色素體。藻體后端有一蛋白核。蛋白核附近有一紅色眼點。青島大扁藻有出現(xiàn)多眼點的情況。
4 J; O( C# Y- t青島大扁藻體長在16～30微米之間，一般是20～24微米，寬12～15微米，厚7～10微米。亞心形扁藻體長在11～16微米之間，一般是11～14微米，寬7～9微米，厚3.5～5微米。
【繁殖方式】無性繁殖，主要是以產(chǎn)生動孢子的方式進行，細胞縱分裂成兩個（少數(shù)情況下四個）子細胞。當環(huán)境不良時（如在老培養(yǎng)液中），能形成休眠孢子，橢圓形，一個或兩個。沒發(fā)現(xiàn)有性生殖。5 T5 【生態(tài)條件】扁藻對鹽度的適應(yīng)范圍很廣，在鹽度為8‰～80‰的淡水中均能生長繁殖。最適鹽度范圍為30‰～40‰。扁藻對溫度的適應(yīng)范圍也很廣，在7℃～30℃范圍內(nèi)均能生長繁殖，最適溫度范圍約在20℃～28℃。對低溫的適應(yīng)性強，在我國南方冬天能正常生長繁殖。對高溫的適應(yīng)性則較差，溫度上升到31℃以上，生長繁殖就會受到較大的抑制，藻色變黃，在南方夏天培養(yǎng)比較困難。扁藻在光強1000～20000lx范圍內(nèi)均能生長繁殖，最適光強范圍約為5000～10000lx。在最適光強下，扁藻表現(xiàn)為趨光性。一般扁藻在pH值為6～9范圍內(nèi)均能生長繁殖，最適pH值為7.5～8.5。
2、小球藻 Chlorella spp.
【分類】綠藻門，綠藻綱，綠球藻目，卵孢藻科0 Z2 F6 c6 O) O \7 【形態(tài)構(gòu)造】小球藻的細胞球形或廣橢圓形，大小因種類而有所不同，蛋白核小球藻細胞直徑為3～5微米。在人工培養(yǎng)情況下，由于環(huán)境條件的差異往往使小球藻細胞縮小或變大。小球藻細胞體內(nèi)有一個杯狀或板狀色素體，色素體內(nèi)一般有一個淀粉核，有的種類淀粉核明顯，有的種類則不明顯。; `8 s( F, u/ h; e
【繁殖方式】小球藻唯一的繁殖方式，是依靠細胞內(nèi)原生質(zhì)體分裂而形成似親孢子，當細胞分裂時，原生質(zhì)體分裂為2，4，8，……個似親孢子，等到母細胞破裂，似親孢子就釋放出來。
【生態(tài)條件】海產(chǎn)的小球藻對鹽度的適應(yīng)范圍較廣，它們在港灣、河口的半咸水中也能生活。生存溫度為10℃～36℃，最適溫度為25℃左后。在適溫條件下生長的最適光照強度為10000lx。小球藻繁殖的適宜pH值在6～8左右。小球藻在含有機質(zhì)（特別是氮肥）多的水中生長很繁茂。
3、微綠球藻 Nannocholris oculata( x4 z. y& A8 l. V. U9 o
【分類】綠藻門，綠藻綱，四胞藻目，膠球藻科
【形態(tài)構(gòu)造】細胞球形，直徑2～4微米。色素體一個，側(cè)生。細胞壁極薄，幼年細胞看不到，在分裂之前才變明顯，此時具有模糊的粒質(zhì)被膜的樣子，分裂進行時，這種被膜擴大，在被膜與細胞間形成空隙。【繁殖方式】二分裂繁殖，分裂方向是和長軸呈直角的。細胞分裂后，自細胞有母細胞的被膜裂開處脫出，但是一個或兩個可以保留附著在被膜上，相互連接成為一個松散的亞樹枝群。
【生態(tài)條件】微綠球藻對鹽度的適應(yīng)范圍很廣，在鹽度4‰～36‰的范圍內(nèi)均能正常生長。在10℃～36℃的溫度范圍內(nèi)都能較迅速的繁殖，最適溫度為25℃～30℃。在適溫條件下，最適光照強度為10000lx左右，微綠球藻適宜的pH值為7.5～8.5。微綠球藻在含有機質(zhì)多，特別是氮肥多、氨鹽豐富的水中，生長特別好。( ?7 d) P! o) U1 C. w$ B 三、綠藻培養(yǎng)液
（1）
硝酸銨 （NH4NO3) 50-100毫克
磷酸二氫鉀 （KH2PO4） 5毫克
檸檬酸鐵（FeC6H5O7)或檸檬酸鐵銨[Fe(NH4)3(C6H5O7)] 0.1-0.5毫克
淡水 1000毫升
培養(yǎng)扁藻、小球藻或杜氏藻時，添加10-20毫升海泥抽取液效果更好。
（2）、綠藻培養(yǎng)液
人尿 3-5 毫升
海泥抽取液 20-30毫升
淡水 1000毫升
適用于扁藻和其它綠藻的生產(chǎn)性培養(yǎng)，效果良好。
（3）、生產(chǎn)上用綠藻培養(yǎng)液
硝酸鈉 （NaNO3) 60克
尿素 18克
磷酸二氫鉀 （KH2PO4） 4克
檸檬酸鐵 （FeC6H5O7) 0.045克
適用于扁藻的生產(chǎn)性培養(yǎng)。
（4）.單細胞綠藻(柵列藻)培養(yǎng)液
水生4號
(NH4)2SO4 0.200g
Ca(H2PO4)2·H2O+2(CaSO4·H2O) 0.030g
MgSO4·7H2O 0.080g
NaHCO3 0.100g
KCL 0.025g
FeCL3(1%) 0.150mL
土壤浸出液 0.500mL
水 1000mL
四、浮游硅藻培養(yǎng)液
1、水生硅1(mg/l)
硝酸氨 120 硫酸鎂 70
磷酸氫二鉀 40 磷酸二氫鉀 80
氯化鈣 20 氯化鈉 10
硅酸鈉 100 檸檬酸鐵 5
土壤浸出液 20 硫酸錳 2
水 1000mL pH 7.0
2、水生硅2(mg/l)
尿素 150 氯化鉀 30
過磷酸鈣 50 硅酸鈣 100
硫酸鎂 50 碳酸氫鈉 3
硫酸錳 3 土壤浸出液 4mL
EDTA-鐵 1mL 水 1000mL
水生硅2號是用化肥尿素過磷酸鈣為氮磷來源,適于大量培養(yǎng)硅藻時選用,生長適溫為20～30℃;光強為2,000～5,000米燭光.
3、朱氏10號培養(yǎng)液:適用于培養(yǎng)硅藻,藍綠藻等.
H2O 1000mL
Ca(NO3)2 0.04 g
K2HPO4 0.01 g
MgSO4·7H2O 0.025 g
Na2CO3 0.02 g
Na2SiO3 0.025 g
FeCL3 0.008 g
使用時按1/2,1/4,1/10稀釋使用.
4、f/2培養(yǎng)液
硝酸鈉(NaNo3) 75 mg
磷酸二氫鈉(NaH2PO4) 4.4 mg
f/2微量元素溶液 1mL
f/2維生素溶液 1mL
淡水 1000mL
本配方時應(yīng)與目前生產(chǎn)上使用的各種偽造的培養(yǎng),但用于硅藻培養(yǎng)時,應(yīng)再加50mgNa2SiO3.
附I:f/2微量元素溶液配方:
硫酸鋅(ZnSO4·4H2O) 23mg
硫酸銅(CuSO4·5H2O) 10mg
氯化錳(MnCl2·4H2O) 178mg
檸檬酸鐵(FeC6H5O7·5H2O) 3.9g
鉬酸鈉(NaMoO4·5H2O) 7.3mg
乙二銨四乙酸鈉(Na2EDTA) 4.35g
六水氯化鈷(CoCl2·6H2O) 12mg
純水 1000mL
附II:f/2微量元素溶液配方:
維生素B12 0.5mg
維生素H(生物素) 0.5mg
維生素B1 100mg
純水 1000mL
以上用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內(nèi)加入1.5％瓊脂。
從以上各種配方，可看到配制藻類培養(yǎng)液的幾條原則：
（1）要有適量氮源（除固氮藍藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機氮等。
（2）應(yīng)包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等。
（3）要考慮各種鹽類總濃度和pH是否適合藻類需要，可用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH。
（4）要加入各種藻類需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）。
（5）要滿足某些藻類特殊需要，如藍藻需鉬，硅藻需硅。
（6）要添加適量生長物質(zhì)如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。
第六節(jié)、培養(yǎng)液的配制
培養(yǎng)液是根據(jù)培養(yǎng)液配方配制的，選定配方后，即可配制培養(yǎng)液。保種用的營養(yǎng)鹽最好用試劑級，為了減少每次稱重的麻煩，可將各種元素分別配成母液，用時吸取一定量即可。具體的濃度根據(jù)配方而定，通常在配制培養(yǎng)液時以每升水加入母液1毫升為宜。例如：配方中硝酸鈉的用量為0.1克/升，母液每毫升就應(yīng)含硝酸鈉0.1克，配制1000毫升硝酸鈉母液就需要加入100克硝酸鈉。維生素和微量元素一般也單獨配成母液，用時吸取。 生產(chǎn)池的營養(yǎng)鹽可用農(nóng)用化肥料，按配方稱取，加消毒水溶化后倒入池中即可。
第七節(jié)、培養(yǎng)方式
現(xiàn)介紹一些主要的微藻培養(yǎng)方式。以培養(yǎng)的目的要求不同.但可分為密閉式培養(yǎng)和開放式培養(yǎng)兩大類.
1、密閉式培養(yǎng):密閉式培養(yǎng)的目的是不使外界雜藻,菌類及其它有機體混入培養(yǎng)物中.將培養(yǎng)液密封在與外界完全隔離的透明容器中,由此通氣,攪拌,輸送培養(yǎng)液及調(diào)節(jié)水溫和取樣等設(shè)備,也都要與外界隔離.培養(yǎng)容管狀,也有池狀,用有機玻璃或透明的聚乙烯所料做成水平管道,直立或斜立在地上,暴露陽光或人工光照下.這種培養(yǎng)方式,成本高,好控制,產(chǎn)量亦穩(wěn)定.
2、開放式培養(yǎng):將微藻培養(yǎng)于敞開的容器(如水泥池,管道,木盆等)中.方法設(shè)備較簡便,可進行小量或大面積的培養(yǎng).該法培養(yǎng)物中易發(fā)生敵害生物污染,但成本低,使用較普遍,也是今后微藻培養(yǎng)所應(yīng)采取的方式。
第七節(jié) 純培養(yǎng)與單種培養(yǎng)
純培養(yǎng)：是指排除了細菌在內(nèi)的一切生物的條件下進行的培養(yǎng)。純培養(yǎng)要求有無菌室、超凈工作臺等設(shè)備條件，容器、工具、培養(yǎng)液等必須嚴格滅菌。純培養(yǎng)是科研工作中不可缺少的技術(shù)。
單種培養(yǎng)：生產(chǎn)性的培養(yǎng)中，是不排除細菌存在的，為了區(qū)別于純培養(yǎng)而稱之為單種培養(yǎng)。
1、藻種培養(yǎng)、中繼培養(yǎng)和生產(chǎn)性培養(yǎng)
(1)藻種培養(yǎng)：在室內(nèi)進行，一般采用一次性培養(yǎng)法。培養(yǎng)容器為100-3000毫升的三角燒瓶，瓶口用消毒的紙或紗布包扎。目的是培養(yǎng)和供應(yīng)藻種。
(2)中繼培養(yǎng)：目的在于培養(yǎng)較大量的高密度純種藻液，供應(yīng)生產(chǎn)性培養(yǎng)接種使用。
生產(chǎn)性培養(yǎng)：可在室內(nèi)也可在室外，有封閉式培養(yǎng)和開放式培養(yǎng)兩種類型。目的是供給育苗中的餌料。培養(yǎng)容器為大型水泥池、大型玻璃鋼水槽的塑料大袋；也有用土池培養(yǎng)的情況。
2、封閉式培養(yǎng)與開放式培養(yǎng)
(1)、封閉式培養(yǎng)：是把培養(yǎng)液密封在透明的容器中，與外界隔離。培養(yǎng)容器多為管狀，用有機玻璃或透明的聚乙烯塑料做成管道，水平、直立或斜立于地上，暴露在陽光中（或用日光燈光源），二氧化碳完全采用人工供給的辦法，并利用水泵使培養(yǎng)液不斷循環(huán)。完全封閉式培養(yǎng)所用的設(shè)備主要包括培養(yǎng)槽、氣體交換塔和控制系統(tǒng)三部分，其優(yōu)點是容易控制，產(chǎn)量穩(wěn)定，但設(shè)備成本較高。目前國內(nèi)采用的玻璃柱和塑料袋培養(yǎng)，效果很好。具有方法簡單、成本低、培養(yǎng)的藻細胞密度大、不易被污染、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點。
（2）開放式培養(yǎng)：是把微藻培養(yǎng)在敞開的容器中。二氧化碳采用人工供給或依靠與空氣的自然交換，如常見的廣口玻璃缸、水族箱、玻璃鋼水槽、水泥池培養(yǎng)等。開放式培養(yǎng)設(shè)備簡單，成本低，是目前培養(yǎng)微藻的主要形式。開放式培養(yǎng)由于光照充足，通風(fēng)較好，藻細胞生長繁殖迅速，但因藻液與外界接觸面大，容易受敵害生物污染。
3、培養(yǎng)方法
微藻培養(yǎng)的一般方法為：容器、工具的洗滌和消毒，培養(yǎng)液的制備，接種，培養(yǎng)管理。
4、容器、工具的洗滌和消毒
培養(yǎng)用容器、工具的洗滌和消毒是微藻培養(yǎng)中最基本的一項，稍有疏忽就會引起藻種間的混雜和敵害生物的污染，造成整個培養(yǎng)工作失敗，因此必須引起足夠的重視。所有培養(yǎng)用容器、工具都必須在用前用去污粉、洗液或肥皂粉等刷洗并沖洗干凈，如果玻璃瓶壁上有白色菌膜或碳酸鈣等物粘附，不易刷洗，可用1%濃度左右的稀鹽酸浸泡去除，然后用水沖洗。容器、工具洗刷干凈后，用以下幾種方法進行消毒。
5、加熱消毒法
加熱消毒法是利用高溫殺死微生物的方法。不耐高溫的容器、工具，如塑料和橡膠制品等不能用此法消毒。
（1）直接灼燒消毒：接種環(huán)、鑷子等金屬小工具，試管口，瓶口等可以直接在酒精燈火焰上短暫灼燒消毒。載玻片、小刀等則最好先蘸酒精，然后在酒精燈火焰上點燃，等器具上的酒精燒光，也就完成了消毒操作。直接灼燒消毒可以直接把微生物燒死，滅菌徹底。優(yōu)點是簡單、方便、快速、效果好。但只適用于小型金屬或玻璃工具。
（2）煮沸消毒：把容器、工具放入鍋中，加水煮沸消毒。一般在水中煮沸10-20分鐘。對大型錐形瓶消毒時，可在錐形瓶口放一只培養(yǎng)皿，然后在錐形瓶中加少量淡水，加熱煮沸完畢即用消毒紙或紗布蒙上備用。煮沸消毒法的作用是殺死全部營養(yǎng)體的部分芽孢。如果在水中加1%碳酸鈉效果更好，此法只適用于小型的容器、工具。
6、化學(xué)藥品消毒法
在大規(guī)模培養(yǎng)微藻的生產(chǎn)中，大型容器、工具及培養(yǎng)池一般用化學(xué)藥品消毒，常用的消毒藥品有漂白粉（或漂白液）、酒精、高錳酸鉀等。
（1）漂白粉[Ca(ClO)2]或漂白液：漂白粉又稱氯石灰，為白色粉末狀物質(zhì)，是氯與氫氧化鈣作用的產(chǎn)物。在空氣中因受二氧化碳作用，逐漸放出次氯酸而有強烈的刺激性氣味。工業(yè)上用的漂白燴一般含有效氯為30%-35%，消毒時按萬分之一到三的含量配成水溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小時，再用消毒水（經(jīng)過煮沸或沉淀過濾的水）沖洗三四次即可。白瓷磚池、水泥池的消毒可配成高濃度漿糊狀的漂白粉溶液淋灑池壁，半小時后用消毒水沖洗干凈；為充分消毒培養(yǎng)池，也可用較低量的漂白粉進行全池浸泡后用消毒水沖洗干凈。因漂白粉有氯臭味，還需要停放12小時才能接種使用（一般下午消毒池子，明天早上接種），以免抑制微藻生長。使用漂白粉消毒需長時間浸泡，同時氯臭味較難除去。漂白粉暴露于空氣中易分解，遇水或乙醇也分解，應(yīng)密封儲存。也可用漂白精進行消毒，漂白精主要成分是次氯酸鈣，一般含有效氯70%左右，用漂白精消毒，用量應(yīng)減半。漂白液含有一定量的NaClO，是化工廠的副產(chǎn)物，有效氯的含量一般在5%左右。由于漂白液具有價格低廉、無大型雜質(zhì)、不產(chǎn)生沉淀物及便于儲藏和用法簡單等優(yōu)點，被育苗場廣泛地用于容器、工具和培養(yǎng)池的消毒。使用時可參照漂白粉的用量進行具體的調(diào)整。
7、接種
培養(yǎng)液配好后，即進行接種培養(yǎng)。接種時應(yīng)注意以下幾點。
7.1、藻種質(zhì)量
藻種質(zhì)量，對培養(yǎng)效果影響很大，一般要求選取生活力強，生長旺盛的藻種。藻種好壞的標準可從以下幾個方面考慮：
（1）外觀：第一看顏色是否正常，正常情況下，綠微藻呈鮮綠色，硅微藻呈黃褐色，金微藻呈金褐色；第二看水中分布情況，有運動能力的種類上浮活潑運動；無運動能力的種類均勻懸浮于水中；第三看附壁和沉淀情況，好的藻種無明顯附壁，無大量沉淀。
（2）鏡檢：好的藻種細胞顏色鮮艷，運動種類運動活潑，無雜藻和敵害生物存在。
7.2、接種比例
選好藻種后，進行細胞計數(shù)確定投入量。用量可用以下公式計算：
N2V2=N1V1 其中：N1為藻種細胞密度；V1為藻種用量；N2為接種后培養(yǎng)液的藻種密度；V2為接種后培養(yǎng)液的體積。微藻接種一般采用（1：2）-（1：5）的比例，大量生產(chǎn)特別是室外培養(yǎng)應(yīng)適當提高比例，常采用（1：1）-（1：3）比例接種。另一方面又縮短了培養(yǎng)周期，這是培養(yǎng)成功的重要經(jīng)驗之一。特別是在環(huán)境因子不很適合，微藻生長不良，敵害生物有大量出現(xiàn)的可能時，高比例的接種量尤其重要。由于接種比例高，需要的藻種量大，藻種不足時，可以采用分次加培養(yǎng)液的方法。例如：一個20立方米水容量的培養(yǎng)池，如果一次按1：1的高比例接種，需要藻種10立方米，而采取兩次加培養(yǎng)液的方法，只要藻種5立方米就可以了。第一次先配培養(yǎng)液5立方米，接種5立方米藻種，總水量為10立方米，為培養(yǎng)池容量的一半。培養(yǎng)兩三天后，再加培養(yǎng)液10立方米，再培養(yǎng)三四天達收獲密度。這樣始終保持了1：1的高比例接種量。另一方面，分次加培養(yǎng)液，對微藻的細胞生長繁殖效果很好。
7.3、接種時間
接種時間最好選擇上午11-下午3點時進行，而不宜在晚上接種。因為晚上不少微藻細胞沉在底部，而白天微藻細胞進行光合作用，有趨光上浮的習(xí)性，特別是具有運動能力的種類更明顯。早上8-10點一般是微藻細胞吸出做藻種，棄去底部沉淀的微藻細胞（這些微藻細胞的生活力往往較弱），起到選種的作用。
第八節(jié)培養(yǎng)工藝程序
一般生產(chǎn)上采用一次性培養(yǎng)和循環(huán)生產(chǎn)法。一次性培養(yǎng)，就是一次性施肥、接種培養(yǎng)，最后達到收獲。在生產(chǎn)池中加入消毒淡水和營養(yǎng)鹽，接入適量的藻種后，在適宜的條件下，4-5天即可達到最高細胞密度。此時池內(nèi)的藻液可作為餌料輸入育苗池。然后將池子清洗后再進行新的培養(yǎng)。如果以5天為一個培養(yǎng)周期，則可將生產(chǎn)池分為五組，每天接種一組，連續(xù)五天將所有生產(chǎn)池接滿，然后循環(huán)地按次序進行收獲。
培養(yǎng)程序是：3000毫升三角燒瓶——20升細口玻璃瓶——保種池——生產(chǎn)池——育苗池。接種用量是：一只3000毫升三角燒瓶接種1只20升細口玻璃瓶，三只細口玻璃瓶接種一個1噸級的保種池，一個1噸級的保種池可接種兩個5噸級的生產(chǎn)池。
一、培養(yǎng)管理
微藻培養(yǎng)過程中，管理工作包括日常的管理操作、生長情況的觀察和檢查、出現(xiàn)問題的分析處理等幾個方面。
1、日常管理操作
（1）攪動和充氣：其作用表現(xiàn)在三個方面。第一，增加水和空氣的接觸面，使空氣中更多的二氧化碳溶解到水中，補充由于微藻細胞的光合作用對二氧化碳的消耗；第二，防止水表面產(chǎn)生菌膜；第三，使微藻細胞均勻受光，使微藻細胞均勻分布，幫助沉淀的微藻細胞上浮而獲得光照。在培養(yǎng)中可根據(jù)具體情況分別采用搖動、攪動和充氣的方法。搖動的攪動每天至少進行三次，定時進行，每次半分鐘左右。充氣一般通入空氣，充氣時要對空氣進行過濾，使氣體先通過空氣過濾器，然后再通入微藻培養(yǎng)液中。
（2）調(diào)節(jié)光照：光照適合與否，對微藻的生長關(guān)系很大。常用的是太陽光和燈光，要根據(jù)不同微藻對光照的具體要求來進行調(diào)節(jié)。但一般地講，所有的微藻都不能忍受強烈的直射陽光。一般餌料培養(yǎng)室的頂部都用玻璃鋼瓦采光，中午自然光比較強時，可用白布進行遮光；自然光較弱時，需增加人工光源。常用的人工光源有日光燈、碘鎢燈、生物效應(yīng)燈等。
（3）控溫；每一種微藻都有其適應(yīng)溫度范圍和最適溫度范圍。如果能在控制溫度的條件下培養(yǎng)，當然是最理想的。在目前還不具備控溫條件的情況下，在培養(yǎng)過程中也應(yīng)該盡可能使溫度適合于培養(yǎng)微藻的要求。一般高溫對培養(yǎng)微藻生長不利，在夏季室內(nèi)培養(yǎng)時，須把門窗打開通風(fēng)降溫，必要時需增加換氣扇或風(fēng)扇等設(shè)備。如果氣溫急降，須關(guān)閉門窗，防止溫差過大。在北方春季、冬季，氣溫較低，一般室外培養(yǎng)不能進行，在室內(nèi)需要采取措施提高室溫，才能進行正常培養(yǎng)，可采取水暖、氣暖等措施。
第九節(jié)、微藻培養(yǎng)設(shè)施及設(shè)備
目前我國在微藻培養(yǎng)中普遍采用的是開放式通氣培養(yǎng)方法。生產(chǎn)上，培養(yǎng)設(shè)備包括工作室、培養(yǎng)室、沉淀池、水處理系統(tǒng)、培養(yǎng)容器、淡水消毒池、餌料培養(yǎng)池等?，F(xiàn)分別介紹如下：
1、工作室
在車間的一端，是餌料培養(yǎng)工作人員經(jīng)常工作的地方，需配有顯微鏡、解剖鏡及其它常用的儀器、工具、藥品等。緊靠工作室還需有保種間和清洗消毒間。保種間面積視培養(yǎng)規(guī)模而定，一般為10-20平方米，配有空調(diào)、冰箱、具有人工光源的培養(yǎng)架等，工作人員在保種間可以進行藻種的分離、培養(yǎng)、保藏等工作。清洗消毒間，面積10-15平方米，室內(nèi)設(shè)有清洗水池、消毒池、高壓蒸氣滅菌鍋、爐灶等，可以供少量淡水及容器、工具消毒用。
2、培養(yǎng)室
培養(yǎng)室的作用是進行藻種和中繼培養(yǎng)和投喂性大規(guī)模培養(yǎng)。
培養(yǎng)室采用投光率80%左右的玻璃鋼瓦覆頂，為進一步增加室內(nèi)的光照強度，四周墻壁均開設(shè)大面積的玻璃窗。為調(diào)整光照強度，房頂部設(shè)有白布用作天幕，池水面上方1米處安裝日光燈、碘鎢燈或生物效應(yīng)燈等人工光源；為防止高溫季節(jié)培養(yǎng)餌料的高溫問題，培養(yǎng)室對向各開設(shè)一個大型的換氣扇或在培養(yǎng)池上方增設(shè)吊扇，進行通風(fēng)降溫；為防止雨期房頂漏雨和嚴寒季節(jié)室內(nèi)蒸汽在房頂冷凝，可在房頂增設(shè)塑料薄膜。室內(nèi)的主要設(shè)施有進行藻種中級培養(yǎng)的玻璃鋼桶、小型的貼白瓷瓦的水泥池和大規(guī)模培養(yǎng)的大型水泥池。
3、沉淀池
沉淀池一般建在地面以上，并經(jīng)常建在較高地勢處，兼作高位水池。若沉淀池建在地勢較低處，則需要有二級提水設(shè)備。沉淀池容量為育苗池總?cè)萘康?-4倍左右，沉淀時間在48小時以上為好。沉淀池一般呈長方形或圓形，磚、石砌成，深度不宜過大，內(nèi)層抹五層防水層。為達黑暗沉淀 ，池頂加蓋。池底應(yīng)有1%-3%的坡度，便于清刷排污。池下部設(shè)置排污口和供水口，頂部設(shè)有進水口和溢水口。為確保沉淀水的連續(xù)使用，沉淀池一般可分為2格以上。
4、培養(yǎng)容器
在生產(chǎn)中常用的培養(yǎng)容器有下列幾種：三角燒瓶：保種用100毫升的三角燒瓶。開始擴種時，培養(yǎng)容器逐步擴大，100毫升→250毫升→500毫升→3000毫升→5000毫升。三角燒瓶主要用于藻種的分離、保藏和藻種培養(yǎng)等小型培養(yǎng)方面。三角燒瓶可以煮沸消毒，也可以在烘箱中消毒。三角燒瓶的優(yōu)點是瓶口小，不易落入孢子等，不易被污染。玻璃細口瓶：容量為10000或20000毫升，中繼培養(yǎng)時用。玻璃鋼桶：用環(huán)氧樹脂加玻璃纖維布做成。中繼培養(yǎng)時用。廣口玻璃缸：一般商店用來裝糖果、食品的玻璃缸，俗稱糖果缸，因價格低，購買方便，南方多用來作為中繼培養(yǎng)的容器。容量以8000-10000毫升為宜。玻璃質(zhì)量以無色透明、無氣泡為好。塑料薄膜袋：一般用透明薄膜制成，大小不等，中繼培養(yǎng)及大量培養(yǎng)時使用。
5、水處理系統(tǒng)
一個育苗場通常只有一套供水系統(tǒng)，同時提供餌料培養(yǎng)和育苗用水。微藻培養(yǎng)對水的要求比較嚴格，須經(jīng)過過濾或化學(xué)藥品處理，除去或殺死水中的敵害生物。因此必須配備水過濾裝置和淡水消毒池。
(1)、水過濾裝置
淡水從溪流中經(jīng)動力管泵打到沉淀池，沉淀48小時后，經(jīng)砂濾裝置作第一次過濾，把大型的生物和非生物雜質(zhì)除去，再經(jīng)陶瓷過濾器過濾，將微小生物除去。常用的水過濾裝置有：砂濾缸、砂濾罐、砂濾陶瓷過濾器等。
6、餌料培養(yǎng)池
其用于大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)池建在室內(nèi)或室外，為易于控制培養(yǎng)的環(huán)境條件多以室內(nèi)建造為主。
6.1、培養(yǎng)池的結(jié)構(gòu)
培養(yǎng)池采用水泥混凝土建造，表面涂以防水膠；池形取長方形；池深70厘米（水深50厘米左右），中池（2-4立方米左右）和大池（5-10立方米左右）。由于大池受光面積大、氣體交換量大、單胞藻生長良好及節(jié)省占地面積等優(yōu)點，很多廠家直接建造大池。為保證餌料的安全供應(yīng)，餌料培養(yǎng)水體應(yīng)為育苗水體的1/3以上；二者的比例如達1：1則最為理想。
7、充氣系統(tǒng)
7.1、充氣機
大量培養(yǎng)微藻時各地可根據(jù)具體情況選用羅茨鼓風(fēng)機、空氣壓縮機或小型充氣泵等設(shè)備產(chǎn)生氣源，風(fēng)機的匹配功率由水體的大小確定。為確?？諝獾那鍧嵖梢赃M氣孔外增設(shè)空氣過濾器。
7.2、充氣管和散氣石
供氣管采用灰塑料硬管，池內(nèi)充氣管多采用塑料軟管。散氣石采用低標號的炭化硅膠氣石（如80號）或末端不加散氣石，以防止藻液表層形成過厚的有機物膜。
8、藻種的分離
微藻的培養(yǎng)，首先需要有藻種，藻種可以向有關(guān)的保處單位購買，也可以從天然水域中分離。從天然水域混雜的生物群中，運用一定的方法，把所需要的個體，分離出來，而獲得單種培養(yǎng)。目前我國能成功地進行大量生產(chǎn)的藻種不多，遠未能滿足各種經(jīng)濟大鯢人工育苗的需要，這就需要進行新的藻種的分離和培養(yǎng)。另一方面，若藻種受敵害生物及其它雜藻的污染也要通過分離進行純化。
8.1采樣及預(yù)備培養(yǎng)
(1)、采樣
分離藻種，首先要采集生長有需要分離的微藻的水樣。個體較大的浮游微藻（30微米以上），可用350目的浮游生物網(wǎng)在水中撈取。通過浮游生物網(wǎng)的過濾，可獲得較濃的微藻樣品。但在海產(chǎn)大鯢的人工育苗中所需要的餌料，一般個體很小（幾微料到十幾微米），用不著浮游生物網(wǎng)無法采到，所以要把水樣采回室內(nèi)處理。水樣可取自天然海區(qū)，特別是海邊的小水洼，在這些小水洼中，往往生長有適于靜水體培養(yǎng)的微藻，且種類比較單純，一種或幾種微藻的數(shù)量占優(yōu)勢，容易分離。底棲種類一般從礁石上刮取，還可刮取潮間帶的“油泥”，加淡水攪拌后，棄去沉淀 的泥沙，用密篩絹過濾掉大型微藻和雜質(zhì)，即可獲得微藻細胞濃度較高的水樣，也可以把附著在大型微藻（如馬尾藻等）藻體上或其它附著物上的附著微藻洗刷下來作為分離的水樣。
(2)、預(yù)備培養(yǎng)
水樣采回后，進行顯微鏡檢查，如果發(fā)現(xiàn)有需要分離的微藻，而這種微藻在水樣中數(shù)量較多時，可立即進行分離。若數(shù)量很少，分離困難時，最好先進行預(yù)備培養(yǎng)，待其數(shù)量增多時，再分離。 預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液營養(yǎng)鹽的濃度應(yīng)小些，一般只有原配方的1/4-1/2。預(yù)備培養(yǎng)的培養(yǎng)液最好能使所需微藻良好生長，而不需要微藻的生長受到限制?？捎羞x擇地加入藥品。例如：在培養(yǎng)液在加入抗菌素可抑制硅藻生長，用量為1-10毫克/升?？咕乜蛇x用青霉素或硫酸鏈霉素。
8.2、藻種分離方法，常用的有以下幾種：
(1)、微吸管分離法
原理： 在無菌操作條件下,用極細的微吸管,在顯微鏡下把目標藻樣從一個玻片移到另一個玻片,采用同樣的方法反復(fù)操作,直到鏡檢水滴中只有目標單種為止。
方法 a、在微吸管的頂端套一條長約8cm的醫(yī)用乳膠管,分離操作時, 用手指壓緊乳膠管以控制吸取動作。將分離的水樣置于載玻片上,在顯微鏡下把微吸管口對準要分離的藻細胞, 放松手指, 藻細胞被吸入微吸管;接著把吸出的水滴放在另一載玻片上, 顯微鏡檢查水滴中是否只吸到藻細胞,經(jīng)過如此再反復(fù)操作, 直至達到單種分離的目的。然后把分離出的藻細胞沖入預(yù)先裝有培養(yǎng)液的試管內(nèi), 放在適宜的光照下培養(yǎng),試管有藻色后鏡檢,培養(yǎng)為單種的試管,其他不合格的棄掉。
B、取直徑5毫米的細玻璃管，在酒精噴燈上加熱，待熔時，快速拉成口徑極細的微吸管。檢查拉好的微吸管是否通氣，將其放在盛水的燒杯中，看管是否有段水柱。若拉的不好，可在酒精燈上整理。微吸管拉好后，將稀釋適度的藻液水樣，置載玻片上，鏡檢，用微吸管挑選要分離的微藻細胞，仔細地吸出放入另一特制的經(jīng)消毒的小載玻片（0.5×0.5平方厘米）上，鏡檢這一滴水中是否是所需要分離的微藻細胞。如分離不成功，須反復(fù)同幾次，直到達到分離目的，然后將含有所需分離微藻細胞的小載玻片直接移入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過來滅菌的試管或小三角燒瓶中進行培養(yǎng)。 微吸管分離法，操作技術(shù)要求高，分離時要細心，往往吸取一個細胞，要反復(fù)幾次才能成功，此法適宜于分離個體較大的微藻，個體較小的微藻用此法分離較為困難。
(2)、水滴分離法
原理： 在無菌操作的條件下,把要分離的藻樣用微吸管在玻片上滴成大小合適的小水滴,鏡檢水滴中只有一個要分離的單種,即可沖入試管培養(yǎng)。
方法 a、用小燒杯裝稀釋的藻樣, 將微吸管插入藻樣中, 提取微吸管, 讓多余的藻液滴出,然后把管口與消毒過的載玻片接觸, 即有一個小水滴留在載玻片上。一個載玻片滴3～4 滴,間隔一定距離, 然后在顯微鏡下觀察。若一個水滴中只有一個需要分離的藻細胞(無其他生物混雜) , 即用移液管吸取培養(yǎng)液把該水滴沖入試管中, 試管口塞上棉塞, 放在適宜的條件下培養(yǎng)。該分離法的關(guān)鍵是藻樣稀釋要適宜(稀釋至每個水滴約有1～2 藻細胞) , 水滴大小適宜,以在低倍鏡下能看到水滴全部或大部分為宜, 并且觀察要準確、迅速。
B、用微吸管吸取稀釋適度的藻液，滴到消毒過的載玻片上，水滴盡可能性小些，要求在顯微鏡低倍鏡視野中能看到水滴的全部或大部分，一載玻片滴2-4滴，水滴作直線排列，互相間隔一定距離。在顯微鏡下仔細檢查每一滴水，如果一滴水中只有一個或幾個需要分離的同種微藻細胞，無其它生物混雜，即用吸管吸取培養(yǎng)液把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過滅菌的試管或小三角燒瓶中。如果分離不成功，反復(fù)重做，直到達到目的。 水滴分離法，方法簡便、易行。尤其適宜于已在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢的種類。各繁殖場分離受少量生物污染的微藻多用此法。水滴分離法在操作上要求細致、認真，使用的工具及培養(yǎng)液必須嚴格消毒。
(3)、稀釋分離法
把含有需要分離的微藻而又混雜有其它生物的水樣，取其一定量用培養(yǎng)液稀釋。通過稀釋到適宜程度的方法，達到把原混雜生物單個分離培養(yǎng)的目的。首先把水樣稀釋到每一滴水含有一個左右生物細胞（可能一個都沒有，也可能有兩個）在稀釋過程中配合顯微鏡檢查，調(diào)節(jié)稀釋度，然后把裝有1/4容量培養(yǎng)液的試管20支左右，每一試管加入稀釋適宜的水樣一滴，搖勻，進行培養(yǎng)，待微藻生長繁殖達到一定濃度時，再檢查是否達到分離的目的。如果未達到，再重復(fù)做，直到成功為止。 稀釋分離法，操作簡單、易行。但分離培養(yǎng)中有一定程度的盲目性，沒有水滴分離法效果好。
(4)、平板分離法
僅適合于能在固體培養(yǎng)基上生長的種類。
（a）平板培養(yǎng)基的制備：該培養(yǎng)基的制備包括調(diào)配、融化、分裝、滅菌四個步驟。
調(diào)配：按分離種類的需要選用合適的營養(yǎng)鹽配方配成培養(yǎng)液，加1%瓊膠（又稱凍粉），瓊膠剪成細片，加入培養(yǎng)液中浸泡12小時。
融化：把培養(yǎng)液加熱，不斷攪拌，使瓊膠完全融化。在加熱過程中，水分要蒸發(fā)不少，在加熱完畢應(yīng)以淡水補充蒸發(fā)掉的水分。
分裝：稍冷后即分裝于培養(yǎng)皿中，裝的厚度依培養(yǎng)皿大小而定，在0.3-0.5厘米之間。
滅菌：固體培養(yǎng)基的滅菌要求嚴格，一般采用高壓蒸氣滅菌法滅菌。
（b）平板分離方法：經(jīng)滅菌的固體培養(yǎng)基冷卻后，培養(yǎng)基凝固成固體狀態(tài)，即可進行分離。
劃線法：把一個金屬接種環(huán)在酒精燈火焰上滅菌后，蘸取需要分離的藻液輕輕地在平板上劃折線。
噴霧法：將需要分離的藻液稀釋，裝入經(jīng)消毒過的小型噴霧器中，打開培養(yǎng)皿蓋，把藻液噴射在培養(yǎng)皿表面形成分布均勻的一薄層水珠。用噴霧法或劃線法接種后，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，放在適宜的光照條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后，在培養(yǎng)基上可出現(xiàn)互相隔離的微藻群落，通過顯微鏡檢查，尋找需要的純藻群落，然后用消毒過的玻璃針從培養(yǎng)基上取出，移植到裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過滅菌的容器中培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后，再進行顯微鏡檢查，若無其它生物混雜，才達到單種培養(yǎng)目的。如果不成功，則應(yīng)重做。
平板分離法2
、作為微藻分離用的固體培養(yǎng)基,是在常規(guī)的液體培養(yǎng)基中加入一定量的瓊脂,并且使其溶解和高溫高壓滅菌后,通過適當?shù)姆椒?把要分離的藻樣接種在培養(yǎng)基上,通過一定的時間培養(yǎng),在培養(yǎng)基上長出單個的藻落而達到分離的目的。
接種的方法
接種在超凈工作臺上進行,接種的方法有兩種。
噴霧法： 首先用消毒海水把要分離的藻樣進行適當?shù)南♂?裝入消毒過的醫(yī)用喉頭噴霧器中,打開培養(yǎng)皿蓋,把藻樣噴射到培養(yǎng)基平面上,使藻樣在培養(yǎng)基表面上形成分散均勻的一層薄水珠。水樣稀釋到合適的程度是指水樣噴射在培養(yǎng)基平面上必須相隔1cm 以上有一個藻細胞,否則將來長出的藻落距離太近,不易分離。
劃線法： 把接種環(huán)在酒精燈上滅菌后,蘸取藻樣輕輕在培養(yǎng)基平面上做第一次劃線3～4條,把培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動約70°角,并把接種環(huán)在酒精燈上滅菌,通過第一次劃線區(qū)做第二次劃線。用同樣的方法做第三、第四次劃線。由于第一次劃線接種環(huán)上的藻細胞比較多,在第一劃區(qū)藻細胞可能密集不能分離開,但通過后面的劃線可能分離出單獨的藻類群落。
(5)、抗菌素分離法
該法是對抗菌素敏感的種類被殺死后，而對抗菌素不敏感的種類繼續(xù)生長繁殖。例如綠藻中污染了藍藻，可以加抗菌素，抑制藍藻的生長。在分離藻種時應(yīng)注意：所有的工具都要消毒；加熱消毒的工具必須冷卻后使用，不然會殺死藻細胞；分離后剛開始培養(yǎng)的一段時間，應(yīng)放在弱光下，不要搖動；培養(yǎng)基最好無沉淀，如有沉淀，可用微孔濾膜過濾。
9、藻種的培養(yǎng)
藻種的培養(yǎng)包括三方面的內(nèi)容：一是對新分離的藻種的培養(yǎng)，包括用微吸管得到的單個細胞的培養(yǎng)，這類培養(yǎng)是在小型容器（一般為100毫升的三角燒瓶）中進行的；二是保種培養(yǎng)，是為了使藻種得到長期保存，需要時隨時取用；三是藻種的擴大培養(yǎng)，目的是為了滿足生產(chǎn)上對大量藻種的需要。 藻種培養(yǎng)時，培養(yǎng)容器、工具經(jīng)煮沸消毒或使用化學(xué)藥品消毒后，用煮沸淡水沖洗干凈，培養(yǎng)液用加熱滅菌法消毒，接種后瓶口用消毒紙包扎，放在適宜的光照條件下培養(yǎng)。藻種培養(yǎng)除擴大培養(yǎng)外，一般不充氣，只做定時的搖動。藻種在培養(yǎng)過程中必須定期進行顯微鏡檢查，出現(xiàn)污染應(yīng)及時分離。
10、藻種的保藏
保種用的固體培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度較高（一般為液體培養(yǎng)基的兩倍），瓊膠用量為1%-1.5%。按平板分離法制備固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻后，用噴霧法或劃線法接種。接種時要在火焰附近操作，保持無菌狀態(tài)，或在超凈工作臺中進行。 常用固體培養(yǎng)基保種方法有兩種，一種是把藻種接種在固體培養(yǎng)基上，在弱光條件下培養(yǎng)，使微藻細胞在培養(yǎng)基上慢慢生長繁殖，讓培養(yǎng)基的營養(yǎng)逐漸消耗。此法可保存半年到一的年。另一種是低溫保藏。最好用試管斜面固體培養(yǎng)基，接種后，首先放在光照充足的地方，常溫培養(yǎng)到微藻細胞達到較高密度后，即置冰箱或冷庫中，一般在5攝氏度左右的低溫下保藏，每天讓藻種接受短時間的弱光照（幾個小時），此法保種時間可達半年到兩三年。例如，用此法，新月菱形藻可保存34個月，三角褐指藻可保存25個月。但如果在完全黑暗的 條件下，則保存時間大大縮短，新月菱形藻只能保存6個月。 固體培養(yǎng)基保種具有占地面積小、保存時間長等優(yōu)點。但也有其局限性，只能保藏一些適合于在固體培養(yǎng)基上生長的種類。見圖11—1。
圖11—1菌種保藏
第九節(jié)硅藻的簡介：
1871 年，Pfitzer 先生首先根據(jù)硅藻的色素細胞（chromatophore）的數(shù)目、形狀等特征將硅藻分成兩個目（Order）：Coccochromaticae和 Placochromaticae。之后，在 1896 年時，Schütt 首先將硅藻分類為硅藻科（Family Bacillariaceae），并細分成圓心目（Centricae）和羽狀目（Pennatae）兩個目，并陸續(xù)有其它研究者將硅藻做進一步的分類（Patrick and Reimer, 1966）。本研究主要是采用 Sze（2000）所歸納的分類方式，同時參考 Patrick and Reimer（1966）、Jin et al.（1985）、Round et al.（1990）、Witkowski et al.（2000)等人的所出版的圖鑒，來作為硅藻的分類。硅藻屬于金藻門（Chromophyta），硅藻綱（Bacillariophyceae）；硅藻綱可依據(jù)硅殼的對稱性，分為輻射對稱（radial symmetry）的圓心目（Centrales syn: Centricae）以及兩側(cè)對稱（isobilateral symmetry）的羽狀目（Pennales syn: Pennatae）。羽狀目還可再細分為：無縱溝亞目（Araphidineae）及有縱溝亞目（Raphidineae）。但根據(jù)分子定序的分析結(jié)果，會長成串狀或是鏈狀的圓心目和無縱溝亞目兩者是并系群（paraphyletic）的關(guān)系（Graham and Wilcox, 2000）。目前已知，全世界的硅藻有 285 屬，約 10000～12000 種(Raymont, 1980; Round et al., 1990)。幾乎所有的圓心目硅藻都是行真性浮游生活（euplanktonic），而羽狀目硅藻大多為底棲性（benthic）生活；此外，另有兼性浮游（meroplanktonic）性硅藻（Sze,2000）。其中尚可細分成附生性微藻（periphytic）、表生性（epizoic）（如螃蟹、鯨魚的體表）、大鯢體內(nèi)共生（endozoic），甚至有些硅藻是生活于極地的冰層中或是潮濕的土壤表面（Graham and Wilcox,2000），也就是所謂的陸生型硅藻（terrestrial diatoms）。硅藻的細胞壁稱為硅殼（frustule），由硅質(zhì)和有機質(zhì)外層形成，而硅藻的干重，其中有 4％～50％是硅質(zhì)成分（Raymont, 1980）。不同種的硅藻生長時，所需要的硅質(zhì)量會有差異（Graham and Wilcox, 2000）。硅藻的外殼有許多不同的形狀（如附圖三）。硅殼有上殼（epitheca）和下殼（hypotheca）之分。而硅殼上的裝飾刻紋（ornamentation mark）是作為硅藻傳統(tǒng)分類時的重要依據(jù)（Patrick andReimer, 1966; Round et al., 1990）。裝飾紋可分為四種：1. 點紋（puncta）：硅殼上的小孔和小點稱之，常是不規(guī)則的散布在硅殼上，或是會規(guī)律地排列成殼紋（striae）。2. 網(wǎng)孔（areolae or alveoli）：為殼面的小凹槽，會形成腔室般的構(gòu)造。3. 小管（canaliculi）：為貫穿硅殼上的管狀通路。4. 肋紋（costae）：為堅硬的肋狀構(gòu)造，可用來支撐硅殼，是由硅質(zhì)高度堆積所形成。有縱溝亞目的殼上有殼縫（raphe），通常上下殼都會有殼縫的構(gòu)造，但亦有只有一邊有殼縫的硅藻（例如：曲殼藻科（Achnanthaceae）和卵形藻科（Cocconeiaceae），只有下殼有殼縫的構(gòu)造）。殼縫兩端以及中心有特厚的空白區(qū)域分別稱為極節(jié)(polar nodule)與中間節(jié)(central nodule)（附圖四）。無縱溝亞目的硅藻，硅殼上則沒有殼縫的構(gòu)造，但有些無縱溝亞目的硅藻（例如：脆桿藻（Fragilaria sp.）、縫舟藻（Rhaphoneis sp.））會有偽殼縫（pseudoraphe）的構(gòu)造，是由兩側(cè)對稱且排列緊密的殼紋或肋紋所形成的。殼上還有稱為軸區(qū)（axial area）的部位，是沿著長軸方向，一道無紋路的窄區(qū)域，有時會形成偽殼縫。硅殼中央的區(qū)域稱為中央?yún)^(qū)（central area），是由羽狀目硅藻的殼縫所圍成的區(qū)域。硅殼側(cè)面平直的部分稱為腰帶（girdle），腰帶可分為連結(jié)區(qū)（connecting zone）和中間帶(intercalary band)。連結(jié)區(qū)是指上下殼相連接的部位，而中間帶是指腰帶扣除掉連結(jié)區(qū)的部分(Jin et al., 1985; Round et al., 1990)，中間帶的寬度，會隨著細胞的年齡及品種而有所不同。硅藻的營養(yǎng)細胞是不具有纖毛或是鞭毛的構(gòu)造，是屬于雙套染色體細胞（diploid cell）。底棲性硅藻是利用分泌膠質(zhì)的方式來進行移動，但無殼縫亞目的硅藻的移動能力較差。硅藻最常見的生殖方式，是無性的分裂生殖，硅藻會先復(fù)制細胞核，然后上下殼分離。上下殼分離的地方，會有硅質(zhì)沈淀細胞的形成，會形成新細胞的下殼部分。圓心目硅藻的精子具有管狀鞭毛的構(gòu)造，可幫助游泳（Graham and Wilcox, 2000; Sze, 2000）。當硅藻進行無性生殖時，由于不斷分裂并形成較小的下殼，會使得細胞尺寸越來越縮小。當硅藻的細胞大小指剩原本尺寸的二分之一（Sze, 2000）或三分之一（Graham and Wilcox, 2000）時，硅藻就會進行有性生殖。圓心目硅藻的有性生殖方式：2N 藻體進行減數(shù)分裂（亦即所謂的 gametic meiosis）來產(chǎn)生雄性配子（精子），并釋放到水中，與已形成雌性配子（卵）的硅藻細胞結(jié)合，形成結(jié)合子，或稱為增大孢子（auxospore）（附圖五）。羽狀目硅藻的有性生殖方式，則是兩個配子母細胞共同分泌膠質(zhì)，把兩個配子母細胞包含在一起（亦即所謂的結(jié)合生殖），然后在膠質(zhì)層中，配子以變形蟲的方式互相交換，會形成一個或兩個增大孢子（視硅藻品種而定）（附圖六）。 硅藻含有的色素主要有巖藻黃素、葉綠素 a 和葉綠素 c。硅藻的光合作用產(chǎn)物主要為褐藻多糖（chrysolaminarin）和脂質(zhì)。硅藻在缺氮的環(huán)境下，細胞中的油球會特別的明顯（Raymont, 1980）。Faraloni et al.（2003）分析兩種舟行藻的細胞外多糖（exopolysaccharide），發(fā)現(xiàn)其組成份包含有半乳糖醛酸（galacturonic acid）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid）、半乳糖（galactose）、阿拉伯糖（arabinose）、巖藻糖（fucose）、葡萄糖（glucose）、甘露糖（mannose）、鼠李糖（rhamnose）。
一、硅藻門（bacillariophyta）微藻植物一門。
硅藻普遍分布于淡水、淡水中和濕土上，為魚類和無脊椎動物的食料。硅藻死后，遺留的細胞壁沉積成硅藻土，可作耐火、絕熱、填充、磨光等材料，又可供過濾糖汁等用。約11000種。大多水生，幾乎在所有的水體里都生長，只有極少數(shù)生活在陸地潮濕處。硅藻是水生動物的食料。浮游硅藻是淡水生態(tài)系統(tǒng)統(tǒng)中的主要的初級生產(chǎn)力。分類學(xué)家們一般認為硅藻來源于鞭毛藻，為一個特殊的分支。有現(xiàn)在生存的和化石的種類。根據(jù)殼面花紋的排列，將本門分為中心綱和羽紋綱。
1、主要特征
硅藻門植物細胞壁富含硅質(zhì)，硅質(zhì)壁上具有排列規(guī)則的花紋。殼體由上下半殼套合而成。色素體主要有葉綠素a、c1、c2以及β胡蘿卜素，巖藻黃素、硅藻黃素等，同化產(chǎn)物為金藻昆布糖。藻體一般為單細胞，有時集成群體。細胞壁里有兩片硅質(zhì)殼,一大一小,像盒子一樣套在一起。兩片硅質(zhì)殼，大的套在外面，叫上殼,較老；小的在里面,叫下殼,較年輕。
2、形態(tài)結(jié)構(gòu)
2.1．細胞壁：無色、透明。外層為硅質(zhì)，內(nèi)層為果膠質(zhì)。細胞壁含果膠和二氧化硅，質(zhì)堅硬，常由套合的兩瓣組成，并有呈輻射對稱(輻射硅藻目)或左右對稱(羽紋硅藻目)排列的花紋。
(1) 殼面和帶面：細胞壁的構(gòu)造像一個盒子，套在外面的較大，為上殼；套在里面的較小，為下殼。硅藻上﹑下殼相互套合。上殼和下殼都不是整塊的，皆由殼面（valve）和相連帶（connecting band）兩部分組成。殼面平或略呈凹凸狀，殼面邊緣略有傾斜的部分，叫殼套（valve mantle）：與殼套相連，和殼面垂直的部分，叫相連帶，亦稱帶面。
(2) 間生帶：有些種類在殼套與相連帶之間具有間生帶，凡貫殼軸較長的種類都有間生帶，其數(shù)目1條2條或多條，花紋形狀主要有三類：魚鱗狀，如卡氏根管藻rhizosolenia castracanei；環(huán)狀，如桿線藻rhabdonema；領(lǐng)狀，如環(huán)形婁氏藻lauderia annulatus和中肋角毛藻chaetoceros costatus。
(3) 隔片：具間生帶的種類，有向細胞腔內(nèi)伸展成片狀的結(jié)構(gòu)，稱隔片(sepum)。如果隔片一端是游離的，稱為假隔片，如斑條藻（grammatophora）；如果隔片從細胞的一端通到另一端，則稱為全隔片或真隔片，如楔藻（climacosphenia）。間生帶和隔片都具增強細胞壁的作用。
(4) 突出物：硅藻細胞表面有向外伸展的多種多樣的突出物，有突起、刺、毛、膠質(zhì)線等。它們有增加浮力和相互連接的作用。
突起：是細胞壁向外的頭狀突出物，如彎角藻ercampia。
刺：一般細而不長，末端尖，其數(shù)目、長短不一，最粗大的刺如雙尾藻ditylum，中等的刺如盒形藻biddulphia，較小的刺如圓篩藻cascinodi scus的緣刺。
毛：為較細長的突出物，長度常為細胞直徑的數(shù)倍，有的種類在粗毛里還有色素體，這是毛與刺的最大區(qū)別。此外還有膜狀突起（如太陽漂流藻）和膠質(zhì)線、膠質(zhì)塊等膠質(zhì)突起（如海鏈藻）。
（5）花紋：硅藻細胞壁上都具排列規(guī)則的花紋，主要有點紋：為普通顯微鏡下可分辨的細小孔點，單獨或成條（點條紋）；線紋：這是由硅質(zhì)壁上許多小孔點緊密或稀疏排列而成，在普通顯微鏡下觀察時，無法分辨而是一條直線狀；孔紋：為硅質(zhì)壁上粗的孔腔，中心硅藻綱的孔紋基本為六角形，其結(jié)構(gòu)很復(fù)雜；肋紋：為硅質(zhì)壁上的管狀通道，內(nèi)由隔膜分成小室或壁上因硅質(zhì)大量沉積而增厚。
（6）三軸和三面：按硅藻細胞的方位分為縱軸、橫軸和貫殼軸。由縱軸和橫軸形成上、下殼面。由縱軸、貫殼軸形成長軸帶面。由橫軸、貫殼軸形成短軸帶面。從殼面看，稱殼面觀；從帶面（殼環(huán)面）看，稱帶面觀(側(cè)面觀)。殼面和帶面形狀截然不同。通常中心硅微藻殼面呈輻射對稱，多為圓形、橢圓形，也有三角形或多角形的；羽紋硅微藻，殼面一般細長，呈兩側(cè)對稱，有舟形、卵形、弓形、Ｓ形、菱形、新月形和橢圓形等。帶面（殼環(huán)面）一般為長方形、方形或楔形等?？v軸（apical axis）：為殼面中央的縱線，又稱頂軸、長軸。
橫軸(transapical axis)：為殼面中央的橫線，又稱切頂軸、短軸。
貫殼軸(pervalvar axis)：是上、下殼面中心點的相連線，又稱殼環(huán)軸。
2.2．色素體：硅藻的光合作用色素主要有葉綠素a、、c1 、c2以及β胡蘿卜素，巖藻黃素、硅藻黃素等。色素體呈黃綠色或黃褐色，形狀有粒狀、片狀、葉狀、分枝狀或星狀等。
2.3、同化產(chǎn)物：主要是油滴，顯微鏡下觀察，油點常呈小球狀，光亮透明。
2.4、細胞核：硅藻的細胞核一個,常位于細胞中央，在液泡很大的細胞中，常被擠到一側(cè)。用甲基藍或尼羅藍稀溶液染色，可見到細胞核。
3、生殖方式
硅藻常用一分為二的繁殖方法產(chǎn)生。分裂之后，在原來的殼里，各產(chǎn)生一個新的下殼。盒面和盒底分別名為上、下殼面。殼面彎伸部分名殼套。上下殼套向中間伸展部分，稱相連帶。上下相連帶總稱為殼環(huán)，這個面稱殼環(huán)面。有些種類，如根管藻（rhizosolenia），在殼環(huán)面細胞壁上還有很多次級相連帶，或稱間板。細胞質(zhì)和一般植物細胞相似。生殖方法有形成復(fù)大孢子、小孢子和休止孢子等。
A、營養(yǎng)生殖 為硅藻最普通的一種生殖方式。分裂初期，細胞的原生質(zhì)略增大，然后核分裂，色素體等原生質(zhì)體也一分為二，母細胞的上、下殼分開，新形成的兩個細胞各自再形成新的下殼，這樣形成的兩個新細胞中，一個與母細胞大小相等，一個則比母細胞小。這樣連續(xù)分裂的結(jié)果，個體將越來越小。這在自然界和室內(nèi)培養(yǎng)的硅藻可見到。
b、復(fù)大孢子 硅藻細胞經(jīng)多次分裂后，個體逐漸縮小，到一個限度，這種小細胞不再分裂，而產(chǎn)生一種孢子，以恢復(fù)原來的大小，這種孢子稱為復(fù)大孢子。復(fù)大孢子的形成方式有無性和有性兩種。
（1）無性方式 是由營養(yǎng)細胞直接膨大而成，如中心綱的變異直鏈藻（melosira varians）。
（2）有性方式 通過接合作用，借助運動或分泌膠質(zhì)使個體接近，然后包圍于共同膠質(zhì)膜內(nèi)，進行接合。3.小孢子 多見于中心硅藻的一種生殖方式，細胞核和原生質(zhì)多次分裂，形成8、16、32、64、128個不等小孢子，每個小孢子具1- 4條鞭毛，長成后成群逸出，相互結(jié)合為合子，每個合子再萌發(fā)成新個體。4休眠孢子 是沿海種類在多變的環(huán)境中的一種適應(yīng)方式。休眠孢子的產(chǎn)生常在細胞分裂后，原生質(zhì)收縮到中央，然后產(chǎn)生厚壁，并在上、下殼分泌很多突起和各種棘刺。當環(huán)境有利時，休眠孢子以萌芽方式恢復(fù)原有形態(tài)和大小。
4、分類概述
根據(jù)殼的形狀和花紋排列方式，硅藻門分成二個綱。中心硅藻綱centriae和羽紋硅藻綱pennatae。
4.1、中心硅藻綱
花紋輻射對稱排列。細胞圓盤形、圓柱形或三角形、多角形等。細胞外面常有突起和刺毛。沒有殼縫或假殼縫，不能運動。中心硅藻大多分布淡水中，淡水種類很少。本綱分成三個目。
(1)、圓篩藻目coscinodiscales
單細胞，或以殼面相連成鏈狀或靠膠質(zhì)絲連成鏈狀，或埋于膠質(zhì)內(nèi)。細胞常為圓形，鼓形或圓柱形，透鏡形等。橫斷面圓形。殼緣平滑，有的種類殼緣具小刺。常見屬直鏈藻屬
melosira、圓篩藻屬coscinodiscus、小環(huán)藻屬cyclotella、海鏈藻屬thalassiosira、指管藻屬dactyliosolen、冠蓋藻屬stephanopyxis、輻桿藻屬bacteriastrum、漂流藻屬planktoniella、婁氏藻屬lauderia（凸盤鏈藻屬）、骨條藻屬skeletonema、細柱藻屬leptocylindrus、環(huán)毛藻屬corethron。
(2)、根管藻目rhizosoleniales
細胞殼面大多橢圓形，少數(shù)圓形。貫殼軸伸長而呈管狀，常有各種形狀的間生帶。殼面突起呈半球形、錐形、斜錐形等，末端常有小刺。常見屬根管藻屬rhizosolenia。
（3）、盒形藻目biddulphiales
單細胞或形成鏈狀群體。細胞形狀像一袋面粉或小盒子狀，各角隅常有突起，有的還具小刺。殼面橢圓形或多角形。大部分在海洋中營浮游生活。有的種類能分泌膠質(zhì)，營回著生活。淡水種類極少。常見屬角毛藻屬chaetoceros、半管藻屬hemiaulus、四棘藻屬atthetas、彎角藻屬eucampia、盒形藻屬biddulphia、雙尾藻屬ditylum、三角藻屬triceratium。
5、生態(tài)意義
（1）、分布特點 硅藻廣泛分布于淡水、淡水和半咸水中。硅藻是海洋浮游植物的主要組成者，是海洋初級生產(chǎn)力的一個重要指標。
（2）、生態(tài)特點 魚池清塘排水后，往往最先生殖的是菱形藻、小環(huán)藻等硅藻。這類既能浮游又能底棲（附生）的兼性浮游植物，大量發(fā)生可能與淺水、光照好及清塘后，水中硅酸鹽含量豐富有關(guān)。硅藻在季節(jié)上，一年四季春、夏、秋、冬都能形成優(yōu)勢種群。
（3）、餌料價值 硅藻死亡后的硅質(zhì)外殼，大量沉積海底，形成的硅藻土，含有85.2%的氧化硅。在工業(yè)上用途廣泛，可作為建筑、磨光等材料，過濾劑、吸附劑、造紙、橡膠、化妝品和涂料的填充劑，以及保溫材料等。硅藻土 硅藻死亡后的硅質(zhì)外殼，大量沉積海底，形成的硅藻土，含有85.2%的氧化硅。在工業(yè)上用途廣泛，可作為建筑、磨光等材料，過濾劑、吸附劑、造紙、橡膠、化妝品和涂料的填充劑，以及保溫材料等?；柙鍖κ涂碧接嘘P(guān)的地層鑒定及古海洋地理環(huán)境的研究也有重要的參考價值。
二、以固定化技術(shù)作為底棲性硅藻之保種：
Chen（2003）以等鞭定鞭藻（Isochrysis galbana）之固定化藻珠作為文蛤（Meretrix lusoria）的餌料來源，獲得良好的成果。利用褐藻酸鈉（Sodium alginate）來包埋微細微藻，可以防止微藻被沖刷掉、被草食大鯢吃食，易于操作管理及長期保種（Chen, 2001）。褐藻膠藻珠的制備比其它的方法（如冷凍保存法）來得容易、便宜且隨時可利用(Romo and Pérez-Martínez, 1997)。本研究亦嘗試以初期餌料所需之硅藻，做成固定化硅藻藻珠，以作為純種硅藻的保種，以提供將來應(yīng)用池之餌料培養(yǎng)。
▲ 圖10-5，硅藻的季節(jié)變化和控制因子。
實線表硅藻產(chǎn)量隨季節(jié)而變化，其中有兩個峰，
一個在春季，另一個在秋季。虛線表示水中營養(yǎng)因子的變化。
圖 硅藻與飼料喂養(yǎng)生長曲線
圖10--6溫度與硅藻生長關(guān)系
圖10--7微藻與營養(yǎng)鹽關(guān)系
三、硅藻純種微藻的培養(yǎng)：
本實驗參考 Provasoli（1968）配方及 Guillard 的（1973）f/2 配方并修改之，配上過濾過的新鮮淡水（鹽度 35‰），制成 PG medium（salinity= 35‰）。此 PG medium 另外添加 1 ml 內(nèi)含 30 g/L 的硅酸鈉（NaSiO）和 0.0013 g/L 亞硒酸（HSeO）的混合溶液，作為底棲性硅藻生長時合成硅殼所需要的硅質(zhì)來源。因有些硅藻具有異營性，在弱光及黑暗的環(huán)境中會吸收溶解性有機顆粒(dissolved organic compound, DOC)，作為代替光合作用的能量來源（Graham and Wilcox, 2000)。因此本研究在每公升 PG medium 中另外添加自制的土壤萃取液（Soil extract）0.5 ml，作為有機質(zhì)的來源。最后將配制好的培養(yǎng)液放入滅菌釜（Tomin TM-328）中在 1.1 atm，121℃下滅菌二十分鐘后，冷卻備用。 在容量 500 ml 的三角錐瓶中分別加入 100 ml 的池水及原水，分別添加 300 ml 的 PG35‰+Si+Se+Soil extract 培養(yǎng)液（簡稱為 PG modified medium）后，做預(yù)備培養(yǎng)。因為帶回的原水中，可能會有某些硅藻的孢子尚未萌發(fā)，而這些孢子在顯微鏡下很難觀察得到，預(yù)備培養(yǎng)可以讓原水中出現(xiàn)更多數(shù)量和種類的微藻。 本研究是以劃線法與稀釋法進行微藻的純化工作，方法如下：劃線法需制作固體培養(yǎng)基（agar plate）作為微藻的附著基質(zhì)。固體培養(yǎng)基制作如下：取 100 ml 的 PG modified medium 及2克 bacto-agar（DIFCO, U.S.A.）倒入容量 250 ml 的玻璃三角錐瓶內(nèi)，用鋁箔紙和橡皮筋將瓶口封上，放入不銹鋼鍋，以確保水氣不會進入瓶中，最后置于滅菌釜中，在 121℃、1.1atm 滅菌 20 分鐘。待滅菌結(jié)束后，趁尚未冷卻固化前，倒入以迦瑪射線（γ-ray）滅菌過的 150×14.5 mm培養(yǎng)皿（Alpha Plus, Taiwan）中，輕輕搖晃使其平鋪均勻；待凝固后用石蠟?zāi)ぃˋmerican National Can, U.S.A.）封好。在培養(yǎng)皿蓋上寫明制作日期、培養(yǎng)液種類，并用封口袋封好，置于 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?. 取已經(jīng)預(yù)備培養(yǎng)過的池水及原水，或是直接從繁殖場的浪板上刮取附著性硅藻的藻膜，以接種環(huán)或滅菌過的棉花棒沾取或刮取藻水來進行劃線法，以純化微藻。培養(yǎng)期間以倒立顯微鏡（PoTop, Taiwan）觀察固體培養(yǎng)基上微藻生長的情形。 2. 當有單離的群落出現(xiàn)時，以接種環(huán)或毛細管將該群落接種到250 ml 的三角錐瓶（內(nèi)含 150 ml PG modified medium）繼續(xù)培養(yǎng)以增加微藻的密度（約需要七到十四天）。 稀釋法：某些無法在固體培養(yǎng)基上生長的微藻，以此方法來加以純化。
圖10—8浮游植物與硅藻生長曲線相似性
圖10--9硅藻生長與水溫呈負相關(guān)
1、先在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)每一滴（0.05 ml）的預(yù)備培養(yǎng)液中有多少只藻。
2. 用培養(yǎng)液將藻水稀釋至每一滴水中僅有一只藻的狀況。例如，每 1 ml 原水中有 1×10只藻，則取 1 ml 的原水加入 999 ml 的 PGmodified medium 稀釋。
3. 以 16×100 mm 的透明玻璃試管(Kimble, U.S.A.)，添加 5 mlPG modified medium，在管口塞上棉花塞，滅菌后備用。
4. 每支試管中，分別滴入一滴或兩滴稀釋過的藻水，置于植物培養(yǎng)箱中，約七十二小時后觀察微藻生長情形。5. 當管中出現(xiàn)單一或優(yōu)勢的藻種后，則直接轉(zhuǎn)接到 250 ml 三角錐瓶中（內(nèi)含 150 ml PG modified medium）繼續(xù)培養(yǎng)。 以上進行純化培養(yǎng)期間時，微藻皆放在植物培養(yǎng)箱（Firstek RI201,Taiwan）中，培養(yǎng)條件為：24 /2℃ 2℃（Light/Dark），12:12（Light/Dark），光度為 122 μmol photos ms·-1。
硅藻圖:10-10所示。（注:純種化微藻以SEM黑白圖顯示）
12
第十二章娃娃魚餌料生物的培養(yǎng)
第一節(jié)
娃娃魚餌料生物的室內(nèi)培養(yǎng)
微藻培養(yǎng)方法簡介
微藻,特別是單細胞微藻的營養(yǎng)豐富,含有大鯢和人生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì).自上世紀四十年代以來,各國學(xué)者都試圖用微藻這一資源解決人類食物和動物餌料的缺乏問題.另一方面,微藻可直接或間接的作為魚類及其它水生動物的餌料,因此,微藻培養(yǎng)對娃娃魚繁殖具有更大意義.關(guān)于微藻培養(yǎng),還有其它意義,從一些微藻提取藥物;或研究微藻生理,以及用于太空食品等.在漁業(yè)利用方面,微藻培養(yǎng)主要是解決娃娃魚餌料.今后,隨著繁殖事業(yè)的發(fā)展,對一些新品種的繁殖以及解決某些品種幼魚的餌料,必然涉及到微藻的培養(yǎng).因此,有必要了解微藻培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識.先僅就微藻,主要是單細胞微藻的一般培養(yǎng)方法及有關(guān)理論加以簡述.微藻的生長模式單細胞微藻在培養(yǎng)過程中,生長繁殖的速度,出現(xiàn)一定的起伏,這種生長模式可劃分為六個時期
一、擬球藻Nannochloropsis oculata
金藻門 Chrysophycophyta
真眼點藻綱 Eustigmatophyceae
真眼點藻目 Eustigmatales
單珠藻科 Monodopsidaceae
1、生物特性
擬球藻之細胞為小球體（圖4d），直徑2～4微米，無鞭毛，無眼點，外觀與綠球藻極相似，故稱之為擬球藻。唯細胞較小，藻色稍黃（培養(yǎng)老化時更明顯），分裂時產(chǎn)生兩個子細胞（綠球藻產(chǎn)生四個）。此藻在1986年始經(jīng)日本筑波大學(xué)千原光雄等定名為 （annochloropsis oculata（Maruyama et al., 1986），在此之前在日本稱之為海產(chǎn)綠球藻（marine Chlorella）。擬球藻屬真眼點藻綱，含有葉綠素a及類胡蘿卜素violaxanthin及vaucheriaxanthin ester，而綠球藻屬綠藻綱則含有葉綠素a、b及類胡蘿卜素lutein。擬球藻主要發(fā)生于溫帶水域。最近之研究（Gladu, et al., 1995）亦指出名為Chlorella minutissima UTEX 2341 Fott et Novakova之藻株，含有其它Chlorella 藻株沒有的sterols，如cholesterol、isofucosterol、24～methylenecholesterol及fucosterol及，并含有20：5n3、chlorophyll a及 violaxanthin，不含 chlorophylls b 或 c；應(yīng)亦屬真眼點藻綱之 Nannochloropsis sp。其在生長停滯期的細胞有相當比例具有細胞外構(gòu)造，離心會移去或瓦解該構(gòu)造。 Nannochloropsis 屬細胞內(nèi)之色素成份chlorophyll a：b：c：p（carotenoid）之比值為1：0.00～0.03：0.01～0.03：0.04～0.54，但Chlorella屬則為1：0.34：0.02：0.35。因此某些分類上名為Chlorella屬者，其真正類別待驗證。
真眼點藻綱亦包含原屬綠藻綱之Nannochloris oculata及原屬黃藻綱（Xanthohyceae）之Monallantus salina 。綠藻綱含Chlorophylla＆b及類胡蘿卜素lutein，黃藻綱含chlorophylla＆c及類胡蘿卜素didinoxanthin＆diatoxanthin，真眼點藻綱含Chlorophyll a及類胡蘿卜素violaxanthin＆vaucheriaxanthin ester。其中N. oculata具有urease（尿素分解酵素），細胞二分裂，不產(chǎn)生動孢子。 Ellipsoidon與Monallantus為同屬異名（Bourrelly 1968，cited in Antia et al.,1975），故E. acuminatum 亦為真眼點藻綱之一成員（Hibberd and Leedale，1972，cited in Antia et al.,1975）。
2.培養(yǎng)方法
（1）溫度、鹽度、光照度及pH值：擬球藻在10～35℃溫度范圍內(nèi)均能增殖，而以25～31℃間之增殖率最高，在37℃之水溫環(huán)境中2～4小時仍能活存，且于降溫后仍能增殖。對鹽度之適應(yīng)范圍甚廣，在5～77ppt范圍內(nèi)均能增殖，而以20～35ppt鹽度之增殖最好。喜歡強光照，增殖率隨照度增加而增加，至12,000 lux時增殖率達最高，且維持不變至30,000 lux仍可維持最高增殖率。培養(yǎng)液最初的pH值與增殖率間之關(guān)系呈拋物線，以pH7.5～8.8之增殖最好。
日本屋島試驗場于1963年在1噸水槽中施肥，培養(yǎng)采自屋島灣之硅藻，起初硅藻滋生繁茂，不久即漸減，且水色由褐轉(zhuǎn)綠，終于變成以海產(chǎn)綠球藻為優(yōu)勢種。于是接入橈足類飼養(yǎng)，但不久橈足類即漸死亡，僅剩微藻仍繼續(xù)增殖。而后雖棄之不管，但隨著藻色漸淡，卻伴生許多白色小點的壺形輪蟲。得此啟示，研究人員乃開始以擬球藻培養(yǎng)輪蟲，并以輪蟲投喂魚苗，展開海產(chǎn)魚介類種苗生產(chǎn)的新頁。擬球藻含有豐富的二十碳五烯酸（EPA），故頗適于壺形輪蟲的培養(yǎng)與營養(yǎng)強化，以及種苗培育池之水色維持。
（2）肥料：擬球藻最初于日本屋島試驗場培養(yǎng)時，所用之肥料為硫酸銨50g/噸、過磷酸鈣15g/噸、帝國化學(xué)制造之Clewat-32（微量金屬混合物）5g/噸。目前，日本各大鯢試驗場、栽培漁業(yè)中心之使用量為：硫酸銨50～100公克/噸、尿素10～60公克/噸、過磷酸鈣15～30公克/噸、Clewat-32 0～5公克/噸。依據(jù)筆者試驗結(jié)果，使用單一氮肥時尿素效果最好，不過混合等濃度硫酸銨及尿素之肥效比單一氮肥更好，因此，目前使用硫酸銨66公克/噸、尿素30公克/噸、過磷酸鈣30公克/噸。一般于培養(yǎng)之始以全部水量來計算基肥使用量，且于再添新水時再施肥，施肥量以所加水量計算。
3、培養(yǎng)流程：
(1）、清洗水槽，使用有效氯10％左右之工業(yè)用漂白水消毒水槽、打氣管及打氣石。漂白水使用量為10～20 ppm有效氯，亦即1噸水加100～200 ml工業(yè)漂白水。
(2）、培養(yǎng)槽注入淡水，接著加入10 ppm有效氯之漂白水，靜置隔夜后，再加入10 ppm（10公克/噸）硫代硫酸鈉（海波）中和殘余氯，然后接種良好藻種，藻種與新注入淡水的比例為1/1～1/5，視種源質(zhì)量、淡水水質(zhì)及氣候而定。另外，可使用淡水及自來水（藉水中余氯來消毒）調(diào)成鹽度15～20 ppt之培養(yǎng)用水。
(3）、施肥打氣培養(yǎng)至水色不再變濃時（約4～7天），收獲1/3水量之藻水，供作輪蟲培養(yǎng)或其它水槽接種用種源，而后原水槽再加入新淡水，并添加肥料，如此重復(fù)進行至藻細胞增殖不良時全部收獲；或采回分式培養(yǎng)，當水色不再變濃時，一次全部收獲。
(4）、如需再培養(yǎng)則從流程(1）開始。
4、問題點與改善方法：
(1）、輪蟲感染：注意藻池與輪蟲池之分開，使用器具需加以隔離，工作人員須謹慎操作，感染之藻池必須以漂白水浸泡消毒后再使用。
(2）、原生動物感染特別在高水溫期易發(fā)生，因此，各項設(shè)備及用水需使用漂白水加以消毒，以減緩感染。最好的預(yù)防方法是利用藻種優(yōu)勢抑制原生動物的感染，亦即收獲量或加新水量需少于總水量的1/2，而每間隔3～5天收獲一次。
(3）、其它微藻感染：選擇優(yōu)良種源，并采藻種優(yōu)勢培養(yǎng)，可有效抑制其它微藻感染。
(4）、藻色變化之控制：注意水質(zhì)及天氣變化，適時注水降溫、降pH值，移殖或收獲。
(5）、攪拌及光照之控制：由于細胞不會游動，若打氣不足，培養(yǎng)較長時，底部會有沉淀層，因此需每日大攪拌一次將池底揚起。擬球藻喜強光，藻濃度高時，由于細胞相互遮蔽，會降低光照強度，故需降低水位以增加照度，有覆蓋時，水深以30～40cm為宜，露天時不超過100cm，冬天水位宜低，夏天可加深。
(6）、日本研究人員岡內(nèi)正典（國立南西海區(qū)大鯢研究所）私人通信（1997）指出，在下雨季節(jié)，由于某些鞭毛蟲及纖毛蟲的增加，導(dǎo)致戶外大量培養(yǎng)槽中藻濃度驟減。嘗試許多種處理方法，迄今仍未找到一確定有效的方法。當然地，可用氯作殺菌與殺蟲劑來處理接種前之培養(yǎng)用水，但其作用不清楚。通常，當培養(yǎng)液中之原生動物增加時，丟棄所有之培養(yǎng)，重新再來。所以應(yīng)保存小量培養(yǎng)，不受污染，然后接種于大量培養(yǎng)中。一般在仔魚飼育季節(jié)前，維持10支以上15mL的無菌培養(yǎng)。然后接種于500mL三角瓶，再接于10 L玻離瓶。這些培養(yǎng)用水均用高壓高溫滅菌釜處理。仔魚飼育季節(jié)時，培養(yǎng)10至20個10 公升玻璃瓶。 10 公升玻離瓶用來接種戶外培養(yǎng)，在短期內(nèi)，完全用來培養(yǎng)輪蟲；若取大量培養(yǎng)之部份藻水作種源，再接種做作大量培養(yǎng)，結(jié)果一般不好。最近，在日本有許多繁殖場，用濾心及淡水滅菌設(shè)備（UV-Ozone 或 UV），結(jié)果還好，但還不是最好。因此，被迫使用商品化的淡水綠藻取代擬球藻來培養(yǎng)輪蟲。
