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背景： 超過(guò)生理劑量的糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期應(yīng)用造成下丘腦—垂體—腎上腺(HPA)軸抑制和腎上腺皮質(zhì)萎縮。突然停藥之后，易致腎上腺皮質(zhì)功能不全，對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定甚至是生命存在潛在的威脅，為避免疾病復(fù)發(fā)和促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)功能恢復(fù)，劑量遞減仍是臨床采用的唯一方法，但需要幾個(gè)月甚至是1年以上的時(shí)間。因此，尋找新的方法拮抗糖皮質(zhì)激素對(duì)HPA軸的抑制，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)功能恢復(fù)，是臨床醫(yī)學(xué)需要解決的重要命題。迄今國(guó)外還沒(méi)有找到有效拮抗糖皮質(zhì)激素對(duì)HPA軸抑制的藥物。而根據(jù)課題組系列前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究，補(bǔ)腎復(fù)方及從補(bǔ)腎復(fù)方中精選出的單味中藥淫羊藿、淫羊藿的提取物淫羊藿總黃酮(EF)能有效拮抗糖皮質(zhì)激素對(duì)HPA軸抑制，保護(hù)腎上腺皮質(zhì)功能。 腎上腺皮質(zhì)功能有賴于腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和功能。研究表明腎上腺皮質(zhì)外側(cè)存在干細(xì)胞，腎上腺皮質(zhì)干細(xì)胞在外側(cè)增殖、并向內(nèi)側(cè)遷移和分化從而形成腎上腺皮質(zhì)各個(gè)功能層，依次為球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶，這種腎上腺皮質(zhì)再生和另一個(gè)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞凋亡共同調(diào)節(jié)了腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和功能。因此本研究擬從兩個(gè)方面研究EF的作用機(jī)制。 目的： 1、EF對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞過(guò)度凋亡的影響及分子機(jī)制。2、EF對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)再生的影響及分子機(jī)制。 材料與方法： 動(dòng)物：動(dòng)物采用清潔級(jí)SD大鼠，雄性，4月齡。 藥物：EF采用遼寧產(chǎn)朝鮮淫羊藿，由上海市醫(yī)藥工業(yè)研究院中藥室提取。 方法：分為正常對(duì)照組、模型組、治療組。模型組皮下注射皮質(zhì)酮每天5mg／kg，連續(xù)14天。治療組用EF灌胃，于造模前5天開始灌胃直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，劑量為每天0.06g／kg。①采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫分析方法檢測(cè)大鼠血漿皮質(zhì)酮水平，以評(píng)價(jià)EF治療對(duì)HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)功能的保護(hù)效果。②檢測(cè)大鼠腎上腺重量和采用HE染色對(duì)大鼠腎上腺皮質(zhì)進(jìn)行組織學(xué)觀察，以觀察EF防治腎上腺萎縮的效果。③兩種方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分離的腎上腺細(xì)胞凋亡率；并采用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的X-dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)原位細(xì)胞凋亡。④兩種方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布；大鼠處死前1天腹腔注射BrdU，取腎上腺，BrdU免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)處于DNA合成期的細(xì)胞。⑤造模前1天大鼠腹腔注射BrdU以標(biāo)記增殖細(xì)胞，14天后取腎上腺，采用BrdU免疫組織化學(xué)染色法觀察增殖細(xì)胞的遷移情況；⑥采用基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究EF對(duì)細(xì)胞凋亡、增殖等過(guò)程發(fā)揮作用的分子機(jī)制。 結(jié)果： 1、各組大鼠血漿皮質(zhì)酮水平：正常對(duì)照組、模型組、治療組血漿皮質(zhì)酮水平分別為：96.03±30.95ng／ml(n=16)、30.72±21.73ng／ml(n=16)、53.79±25.63ng／ml(n=24)，模型組和正常對(duì)照組比較，血漿皮質(zhì)酮水平顯著減低(P＜0.01)，治療組和模型組比較，血漿皮質(zhì)酮水平升高(P＜0.05)。表明EF能保護(hù)HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)功能。 2、各組大鼠腎上腺重量和組織學(xué)檢測(cè)：正常對(duì)照組、模型組、治療組分別為49.63±6.00、28.88±9.45、34.97±4.84mg，模型組腎上腺重量與正常對(duì)照組比較顯著下降(P＜0.01)，治療組與模型組比較顯著升高(P＜0.05)，同時(shí)HE染色顯示EF使腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞密度增加，組織學(xué)改善。提示EF具有防止腎上腺萎縮的作用。 3、細(xì)胞凋亡檢測(cè)：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果正常對(duì)照組、模型組、治療組細(xì)胞凋亡率分別為7.91±6.063％、14.42±4.851％、8.62±5.59％，模型組與正常對(duì)照組比較顯著升高(P＜0.05)，治療組與模型組比較顯著下降(P＜0.05)。TUNEL法顯示正常對(duì)照組組、模型組、治療組每張切片平均凋亡細(xì)胞數(shù)分別為4.67±1.53、70.67±9.29、18.67±7.64個(gè)，模型組與正常對(duì)照組比較顯著升高(P＜0.05)，治療組與模型組比較顯著下降(P＜0.05)。表明EF能明顯降低皮質(zhì)酮大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞過(guò)度的細(xì)胞凋亡。 4、細(xì)胞增殖檢測(cè)：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布結(jié)果示正常對(duì)照組、模型組、治療組處于G0／G1期細(xì)胞比例分別為76.36±1.93％、93.40±1.70％、85.70±2.62，與正常對(duì)照組比較，模型組顯著升高(P＜0.01)；而治療組與模型組比較顯著降低(P＜0.01)。處于G2／M期的細(xì)胞比例三組分別為20.28±1.50％，2.86±1.73％，9.53±5.15％，與正常對(duì)照組比較，模型組顯著降低(p＜0.01)；而治療組與模型組比較顯著升高(p＜0.01)。BrdU免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示陽(yáng)性染色細(xì)胞位于外側(cè)球狀帶；正常對(duì)照組、模型組、治療組陽(yáng)性染色細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)的比率分別為35.15±13.91％、、15.71±7.58％、48.52±10.59％，與正常對(duì)照組比較，模型組顯著降低(p＜0.01)；與模型組比較，治療組顯著升高(p＜0.01)。表明EF能促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)外側(cè)區(qū)或細(xì)胞的增殖。 5、增殖細(xì)胞遷移檢測(cè)：造模前1天即給大鼠腹腔注射BrdU，對(duì)處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，這些標(biāo)記細(xì)胞隨時(shí)間而遷移。以球狀帶和束狀帶的分界為界線，14天之后，BrdU免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組和模型組的標(biāo)記細(xì)胞均位于球狀帶，治療組絕大部分標(biāo)記細(xì)胞位于束狀帶／網(wǎng)狀帶。表明EF能促進(jìn)被標(biāo)記的增殖細(xì)胞向內(nèi)側(cè)遷移。 6、EF減輕細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞周期、促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌功能的分子機(jī)制：采用美國(guó)Affymetrix公司Rat expression 230 2.0基因芯片，基因差異表達(dá)(上調(diào)或下調(diào))兩倍以上為有意義。發(fā)現(xiàn)模型組與正常對(duì)照組比較，上調(diào)的基因29個(gè)，下調(diào)的基因785個(gè)，反映皮質(zhì)酮主要抑制腎上腺基因表達(dá)。其中有3個(gè)為凋亡相關(guān)基因：AMP-activated protein kinase alpha 1 catalytic subunit、inhibitor of apoptosis protein 1、baculoviral IAP repeat-containing 4，均具有抗凋亡活性；參與細(xì)胞周期的基因有6個(gè)，分別是neuroblastoma RAS viral(v-ras)oncogene homolog、nuclear factor I／A、forkhead box O1、v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog(avian)、fibroblast growth factor 7(FGF7)、interleukin 1 alpha，均具促進(jìn)細(xì)胞周期活性。治療組與模型組比較，上調(diào)的基因有237個(gè)，下調(diào)的基因有122個(gè)。其中有2個(gè)具抗凋亡活性的基因上調(diào)：mitogen activated protein kinase 8 interacting protein、insulin-like growth factorⅡ(IGF-Ⅱ)；有6個(gè)是促進(jìn)細(xì)胞周期基因：FGF7、IGF-Ⅱ、mismatch repair protein、ret proto-oncogene、v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog(avian)、prostaglandin-endoperoxide synthase 2；有7個(gè)與皮質(zhì)類固醇合成相關(guān)的基因上調(diào)：mevalonate kinase、mevalonate pyrophosphate decarboxylase、famesyl diphosphate farnesyl transferase 1、isopentenyl-diphosphate delta isomerase、2，3-oxidosqualene anosterol cyclase、cytochrome P450 subfamily 51、farensyl diphosphate synthase?；虮磉_(dá)譜的結(jié)果既在分子水平映證了EF減輕HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞凋亡的效果；也提示對(duì)細(xì)胞增殖、分化(多種類固醇合成酶基因上調(diào))叢而對(duì)腎上腺皮質(zhì)再生具有重要作用?；虮磉_(dá)譜檢測(cè)結(jié)果顯示EF明顯上調(diào)IGF-Ⅱ和FGF-7的mRNA表達(dá)，根據(jù)文獻(xiàn)，IGF和FGF家族與腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞表面受體結(jié)合后對(duì)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化、類固醇合成多個(gè)過(guò)程均具有重要的調(diào)控作用，因此是調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)再生的重要上游分子；我們對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步觀察，分離正常大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，直接與EF溶液孵育，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)其基因表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與EF共同孵育后，IGF-ⅡmRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)；而FGF-7mRNA表達(dá)無(wú)變化(P＞0.05)。綜合基因芯片和定量PCR結(jié)果，IGF-Ⅱ和FGF7在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(基因芯片檢測(cè))mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)；并且IGF-ⅡmRNA在體外實(shí)驗(yàn)(直接與EF溶液孵育)也被EF上調(diào)，表明IGF-Ⅱ和FGF-7均介導(dǎo)了EF促腎上腺皮質(zhì)再生作用，但EF能直接誘導(dǎo)IGF-ⅡmRNA表達(dá)，可能對(duì)介導(dǎo)EF的作用更為重要。 結(jié)論： 通過(guò)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，我們認(rèn)為EF能通過(guò)干預(yù)以下兩個(gè)細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制拮抗糖皮質(zhì)激素對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能的抑制： 1、EF能減輕皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞過(guò)度凋亡。 2、EF能促進(jìn)皮質(zhì)酮透導(dǎo)的HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)再生。根據(jù)大量文獻(xiàn)研究，BrdU標(biāo)記細(xì)胞可認(rèn)為是腎上腺皮質(zhì)干細(xì)胞，我們采用完全相同的方法，觀察到EF作用后BrdU標(biāo)記細(xì)胞增殖活躍；更多細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期；促進(jìn)BrdU標(biāo)記細(xì)胞向內(nèi)側(cè)遷移；多種類固醇合成相關(guān)酶基因表達(dá)上調(diào)。綜上我們認(rèn)為EF干預(yù)了腎上腺皮質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化的各個(gè)過(guò)程，從而促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)再生。兩個(gè)重要的生長(zhǎng)因子IGF-Ⅱ和FGF7雖以不同方式，但均介導(dǎo)EF促進(jìn)再生的作用。 拮抗糖皮質(zhì)激素對(duì)HPA軸的抑制是亟需解決的重要問(wèn)題，我們通過(guò)系列研究發(fā)現(xiàn)EF在此方面具有明確的效果，機(jī)制研究表明EF能拮抗皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的過(guò)度細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活腎上腺皮質(zhì)干細(xì)胞行為，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)再生，從而在根本上重建了腺皮質(zhì)功能。