一、ATP的生成方式
體內(nèi)ATP生成有兩種方式
(一)底物水平磷酸化(substrate level phosphorylation) 底物分子中的能量直接以高能鍵形式轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP，這個過程稱為底物水平磷酸化，這一磷酸化過程在胞漿和線粒體中進(jìn)行，包括有：
(二)氧化磷酸化(oxidative phosphorylation) 氧化和磷酸化是兩個不同的概念。氧化是底物脫氫或失電子的過程，而磷酸化是指ADP與Pi合成ATP的過程。在結(jié)構(gòu)完整的線粒體中氧化與磷酸化這兩個過程是緊密地偶聯(lián)在一起的，即氧化釋放的能量用于ATP合成，這個過程就是氧化磷酸化，氧化是磷酸化的基礎(chǔ)，而磷酸化是氧化的結(jié)果。
機(jī)體代謝過程中能量的主要來源是線粒體，既有氧化磷酸化，也有底物水平磷酸化，以前者為主要來源。胞液中底物水平磷酸化也能獲得部分能量，實際上這是酵解過程的能量來源。對于酵解組織、紅細(xì)胞和組織相對缺氧時的能量來源是十分重要的。
二、氧化磷酸化偶聯(lián)部位的測定
確定氧化磷酸化偶聯(lián)部位通常用兩種方法。
(一)P/0值測定 P/0值指在氧化磷酸化過程中消耗一克原子氧所消耗的無機(jī)磷的克原子數(shù)，或者說消耗一克原子氧所生成的ATP的克分子數(shù)。P/0值實質(zhì)上指的是呼吸過程中磷酸化的效率。
測定P/0值的方法通常是在一密閉的容器中加入氧化的底物、ADP、Pi、氧飽和的緩沖液，再加入線粒體制劑時就會有氧化磷酸化進(jìn)行。反應(yīng)終了時測定O2消耗量(可用氧電極法)和Pi消耗量(或ATP生成量)就可以計算出P/0值了。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入不同的底物，可測得各自的P/0值，結(jié)合我們所了解的呼吸鏈的傳遞順序，就可以分析出大致的偶聯(lián)部位了。
(二)根據(jù)氧化還原電位計算電子傳遞釋放的能量是否能滿足ATP合成的需要
氧化還原反應(yīng)中釋放的自由能△G'O與反應(yīng)底物和產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位差值(△E'O)之間存在下述關(guān)系：△G'O=瞡F△E'O
式中n為氧化還原反應(yīng)中電子轉(zhuǎn)移數(shù)目，F(xiàn)為法拉弟常數(shù)(23.062千卡/克分子·伏特，或96500庫侖/克分子)。
一克分子ATP水解生成ADP與Pi所釋放的能量為7.3千卡，凡氧化過程中釋放的能量大于7.3千，均有可能生成一克分子ATP，就是說可能存在有一個偶聯(lián)部位，根據(jù)上式計算，當(dāng)n=2時，△E'O=0.1583V時可釋放7.3千卡能量，所以反應(yīng)底物與生成物的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位的變化大于0.1583V的部位均可能存在著一個偶聯(lián)部位。
呼吸鏈磷酸化的全過程可用下述方程式表示
NADH+H++3ADP+3Pi+1/2O2→NAD++3ATP+4H2O
FADH2+2ADP+2Pi+1/2O2→FAD+2ATP+3H2O
三、氧化磷酸化中ATP生成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
ATP是由位于線粒體內(nèi)膜上的ATP合成酶催化ADP與Pi合成的。ATP合成酶是一個大的膜蛋白質(zhì)復(fù)合體，分子量在480?00kD，是由兩個主要組成(或稱因子)構(gòu)成，一是疏水的F0，另一是親水的F1，又稱F0F1復(fù)合體。在電子顯微鏡下觀察線粒體時，可見到線粒體內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)有許多球狀顆粒突起，這就是ATP合成酶，其中球狀的頭與莖是F1部分，分子量為350?/P>380kD，由α3、β3、γ、δ、ε等9種多肽亞基組成，β與α亞基上有ATP結(jié)合部位；γ亞基被認(rèn)為具有控制質(zhì)子通過的閘門作用；δ亞基是F1與膜相連所必需，其中中心部分為質(zhì)子通路；ε亞基是酶的調(diào)節(jié)部分，F(xiàn)0是由3?個大小不一的亞基組成，其中有一個亞基稱為寡霉素敏感蛋白質(zhì)(oligomycin瞫ensitivity瞔onferringprotein,OSCP)，此外尚有一個蛋白質(zhì)部分為分子量28kD的因子，F(xiàn)0主要構(gòu)成質(zhì)子通道。
線粒體內(nèi)膜上三聯(lián)體(三分子體)結(jié)構(gòu)示意圖
四、氧化磷酸化的偶聯(lián)機(jī)制
有關(guān)氧化磷酸化的偶聯(lián)機(jī)理已經(jīng)作了許多研究，目前氧化磷酸化的偶聯(lián)機(jī)理還不完全清楚，50年代Slater及Lehninger提出了化學(xué)偶聯(lián)學(xué)說，1964年Boear又提出了構(gòu)象變化偶聯(lián)學(xué)說，這兩種學(xué)說的實驗依據(jù)不多，支持這兩種觀點的人已經(jīng)不多了。目前多數(shù)人支持化學(xué)滲透學(xué)說(chemiosmotic hypothesis)，這是英國生化學(xué)家P.Mitchell于1961年提出的，當(dāng)時沒有引起人們的重視，1966年他根據(jù)逐步積累的實驗證據(jù)和生物膜研究的進(jìn)展，逐步地完善了這一學(xué)說。
氧化磷酸化的化學(xué)滲透學(xué)說的基本觀點是：
1.線粒體的內(nèi)膜中電子傳遞與線粒體釋放H+是偶聯(lián)的，即呼吸鏈在傳遞電子過程中釋放出來的能量不斷地將線粒體基質(zhì)內(nèi)的H+逆濃度梯度泵出線粒體內(nèi)膜，這一過程的分子機(jī)理還不十分清楚。
電子傳遞與質(zhì)子傳遞偶聯(lián)(注：復(fù)合物Ⅱ未顯示)
2.H+不能自由透過線粒體內(nèi)膜，結(jié)果使得線粒體內(nèi)膜外側(cè)H+濃度增高，基質(zhì)內(nèi)H+濃度降低，在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)形成一個質(zhì)子跨膜梯度，線粒體內(nèi)膜外側(cè)帶正電荷，內(nèi)膜內(nèi)側(cè)帶負(fù)電荷，這就是跨膜電位△ψ。由于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)H+濃度不同，內(nèi)膜兩側(cè)還有一個pH梯度△pH，膜外側(cè)pH較基質(zhì)pH約低1.0單位，底物氧化過程中釋放的自由能就儲存于△ψ和△pH中，若以△P表示總的質(zhì)子移動力，那么三者的關(guān)系可用下式表示：
△P=△ψ-59△pH
3.線粒體外的H+可以通過線粒體內(nèi)膜上的三分子體順著H+濃度梯度進(jìn)入線粒體基質(zhì)中，這相當(dāng)于一個特異的質(zhì)子通道，H+順濃度梯度方向運動所釋放的自由能用于ATP的合成，寡霉素能與OSCP結(jié)合，特異阻斷這個H+通道，從而抑制ATP合成。有關(guān)ATP合成的分子機(jī)制目前還不十分清楚。
4.解偶聯(lián)劑的作用是促進(jìn)H+被動擴(kuò)散通過線粒體內(nèi)膜，即增強(qiáng)線粒體內(nèi)膜對H+的通透性，解偶聯(lián)劑能消除線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度，所以不能再合成ATP。
總之，化學(xué)滲透學(xué)說認(rèn)為在氧化與磷酸化之間起偶聯(lián)作用的因素是H+的跨膜梯度。
每對H+通過三分子體回到線粒體基質(zhì)中可以生成一分子ATP。以NADH+H+作底物，其電子沿呼吸鏈傳遞在線粒體內(nèi)膜中形成三個回路，所以生成3分子ATP。以FADH2為底物，其電子沿琥珀酸氧化呼吸鏈傳遞在線粒體內(nèi)膜中形成兩個回路，所以生成兩個ATP分子。
自從Mitchell提出化學(xué)通透學(xué)說以來，已為大量的實驗結(jié)果驗證，為該學(xué)說提供了實驗依據(jù)。
美國Cohen等人于1978年使用完整的大鼠肝細(xì)胞作實驗材料，以核磁共振(nuclear magneticresonance,NMR)的方法直接觀察到完整細(xì)胞中胞液與線粒體基質(zhì)之間存在H+跨膜梯度，胞液的pH值比線粒體基質(zhì)的pH值低0.3單位，用解偶聯(lián)劑處理，或用氮氣代替氧氣切斷氧的供應(yīng)，那么胞液和線粒體基質(zhì)之間的pH梯度消失。
嗜鹽菌(halobacterium haloblum)是一種能在高濃度鹽溶液中生長的細(xì)菌，該菌中有一種結(jié)合蛋白質(zhì)，稱為菌紫質(zhì)(bacteriorhodopsin)，菌紫質(zhì)能將光能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能。有人使用嗜鹽菌作實驗，在無O2的情況下用光照射嗜鹽菌，盡管無氧化作用，菌體內(nèi)仍維持一定的ATP濃度，若加入解偶聯(lián)劑或加入磷酸化抑制劑DCC，則菌體內(nèi)ATP濃度降低；而加入呼吸抑制劑抑制電子傳遞，即不影響ATP合成，ATP濃度不變，這說明電子傳遞和H+運動是可以分開加以研究的，嗜鹽菌為研究化學(xué)滲透學(xué)說的H+運動提供了一個理想的模型。于是，有人分離嗜鹽菌的菌紫質(zhì)，并將其重組在人工脂質(zhì)體中，然后用光照射，可測得跨膜電位為120mV(內(nèi)負(fù)外正)，同時膜外側(cè)H+濃度增高，膜內(nèi)外△pH約為1.8單位，可以算出總的質(zhì)子移動力約為△P=-120mV-59×1.8mV=226mV，若再將牛心線粒體內(nèi)膜重組在此脂質(zhì)體中，光照后可使ADP+Pi生成ATP，這說明質(zhì)子跨膜梯度可以經(jīng)過線粒體內(nèi)膜的三分子體將H+跨膜梯度中儲存的能量轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP分子中的化學(xué)能。
五、氧化磷酸化抑制劑
氧化磷酸化抑制劑可分為三類，即呼吸抑制劑、磷酸化抑制劑和解偶聯(lián)劑。
(一)呼吸抑制劑 這類抑制劑抑制呼吸鏈的電子傳遞，也就是抑制氧化，氧化是磷酸化的基礎(chǔ)，抑制了氧化也就抑制了磷酸化。呼吸鏈某一特定部位被抑制后，其底物一側(cè)均為還原狀態(tài)，其氧一側(cè)均為氧化態(tài)，這很容易用分光光度法(雙波長分光光度計)檢定，重要的呼吸抑制劑有以下幾種。
魚藤酮(rotenone)系從植物中分離到的呼吸抑制劑，專一抑制NADH→CoQ的電子傳遞。
抗霉素A(actinomycin A)由霉菌中分離得到，專一抑制CoQ→Cyt c的電子傳遞。
CN、CO、NaN3和H2S均抑制細(xì)胞色素氧化酶。
(二)磷酸化抑制劑 這類抑制劑抑制ATP的合成，抑制了磷酸化也一定會抑制氧化。
寡霉素(oligomycin)可與F0的OSCP結(jié)合，阻塞氫離子通道，從而抑制ATP合成。
二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexyl carbodiimide,DCC)可與F0的DCC結(jié)合蛋白結(jié)合，阻斷H+通道，抑制ATP合成。櫟皮酮(quercetin)直接抑制參與ATP合成的ATP酶。
(三)解偶聯(lián)劑(uncoupler) 解偶聯(lián)劑使氧化和磷酸化脫偶聯(lián)，氧化仍可以進(jìn)行，而磷酸化不能進(jìn)行，解偶聯(lián)劑作用的本質(zhì)是增大線粒體內(nèi)膜對H+的通透性，消除H+的跨膜梯度，因而無ATP生成，解偶聯(lián)劑只影響氧化磷酸化而不干擾底物水平磷酸化，解偶聯(lián)劑的作用使氧化釋放出來的能量全部以熱的形式散發(fā)。動物棕色脂肪組織線粒體中有獨特的解偶聯(lián)蛋白，使氧化磷酸化處于解偶聯(lián)狀態(tài)，這對于維持動物的體溫十分重要。
常用的解偶聯(lián)劑有2，4-二硝基酚(dinitrophenol,DNP)，羰基-氰-對-三氟甲氧基苯肼(FCCP)，雙香豆素(dicoumarin)等，過量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶聯(lián)，從而使體溫升高。
過量的甲狀腺素也有解偶聯(lián)作用，甲狀腺素誘導(dǎo)細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶的合成，此酶催化ATP分解，釋放的能量將細(xì)胞內(nèi)的Na+泵到細(xì)胞外，而K+進(jìn)入細(xì)胞，Na+-K+-ATP酶的轉(zhuǎn)換率為100個分子ATP/秒，酶分子數(shù)增多，單位時間內(nèi)分解的ATP增多，生成的ADP又可促進(jìn)磷酸化過程。甲亢病人表現(xiàn)為多食、無力、喜冷怕熱，基礎(chǔ)代謝率(BMR)增高，因此也有人將甲狀腺素看作是調(diào)節(jié)氧化磷酸化的重要激素。
六、氧化磷酸化的調(diào)節(jié)
機(jī)體的氧化磷酸化主要受細(xì)胞對能量需求的調(diào)節(jié)
(一)ATP/ADP值對氧化磷酸化的直接影響 線粒體內(nèi)膜中有腺苷酸轉(zhuǎn)位酶，催化線粒體內(nèi)ATP與線粒體外ADP的交換，ATP分子解離后帶有4個負(fù)電荷，而ADP分子解離后帶有3個負(fù)電荷，由于線粒體內(nèi)膜內(nèi)外有跨膜電位(△ψ)，內(nèi)膜外側(cè)帶正電，內(nèi)膜內(nèi)側(cè)帶負(fù)電，所以ATP出線粒體的速度比進(jìn)線粒體速度快，而ADP進(jìn)線粒體速度比出線粒體速度快。Pi進(jìn)入線粒體也由磷酸轉(zhuǎn)位酶催化，磷酸轉(zhuǎn)位酶催化OH燦隤i交換，磷酸捕羧酸轉(zhuǎn)位酶催化Pi2-與二羧酸(如蘋果酸)交換。
當(dāng)線粒體中有充足的氧和底物供應(yīng)時，氧化磷酸化就會不斷進(jìn)行，直至ADP+Pi全部合成ATP，此時呼吸降到最低速度，若加入ADP，耗氧量會突然增高，這說明ADP控制著氧化磷酸化的速度，人們將ADP的這種作用稱為呼吸受體控制。
機(jī)體消耗能量增多時，ATP分解生成ADP，ATP出線粒體增多，ADP進(jìn)線粒體增多，線粒體內(nèi)ATP/ADP值降低，使氧化磷酸化速度加快，ADP+Pi接受能量生成ATP。機(jī)體消耗能量少時，線粒體內(nèi)ATP/ADP值增高，線粒體內(nèi)ADP濃度減低就會使氧化磷酸化速度減慢。
(二)ATP/ADP值的間接影響 ATP/ADP值增高時，使氧化磷酸化速度減慢，結(jié)果NADH氧化速度減慢，NADH濃度增高，從而抑制了丙酮酸脫氫酶系、異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶系和檸檬酸合成酶活性，使糖的氧化分解和TCA循環(huán)的速度減慢。
(三)ATP/ADP值對關(guān)鍵酶的直接影響 ATP/ADP值增高會抑制體內(nèi)的許多關(guān)鍵酶，如變構(gòu)抑制磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和異檸檬酸脫氫酶，還能抑制丙酮酸脫羧酶、α-酮戊二酸脫氫酶系，通過直接反饋作用抑制糖的分解和TCA循環(huán)。
七、高能磷酸化合物的儲存和利用
無論是底物水平磷酸化還是氧化磷酸化，釋放的能量除一部分以熱的形式散失于周圍環(huán)境中之外，其余部分多直接生成ATP，以高能磷酸鍵的形式存在。同時，ATP也是生命活動利用能量的主要直接供給形式。
(一)高能化合物
人體存在多種高能化合物，但這些高能化合物的能量并不相同。
體外實驗中，在pH7.0，25℃條件下，每克分子ATP水解生成ADP+Pi時釋放的能量為7.1千卡或30.4千焦耳，在體內(nèi)，pH7.4，37℃，ATP、ADP+Pi、Mg2+均處于細(xì)胞內(nèi)生理濃度的情況下，每克分子ATP水解生成ADP+Pi時釋放的能量為33.5-50千焦耳或8-12千卡。
ATP在能量代謝中之所以重要，就是因為ATP水解時的標(biāo)準(zhǔn)自由能變化位于多種物質(zhì)水解時標(biāo)準(zhǔn)自由能變化的中間，它能從具有更高能量的化合物接受高能磷酸鍵，如接受PEP、1，3－二磷酸甘油、磷酸肌酸分子中的～Pi生成ATP，ATP也能將～Pi轉(zhuǎn)移給水解時標(biāo)準(zhǔn)自由能變化較小的化合物，如轉(zhuǎn)移給葡萄糖生成G－6－P。
(二)ATP能量的轉(zhuǎn)移
ATP是細(xì)胞內(nèi)的主要磷酸載體，ATP作為細(xì)胞的主要供能物質(zhì)參與體內(nèi)的許多代謝反應(yīng)，還有一些反應(yīng)需要UTP或CTP作供能物質(zhì)，如UTP參與糖元合成和糖醛酸代謝，GTP參與糖異生和蛋白質(zhì)合成，CTP參與磷脂合成過程，核酸合成中需要ATP、CTP、UTP和GTP作原料合成RNA，或以dATP、dCTP、dGTP和dTTP作原料合成DNA。
作為供能物質(zhì)所需要的UTP、CTP和GTP可經(jīng)下述反應(yīng)再生：
UDP+ATP→UTP+ADP
GDP+ATP→GTP+ADP
CDP+ATP→CTP+ADP
dNTP由dNDP的生成過程也需要ATP供能：
dNDP+ATP→dNTP+ADP
(三)磷酸肌酸
ATP是細(xì)胞內(nèi)主要的磷酸載體或能量傳遞體，人體儲存能量的方式不是ATP而是磷酸肌酸。肌酸主要存在于肌肉組織中，骨骼肌中含量多于平滑肌，腦組織中含量也較多，肝、腎等其它組織中含量很少。
磷酸肌酸的生成反應(yīng)如下：
肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜和胞液中均有催化該反應(yīng)的肌酸激酶，它們是同工酶。線粒體內(nèi)膜的肌酸激酶主要催化正向反應(yīng)，生成的ADP可促進(jìn)氧化磷酸化，生成的磷酸肌酸逸出線粒體進(jìn)入胞液，磷酸肌酸所含的能量不能直接利用；胞液中的肌酸激酶主要催化逆向反應(yīng)，生成的ATP可補(bǔ)充肌肉收縮時的能量消耗，而肌酸又回到線粒體用于磷酸肌酸的合成。
磷酸肌酸的生成與利用
肌肉中磷酸肌酸的濃度為ATP濃度的5倍，可儲存肌肉幾分鐘收縮所急需的化學(xué)能，可見肌酸的分布與組織耗能有密切關(guān)系。
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