蔣永亮，湖南省人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)博士、碩導(dǎo)、主任醫(yī)師
肺部感染性疾病是較為常見(jiàn)的呼吸科疾病，肺部感染后常會(huì)導(dǎo)致肺間質(zhì)、肺泡以及肺部終末氣道出現(xiàn)炎癥，臨床常表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱以及寒戰(zhàn)等。然而隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，引起肺部感染的病原體也在不斷變化，致病因素復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣?？焖佟⑷?、準(zhǔn)確地鑒別病原體是臨床醫(yī)生及時(shí)、有針對(duì)性地采取治療措施的前提。傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)方法目標(biāo)單一、耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，很難滿(mǎn)足當(dāng)今感染性疾病診治的要求，二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)與快速發(fā)展將為肺部感染性疾病的診斷與治療提供更有力的技術(shù)支持。
1、二代測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介
1977年Frederick Sanger發(fā)明了轟動(dòng)一時(shí)的雙脫氧鏈終止法核酸測(cè)序技術(shù)，開(kāi)啟了基因測(cè)序的先河，sanger測(cè)序法則被稱(chēng)為第一代測(cè)序技術(shù)，因其測(cè)序準(zhǔn)確性高、讀長(zhǎng)較長(zhǎng)的特點(diǎn)在人類(lèi)基因組計(jì)劃及相關(guān)科研領(lǐng)域的研究中取得了重大成就，但同時(shí)它也存在測(cè)序反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、測(cè)序通量低、成本高的缺點(diǎn)。
因而在2005年基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)被報(bào)道，開(kāi)創(chuàng)了NGS（next-generation sequencing, NGS）的先河，它以高通量、低成本、短用時(shí)、高度自動(dòng)化著稱(chēng)[1]。NGS技術(shù)的核心思想是邊合成邊延伸邊測(cè)序, 通過(guò)捕捉合成鏈末端的信號(hào) (熒光信號(hào)或氫離子釋放所致的pH值變化) 來(lái)獲得DNA序列信息，在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)的序列信息。經(jīng)過(guò)不斷的技術(shù)開(kāi)發(fā)和改進(jìn)，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa，Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)成為第二代測(cè)序技術(shù)的主要標(biāo)記技術(shù)。
1.1 Roche 454技術(shù)
Roche 454測(cè)序系統(tǒng)是第一個(gè)商業(yè)化運(yùn)營(yíng)二代測(cè)序技術(shù)的平臺(tái)。其主要測(cè)序原理是：（1）DNA文庫(kù)制備 利用噴霧法將待測(cè)DNA打斷成300-800bp長(zhǎng)的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎y(cè)DNA變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)。（2）Emulsion PCR 454技術(shù)將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。其基本過(guò)程是在PCR反應(yīng)前，含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無(wú)數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴，即獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。小水滴里的磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的DNA序列，可與單鏈DNA序列特異結(jié)合。而孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，使得每個(gè)與磁珠結(jié)合的小片段都能獨(dú)立進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。當(dāng)反應(yīng)完成后，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來(lái)。進(jìn)過(guò)擴(kuò)增，每個(gè)小片段都將被擴(kuò)增約100萬(wàn)倍，從而達(dá)到下一步測(cè)序所要求的DNA量。（3）焦磷酸測(cè)序 測(cè)序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上來(lái)固定每個(gè)磁珠的位置，啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)。如果dNTP能與待測(cè)序列配對(duì)，則會(huì)在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測(cè)序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時(shí)由PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號(hào)處理而獲得最終的測(cè)序結(jié)果，根據(jù)熒光的顏色來(lái)判斷被測(cè)分子的序列。每個(gè)測(cè)序反應(yīng)都在PTP板上獨(dú)立的小孔中進(jìn)行，因而454技術(shù)干擾和測(cè)序偏差較小。454技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于其能獲得較長(zhǎng)的測(cè)序讀長(zhǎng)，而它最主要的一個(gè)缺點(diǎn)是無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度。
1.2 Solexa，Hiseq技術(shù)
Illumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代測(cè)序機(jī)器，這兩個(gè)系列的技術(shù)核心原理都是邊合成邊測(cè)序，主要過(guò)程分4步：（1）DNA待測(cè)文庫(kù)構(gòu)建 利用超聲波把待測(cè)的DNA樣本打斷成200-500bp長(zhǎng)的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫(kù)。（2）Flowcell Flowcell是用于吸附流動(dòng)DNA片段的槽道，文庫(kù)中的DNA在通過(guò)flowcell的時(shí)候會(huì)隨機(jī)附著在flowcell表面的channel上。1個(gè)Flowcell有8個(gè)channel，每個(gè)channel的表面上的每個(gè)接頭都能和建庫(kù)過(guò)程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對(duì)，并能支持DNA在其表面進(jìn)行橋式PCR的擴(kuò)增。（3）橋式PCR擴(kuò)增與變性 橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進(jìn)行橋形擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)不斷的擴(kuò)增和變性循環(huán)，最終每個(gè)DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個(gè)束都含有單個(gè)DNA模板的很多分拷貝。（4）測(cè)序 向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4種dNTP，在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫掉。再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號(hào)的記錄，最后利用計(jì)算機(jī)分析將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序堿基。再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并去除dNTP 3’-OH保護(hù)基團(tuán)。該技術(shù)每次只添加一個(gè)dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長(zhǎng)度的準(zhǔn)確測(cè)量問(wèn)題，它的主要測(cè)序錯(cuò)誤來(lái)源是堿基的替換，目前它的測(cè)序錯(cuò)誤率在1%-1.5%之間。
1.3 Solid測(cè)序技術(shù)
Solid測(cè)序技術(shù)是基于連接酶法，即利用DNA連接酶在連接過(guò)程之中測(cè)序。它的原理是：（1）DNA文庫(kù)構(gòu)建 將片段打斷并在片段兩端加上測(cè)序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)。（2）Emulsion PCR 與454的方法類(lèi)似，但Solid采用的小水滴僅1um，在擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的3’端進(jìn)行修飾，3’修飾的微珠在玻片上沉積。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。（3）連接酶測(cè)序 這一步是Solid測(cè)序的獨(dú)特之處。它采用的是連接酶。Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。探針的5’末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。這個(gè)8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類(lèi)的不同在6-8位上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨(dú)特測(cè)序法，兩個(gè)堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對(duì)而連接上時(shí)，就會(huì)發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號(hào)。在記錄下熒光信號(hào)后，通過(guò)化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進(jìn)行切割，這樣就能移除熒光信號(hào)，以便進(jìn)行下一個(gè)位置的測(cè)序。該技術(shù)的讀長(zhǎng)在2×50bp，后續(xù)序列拼接同樣比較復(fù)雜。由于雙次檢測(cè)，這一技術(shù)的原始測(cè)序準(zhǔn)確性高達(dá)99.94%，是目前第二代測(cè)序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的。
2、二代測(cè)序技術(shù)在肺部感染性疾病的應(yīng)用
2.1 NGS在肺部病原體感染檢測(cè)中的應(yīng)用
目前，基于培養(yǎng)的病原學(xué)診斷學(xué)方法仍然是診斷肺部感染性疾病病原學(xué)診斷的主要手段，主要依靠臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)結(jié)果，但是也很大程度上受培養(yǎng)條件和抗生素使用等影響，且培養(yǎng)陽(yáng)性率低，尤其是在有基礎(chǔ)疾病或免疫抑制狀態(tài)的人群中[2.3]。
對(duì)于肺部感染，二代測(cè)序技術(shù)可用于多種病原體的檢測(cè)，如細(xì)菌、真菌、病毒、支原體等病原體，也可用于多種呼吸系統(tǒng)標(biāo)本的檢測(cè)，如痰液、咽拭子、肺泡 灌洗液等標(biāo)本，并與傳統(tǒng)微生物技術(shù)相比表現(xiàn)出了良好的診斷性能。[4.5］
潘陽(yáng)等[6]選擇 2014～2016 年嚴(yán)重急性呼吸道感染病例，分離出A（H3N2）亞型流 感病毒毒株32株，提取病毒RNA，然后用二代測(cè)序儀進(jìn)行了病毒全基因組測(cè)序，并對(duì)毒株各個(gè)基因進(jìn)行了分子進(jìn)化分析和分子特征分析。LI Qian等[7]應(yīng)用采用靶向序列富集與二代測(cè)序相結(jié)合的方法 ( 即 Ampliseq 法)，建立了可同時(shí)檢測(cè)4種常見(jiàn)血流感染病原體的目標(biāo)片段特異性富集結(jié)合二代測(cè)序的方法，與傳統(tǒng)單重PCＲ方法相比，不僅減少了樣本核酸需求量，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，并具有較好的特異性及靈敏度，為血流感染病原體的快速準(zhǔn)確檢測(cè) 提供了新技術(shù)，為臨床快速用藥提供了科學(xué)依據(jù)。
對(duì)于有基礎(chǔ)疾病或免疫抑制狀態(tài)的人群，肺部感染的發(fā)生率可想而知比正常人群更高。Parize 等[8]的一項(xiàng)多中心前瞻性研究，對(duì)比了二代測(cè)序技術(shù)mNGS與傳統(tǒng)微生物方法學(xué) (血培養(yǎng)、血清學(xué)診斷，抗原抗體檢測(cè)，PCR等)在檢測(cè)疑似感染的免疫缺陷患者病原菌方面的可靠性。該研究結(jié)果顯示與常規(guī)微生物方法相比，二代測(cè)序mNGS技術(shù)較傳統(tǒng)培養(yǎng)法有較高的檢出率，且有更高的陰性預(yù)測(cè)值。二代測(cè)序?qū)Σ≡w的覆蓋面廣，可檢測(cè)涵蓋細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲(chóng)幾千種病原微生物，對(duì)標(biāo)本類(lèi)型覆蓋面廣，囊括了血液、肺泡灌洗液、腦脊液等多種標(biāo)本類(lèi)型。因此，非靶向的新一代測(cè)序?qū)τ诿庖呤軗p成人微生物診斷將有更大的獲益。繆青等[9]一項(xiàng)研究表明呼吸道病毒感染的患者多合并免疫損傷因素，無(wú)偏倚的微生物宏基因二代測(cè)序技術(shù)在敏感性及準(zhǔn)確性方面與傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)技術(shù)均具有可比 性 。ｍNGS理論上揭示了樣本中所有的微生物信息，可檢測(cè)出更多的病毒類(lèi)型，陽(yáng)性率更高。
可檢測(cè) 出的病毒包括熟知的上呼吸道病 毒，免疫抑制宿主的下呼吸道病毒如HSV及 CMV。在血液科，我們總是能看到許多在骨髓抑制期，因其免疫力較正常人明顯低下，而深受呼吸道病毒感染毒害的血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者。有研究表明，呼吸道病毒感染（RVI）是血液系統(tǒng)惡性腫瘤和造血干細(xì)胞移植（HSCT）的重要共病，其共病率高達(dá)30％[10]。Kothari A等[11]利用在骨髓瘤患者中發(fā)現(xiàn)的13例HPIV3感染病例，利用NGS技術(shù)，跟蹤呼吸道病毒感染爆發(fā)，明確區(qū)分了感染爆發(fā)期間獲得的分離株的相關(guān)性，并為傳播途徑提供證據(jù)，得出NGS作為一種流行病學(xué)工具，具有較高的價(jià)值，可用于收集實(shí)時(shí)信息和確定傳播聯(lián)系，以幫助免疫功能低下患者預(yù)防感染的結(jié)論。
隨著基于二代測(cè)序技術(shù)鑒定病原體的范圍越來(lái)越廣，發(fā)現(xiàn)病毒在呼吸道感染中的比例比以往想象得多，研究表明，在呼吸道標(biāo)本檢測(cè)到的病毒種類(lèi)中，約30.2％為常見(jiàn)的呼吸道病毒，14％為非呼吸道 病毒，55.8％為非人類(lèi)病毒[12]。
病毒性病原體的檢測(cè)主要包括病毒抗原檢測(cè)、核酸檢測(cè)以及病毒分離培養(yǎng)等，然而傳統(tǒng)的病毒病原體總存在其固有的缺陷，目前，應(yīng)用ｍＮＧＳ檢測(cè)病毒感染的優(yōu)勢(shì)性已得到國(guó)際諸多同行的肯定，應(yīng)用ｍＮＧＳ技術(shù)對(duì)院內(nèi)獲得性病毒性肺炎進(jìn)行實(shí)時(shí)快速的檢測(cè)，多項(xiàng)研究表明二代測(cè)序技術(shù)較傳統(tǒng)方法更快地獲知證據(jù)，從而及時(shí)采取措施控 制院內(nèi)感染的暴發(fā)［13.14］。朱小娟等[15]對(duì)1例不明原因肺炎患者進(jìn)行病原學(xué)診斷, 采集患者的咽拭子標(biāo)本,提取DNA，采用多種高通量 測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，最終得出結(jié)論，該患者的肺炎由腺病毒B組55型感染引起,該病毒由HAdV-11與HAdV-14重組產(chǎn)生。Stevenson JB 等用此技術(shù)建立同時(shí)檢測(cè)流感病毒A、流感病毒B和呼吸合胞病毒的方法，對(duì)30個(gè)陽(yáng)性樣本的檢出率達(dá)93%，另外兩個(gè)樣本因樣本量過(guò)少而未能檢出，此方法的建立和有效檢測(cè)豐富了多病原體同時(shí)檢測(cè)的方法[16]。在2015年Xie等[17]對(duì)中國(guó)首例引起中東呼吸綜合征的新型人冠狀病毒的研究也進(jìn)行了基因組測(cè)序，嘗試從基因的角度發(fā)現(xiàn)其致病機(jī)制，為中東呼吸綜合征的防治奠定了基礎(chǔ)。
真菌感染也是威脅人類(lèi)健康的一大疾病，尤其是肺部真菌感染，有致死性高、診治難度大的特點(diǎn)，這種種難題都提示著我們迫切需要一種新方法更準(zhǔn)確、快速地輔助臨床診療。長(zhǎng)期以來(lái)，培養(yǎng)在真菌感染的診斷中都占據(jù)著主導(dǎo)地位，但傳統(tǒng)方法存在其在鑒別混合感染以及分析菌群群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化中靈活度不夠的固有缺陷，很多真菌或者未被發(fā)現(xiàn)的新菌種，很難甚至無(wú)法被培養(yǎng)出來(lái)。［18］與細(xì)菌DNA提取方法不同，二代技術(shù)在真菌菌群結(jié)構(gòu)譜方法主要是通過(guò)對(duì)真菌 ITS1（internal transcribed spacer）和 ITS2 基因片段進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序、分析，利用ITS1/ITS2基因測(cè)序技術(shù)，一般可檢測(cè)到50~60個(gè)菌屬［19］，而且測(cè)序所得到的真菌 ITS 基因序列可以通過(guò)現(xiàn)有的基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹對(duì)，但其缺陷在于對(duì)于新物種，則無(wú)法準(zhǔn)確地確定種類(lèi)［20］，在 GeneBank 平臺(tái)上，還有許多真菌 ITS 測(cè)序序列被定義為“unidentified fungus”。但對(duì)于目前在臨床最常見(jiàn)的念珠菌屬以及曲霉菌屬，ITS 基因測(cè)序可以很好地識(shí)別它們的ITS基因序列，并且可在種水平區(qū)分出一些病原菌菌株［21］。近年來(lái)，少數(shù)研究利用二代測(cè)序技術(shù)，可檢測(cè)到更為豐富的真菌菌群。據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用454FLX 方法檢測(cè)到的真菌菌群，超過(guò)60%的種屬是培養(yǎng)技術(shù)無(wú)法檢測(cè)到［22］。即使目前各個(gè)研究結(jié)果有所差異， 但共同一致的是念珠菌屬豐度是最高的［22.23］。真菌可導(dǎo)致肺功能減退，影響疾病預(yù)后，而二代測(cè)序技術(shù)有助于從群落整體結(jié)構(gòu)了解氣道微生物的全貌以進(jìn)一步輔助疾病的診療。
結(jié)核分枝桿菌在肺部感染的病原體中也占據(jù)了重要位置，自1998年全球第１株結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv全基因組測(cè)序(WGS)工作完成［24 ］ ，在此后的近十年中僅有９ 株結(jié)核分枝桿菌全基因組數(shù)據(jù)上傳至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)。而二代測(cè)序技術(shù)的誕生使結(jié)核桿菌的病原體檢測(cè)、流行病學(xué)及分型都產(chǎn)生了飛躍的進(jìn)步。黃暢宇等通過(guò)利用NGS 技術(shù)檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液最終對(duì)2 例可疑肺結(jié)核病及肺非結(jié)核分枝桿菌病的肺部感染患者進(jìn)行了確診[25]。加拿大的學(xué)者Gardy J L對(duì)３４株結(jié)核病社區(qū)暴發(fā)分離株進(jìn)行流行病學(xué)研究［26］，全基因組序列分析發(fā)現(xiàn) ，VNTR分型相同的３４株仍可分為基因型不同的２個(gè)簇 ，存在不同的傳播源和傳播路徑 。借助二代測(cè)序技術(shù) ，Reyes等［27］建立了ＩS6110RFLP高通量分型 方法 ，可同時(shí)對(duì)幾百株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型 ，極大提高了分型效率。Ｗalker， Ｍedini 等的相關(guān)研究也得出了同樣的結(jié)論，在結(jié)核病流行病學(xué)研究領(lǐng)域，全基因組技術(shù)較先前的基因分型方法有優(yōu)勢(shì)[28.29]。
全基因組測(cè)序可確定傳播鏈中各菌株間的變異 和傳播源 ，且該方法目前已在多項(xiàng)結(jié)核病流行病學(xué)研究中使用[30.31]，并充分顯示出其優(yōu)勢(shì)所在 。曾經(jīng)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體（MTBC）中的遺傳多樣性程度一度引起了該領(lǐng)域激烈的爭(zhēng)論，直到全基因組測(cè)序（WGS）應(yīng)用于該領(lǐng)域，對(duì)MTBC菌株進(jìn)行更新和更可靠的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)菌株之間存在更多的遺傳多樣性，遺傳距離有時(shí)與種間相當(dāng)Mtb和M. bovis之間的距離[32.33]。
2.2 NGS在肺部不明病原體的溯源與監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用
對(duì)于呼吸科醫(yī)生來(lái)說(shuō)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%的感染性疾病患者因傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法確定病原體信息，不能得到及時(shí)有效地救治，從而使病情惡化。因此，快速、準(zhǔn)確的病原體檢測(cè)方法，對(duì)有效診斷和及時(shí)控制感染性疾病具有重要的意義 [34]?？偹苤?，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的熒光定量PCＲ技術(shù)對(duì)疑似病毒進(jìn)行篩查和確認(rèn)都必須建立在已知病原體基因序列基礎(chǔ)上，而對(duì)于未知的病毒病原體則無(wú)法鑒定。而二代測(cè)序技術(shù)不僅可以發(fā)現(xiàn)己知病原體，而且可以發(fā)現(xiàn)完全未知的病原體，現(xiàn)代分子分型技術(shù)類(lèi)型多種多樣，而其中在感染性疾病溯源和監(jiān)測(cè)中最常用的分子技術(shù)有多位點(diǎn)序列分型（MLST）、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE） 和多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA）等，而新興起的高分辨力的 WGS 技術(shù)為感染性疾病的準(zhǔn)確溯源和監(jiān)測(cè)提供了保障，還可以多項(xiàng)分子技術(shù)的聯(lián)合使用進(jìn)行優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。其中“PFGE”被譽(yù)為病原體分子分型的金標(biāo)準(zhǔn)[35]。而使用 ＷＧＳ技術(shù)可以追蹤 病原體的流行情況以及更加準(zhǔn)確地確定病原體可能的來(lái)源［36］。從而有效地控制病原體的散播和流行。且隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，目前對(duì)于不明病原體的溯源與監(jiān)測(cè)能力越來(lái)越突出。
對(duì)病原體進(jìn)行監(jiān)測(cè)或鑒定主要是為了防范病原體的傳播和指導(dǎo)臨床診療。2010年英國(guó)一家醫(yī)院在爆發(fā)鮑曼不動(dòng)桿菌后， Lewis T等[37]利用全基因組測(cè)序鑒定出分離株中的單核苷酸多態(tài)性，這是該技術(shù)在醫(yī)院獲得性感染中消除流行病學(xué)關(guān)聯(lián)最早的應(yīng)用，隨后，WGS在醫(yī)院暴發(fā)的檢測(cè)與溯源方面的應(yīng)用越來(lái)越多起來(lái)， Harris SR [38] 等利用高通量基因組學(xué)方法，提供了甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）的顯性菌株的流行病學(xué)和微進(jìn)化的高分辨率視圖，ST239 在40年間的全球分布和種系發(fā)生，以及其在醫(yī)院環(huán)境中人與人之間傳播的潛力。該結(jié)果對(duì)感染控制具有重要意義，并為針對(duì)MRSA傳播的干預(yù)產(chǎn)生了寶貴的信息。2011年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院臨床中心爆發(fā)了碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌，Snitkin ES[39]等綜合基因組測(cè)序技術(shù)和流行病學(xué)分析了肺炎克雷伯氏菌分離株，將爆發(fā)追蹤至單個(gè)患者的三次獨(dú)立傳播，通過(guò)對(duì)基因組數(shù)據(jù)與流行病學(xué)數(shù)據(jù)的分析， 追溯到了疫情發(fā)生的原因、闡明了傳播途徑，最終實(shí)施了早期的感染控制，控制了院內(nèi)傳播。沙特阿拉伯 Saeb 等［40］通過(guò)NGS技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育和病原學(xué)分析報(bào)道了首例人感染溶血梭菌 ( Clostridium haemolyticum) 。他們證實(shí)了NGS 在臨床微生物病原體鑒定的應(yīng)用，也證實(shí)了NGS技術(shù)對(duì)于更多微生物樣本的分析在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中共享的重要性。
我國(guó)研究人員在2009年的這次新型H1N1流感爆發(fā)中，證實(shí)了二代測(cè)序平臺(tái)用于未知病毒檢測(cè)的重要作用，在事先沒(méi)有知識(shí)或使用遺傳信息的情況下在每個(gè)樣本中產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)個(gè)有效讀數(shù)并產(chǎn)生了幾乎完整的核苷酸信息，確診了流感暴發(fā)的病原為新型H1N1和季節(jié)性H3N2流感病毒[41]， 2012年荷蘭研究人員利用二代測(cè)序技術(shù)454GS-FLX平臺(tái)，在1例沙特急性肺炎轉(zhuǎn)腎衰的死亡病例痰液中發(fā)現(xiàn)一種全新的中東呼吸綜合征冠狀病毒，［42］這些數(shù)據(jù)都表明了二代測(cè)序可以是診斷新發(fā)傳染病的有用工具，對(duì)于不明病原體有著很好的鑒定與溯源作用。越來(lái)越多的研究證實(shí)WGS有可能從分離物中快速提供大量信息，包括物種，菌株類(lèi)型，抗生素抗性，毒力以及其他爆發(fā)和病例管理信息。對(duì)病原體的溯源與監(jiān)測(cè)方面表現(xiàn)出了較為明顯的優(yōu)越性。但目前對(duì)于個(gè)體患者的診斷和治療方面，考慮到成本問(wèn)題，其應(yīng)用還不太廣泛。而K?ser等人[43]、Young等人[44]、Sherry等人[45]、Walker等人[46]的相關(guān)研究對(duì)于NGS技術(shù)在監(jiān)測(cè)病原體爆發(fā)方面，也得出了與上述相似的結(jié)論。
重癥下呼吸道感染病原體通常不明確，當(dāng)前臨床主要采用抗原/抗體免疫學(xué)方法、傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)等技術(shù)進(jìn)行診斷，但這些方法多存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、培養(yǎng)陽(yáng)性率低的問(wèn)題。二代測(cè)序技術(shù)是新型DNA／RNA測(cè)序方法，該技術(shù)基于對(duì)核酸分子的檢測(cè)，敏感性高， 耗時(shí)短，不依賴(lài)于傳統(tǒng)的病原學(xué)培養(yǎng)，前期抗生素應(yīng)用對(duì)檢測(cè) 影響小。在重癥患者中，肺炎的發(fā)展導(dǎo)致顯著的發(fā)病率和死亡率以及額外的醫(yī)療保健費(fèi)用。準(zhǔn)確，快速地鑒定肺部感染患者的微生物病原體可能會(huì)導(dǎo)致有針對(duì)性的抗菌治療，可能產(chǎn)生的副作用更少，成本更低。Toma I等[47]利用NGS技術(shù)，在來(lái)自疑似肺炎的插管患者的支氣管抽吸物進(jìn)行測(cè)定，從與主要培養(yǎng)的病原體相同的屬中鑒定出顯著多樣的細(xì)菌物種，很好的詮釋了NGS可識(shí)別的細(xì)菌屬的數(shù)量始終高于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)微生物方法鑒定的數(shù)量。Thorburn F等[48]在一項(xiàng)研究中利用89個(gè)呼吸道樣本，將內(nèi)部NGS方法與已建立的內(nèi)部RT-PCR測(cè)試進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示與RT-PCR相比，NGS的敏感性和特異性均低于RT-PCR測(cè)試，但NGS為檢測(cè)到的病毒提供了更詳細(xì)的類(lèi)型信息，包括相關(guān)病毒的亞型數(shù)據(jù)以及血清型數(shù)據(jù)。還有一些研究指出[49.50]，NGS不僅能夠產(chǎn)生實(shí)時(shí)診斷數(shù)據(jù)，還可以提供抗性測(cè)試和分型數(shù)據(jù)，這也可用于快速檢測(cè)新型亞型的出現(xiàn)或突出潛在的爆發(fā)。其中Petty T.J. [49]設(shè)計(jì)的生物信息學(xué)管道（ezVIR）可用于用于處理來(lái)自任何標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)的HTS數(shù)據(jù)，并同時(shí)評(píng)估已知人類(lèi)病毒的整個(gè)范圍，提供易于解釋和定制的結(jié)果，該管道旨在使用包含11,000多個(gè)完整病毒基因組的全面手動(dòng)策劃數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)識(shí)別病毒，而且，它自動(dòng)為HTS中的非專(zhuān)業(yè)人員生成清晰簡(jiǎn)明（可自定義）的結(jié)果表示。隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，將進(jìn)一步減少處理和測(cè)序時(shí)間，NGS的測(cè)序方法最終將能夠?yàn)榕R床醫(yī)生提供快速，精確，獨(dú)立于培養(yǎng)的細(xì)菌，真菌和病毒病原體鑒定及其抗菌敏感性特征。
白色念珠菌作為一種機(jī)會(huì)性真菌病原體，在機(jī)體免疫低下時(shí)時(shí)常會(huì)引發(fā)感染，除了可導(dǎo)致淺表感染外，它也可以在肺深部感染，腸道或甚至血液。Ｗｕ 等［51］從復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 40位白假絲酵母菌感染的患者中分離出62株白假絲酵母 菌，通過(guò)MLST技術(shù)分析，結(jié)合住院史，指出該醫(yī)院患者感染白假絲酵母菌可能是由于白假絲酵母菌的院內(nèi)傳 播，他們證實(shí)了MLST是研究白色念珠菌流行病學(xué)和進(jìn)化的有用工具。新型隱球菌病是一種常見(jiàn)伺機(jī)性霉菌感染癥，對(duì)于免疫低下人群?？芍虏。律[球菌幾乎全部經(jīng)肺入侵而感染人體，90%病損僅局限于肺部，而還有10%可經(jīng)血行傳播擴(kuò)散至其他器官。
Firacative等[52]對(duì)122株加特隱球菌Ⅲ型進(jìn)行ＭＬＳＴ分型，并對(duì)其中的６０株進(jìn)行全基因組ＳＮＰ分析，將該病原菌 劃分成Ｂ和Ｃ兩種主要的血清型，二者不僅群體的起源地不同，且發(fā)現(xiàn)主要是毒性更強(qiáng)的血清型B分離株可致肺隱球菌病，Ｃ型加特隱球菌對(duì)唑類(lèi)抗生素的敏感性要低于Ｂ型加特隱球菌。也證實(shí)了菌株分型對(duì)于指導(dǎo)有效治療以改善疾病結(jié)果的重要性。2011年，在一起耐碳青霉烯類(lèi)抗生素肺炎克雷伯菌感染流行事件中，Snitkin等[53] 對(duì)患者身上分離到 的肺炎克雷伯菌進(jìn)行進(jìn)行全基因組測(cè)序，綜合基因組學(xué)和流行病學(xué)分析將爆發(fā)追蹤至單個(gè)患者的三次獨(dú)立傳播，最后發(fā)現(xiàn)這些菌株是醫(yī)院常見(jiàn)的 ST258 型耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌，并確定了主要傳播者，推斷出了可能的傳播途徑，而且他們的研究表明，基因組和流行病學(xué)數(shù)據(jù)的整合可以產(chǎn)生可操作的見(jiàn)解，有助于控制醫(yī)院內(nèi)傳播。
多項(xiàng)分子分型技術(shù)聯(lián)合使用可以增強(qiáng)對(duì)菌株的分辨力，提高分析的準(zhǔn)確性。2012年我國(guó)有研究者將脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）和多位點(diǎn)序列分型（MLST）聯(lián)合，對(duì)我國(guó)南部7個(gè)地區(qū)19家醫(yī)院感染鮑曼不動(dòng)桿菌的患者的樣本進(jìn)行病原體監(jiān)測(cè)，鑒定出146種多重耐藥菌株（對(duì)超過(guò)7種藥物具有抗性），利用PFGE將其劃分為了15簇， 發(fā)現(xiàn)不同型別菌株的分布具有地區(qū)傾向性，又用MLST技術(shù)對(duì)主要細(xì)菌主要簇群進(jìn)行分析，并分出11個(gè)ST型，其中ST208是普遍的，而CC92 簇的ST型鮑曼不動(dòng)桿菌有更廣的 耐藥譜，研究結(jié)果還表明，華南地區(qū)的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌與其他國(guó)家的其他廣泛菌株有著共同的起源[54]。在加拿大不列顛哥倫比亞省的一個(gè)中型社區(qū)，3年期間爆發(fā)了結(jié)核病。Gardy JL 等[55]使用全基因組測(cè)序和社會(huì)網(wǎng)絡(luò)分析對(duì)32個(gè)結(jié)核分枝桿菌爆發(fā)分離株和4個(gè)歷史分離株的完整基因組進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果顯示結(jié)核分枝桿菌的兩個(gè)遺傳上不同的譜系具有相同的MIRU-VNTR基因型，表明兩個(gè)伴隨的爆發(fā)，并發(fā)現(xiàn)社會(huì)環(huán)境因素 - 最有可能可卡因的使用增加 - 引發(fā)了兩個(gè)現(xiàn)存的M系譜的同時(shí)擴(kuò)張。由高風(fēng)險(xiǎn)社交網(wǎng)絡(luò)的主要成員維持的結(jié)核病。僅基因分型和接觸者追蹤并未捕捉到爆發(fā)的真實(shí)動(dòng)態(tài)。
2.3 NGS對(duì)肺部病原體耐藥及毒力特征檢測(cè)中的應(yīng)用
對(duì)于肺部的感染性疾病，尤其是對(duì)于下呼吸道特殊病原體、未知病原體的感染，快速的了解病原體毒力概況對(duì)于預(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度和轉(zhuǎn)歸，以及在疾病早期進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估至關(guān)重要，快速的了解病原體的耐藥性對(duì)于指導(dǎo)抗菌藥物應(yīng)用，提升治療效果更是具有重要價(jià)值。以血清學(xué)培養(yǎng)為主要代表的傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，均有其相關(guān)的局限性[ 56.57]，例如血清培養(yǎng)學(xué)一方面需取決于微生物生長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)，通常需要長(zhǎng)達(dá)5天，另一方面培養(yǎng)結(jié)果常常由于經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。二代測(cè)序技術(shù)作為新型的DNA／RNA測(cè)序方法，隨著這項(xiàng)技術(shù)的不斷發(fā)展與研究，其不僅能夠同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)等各類(lèi)病原體， 特異性高，同時(shí)還可以檢出毒力基因、耐藥基因的信息，且與傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相比，前期使用抗生素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較小。
病原體耐藥檢測(cè)：耐藥性微生物病原體的不斷出現(xiàn)是一個(gè)具有全球重要性的問(wèn)題。雖然正在開(kāi)發(fā)新藥，但是它們的廣泛使用很快就會(huì)選擇進(jìn)一步的抗藥性，對(duì)于肺部感染病人，我們常常會(huì)遇到由于不充分或長(zhǎng)期使用廣譜抗生素而產(chǎn)生耐藥性的患者，這時(shí)候則需要對(duì)于抗生素相關(guān)毒性和多藥抗性病原體的鑒定，最新有指南建議在診斷膿毒癥后盡早（最好在1小時(shí)內(nèi)）開(kāi)始經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療[58]，那么在這一階段，對(duì)于致病病原體的鑒定及抗生素抗性和毒力基因的分析對(duì)于早期優(yōu)化抗微生物治療方案是至關(guān)重要的。Grumaz 等[59]的研究驗(yàn)證了二代測(cè)序檢測(cè)耐藥基因的可行性，而在最新NGS技術(shù)（即Oxford Nanopore的MinION裝置）表明，已可以在更短的時(shí)間內(nèi)對(duì)更大量的DNA進(jìn)行測(cè)序，且已被證實(shí)使用該技術(shù)鑒定臨床相關(guān)菌株和相應(yīng)的抗性譜可在約2小時(shí)內(nèi)完成，抗性基因的鑒定也可在2至12小時(shí)內(nèi)可以控制，這大大縮短診療時(shí)間[60]。
在肺部感染的眾多病原體中，病毒感染占據(jù)了重要位置，由于病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，易發(fā)生突變， 其基因組一旦發(fā)生任何變化均會(huì)影響后代的特性表 現(xiàn)。在抗病毒藥物治療時(shí)，病毒基因的異質(zhì)性使其 在藥物治療過(guò)程中常出現(xiàn)耐藥相關(guān)基因的突變，從而影響抗病毒治療效果。VERWEIJ P E等的研究發(fā)現(xiàn)使用廣譜抗生素影響真菌與細(xì)菌之間微生態(tài)平衡，導(dǎo) 致呼吸道真菌感染的發(fā)生以及病原體對(duì)抗真菌藥產(chǎn)生耐藥［61］。微生物監(jiān)測(cè)已被認(rèn)為是抗藥性控制的基本組成部分，因?yàn)楸O(jiān)測(cè)信息可以評(píng)估抗藥性負(fù)擔(dān)，確定風(fēng)險(xiǎn)因素，并確定抗性表型和基因型的趨勢(shì)。隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，有多項(xiàng)試驗(yàn)都證實(shí)了NGS能檢出 0.１％ ～１％水平的病毒耐藥突變，且應(yīng)用NGS技術(shù)可進(jìn)行耐藥病毒株的傳播、低豐度耐藥突變與臨床用藥關(guān)系、抗病毒藥物 潛在作用靶點(diǎn)的探索、抗病毒治療后患者耐藥位點(diǎn) 突變的檢測(cè)和探尋新耐藥突變位點(diǎn)等方面的研 究［62.63.64］ 。如巨細(xì)胞病毒（CMV）的抗病毒治療可能因與磷酸轉(zhuǎn)移酶UL97和DNA聚合酶UL54突變相關(guān)的耐藥性而變得復(fù)雜。Sahoo M K 等[65]利用二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種基于擴(kuò)增子的高通量測(cè)序策略，用于檢測(cè)臨床血漿樣本中的CMV藥物抗性突變，該測(cè)定提供了對(duì)較小變體的更靈敏的檢測(cè)和更高的多重能力。
耐多藥的醫(yī)院病原體是醫(yī)院的主要負(fù)擔(dān)?？焖倬垲?lèi)鑒定和病原體分析，即抗生素抗性和毒力基因，對(duì)于有效的感染控制至關(guān)重要。特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）現(xiàn)在是醫(yī)院感染的主要原因之一。Leopold 等[66]利用WGS與等位基因分析相結(jié)合的方法，篩選出了1681個(gè)基因建立 cgMLST分型方法，對(duì)德國(guó)明斯特大學(xué)醫(yī)院兩間ICU病房的t001型 MRSA 進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，WGS結(jié)果產(chǎn)生了高分辨力的等位基因譜，通過(guò)分析該等位基因譜將18株MRSA菌株分為兩簇，并使用標(biāo)準(zhǔn)化的基因組提取基于等位基因的分型以及抗生素抗性和毒素基因譜，抗生素抗性譜與原始臨床實(shí)驗(yàn)室易感性譜一致，而毒素譜還提供了一些以前未知的信息。Holden MT等[67]使用比較基因組分析確定了99.8％的MRSA分離株抗菌素耐藥性表型的分子遺傳基礎(chǔ)，突出了病原體基因組測(cè)序作為診斷工具的潛力，證明當(dāng)前大流行的EMRSA-15群體來(lái)自于20世紀(jì)80年代在整個(gè)英格蘭傳播的與衛(wèi)生保健相關(guān)的MRSA流行病，證實(shí)了全基因組測(cè)序不僅可以為分子流行病學(xué)提供高度辨別力，而且可以為抗生素抗性提供預(yù)測(cè)。
另外，由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)速度極慢，通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)和表型方法進(jìn)行耐藥譜檢測(cè)至少要花費(fèi)幾個(gè)星期，所以結(jié)核分枝桿菌耐藥性的研究一直是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)[68]。多重耐藥結(jié)核病（MDR-TB）的出現(xiàn)和傳播一直是控制結(jié)核病的嚴(yán)重威脅，且這種情況因更嚴(yán)重的廣泛耐藥性結(jié)核?。╔DR-TB）的出現(xiàn)而得到加強(qiáng)。MDR-TB菌株已對(duì)所有氟喹諾酮類(lèi)藥物（FQ;特別是氧氟沙星，左氧氟沙星，莫西沙星和加替沙星）和所有二線(xiàn)注射藥物（阿米卡星，卷曲霉素和卡那霉素）產(chǎn)生耐藥性。在2014年，世界衛(wèi)生組織（WHO）建議將認(rèn)可的快速分子技術(shù)（Xpert MTB / RIF，線(xiàn)性探針檢測(cè)）納入監(jiān)測(cè)系統(tǒng)和調(diào)查，以便在國(guó)家層面測(cè)試更多結(jié)核病（TB）患者的耐藥性。Cabibbe A M等[69]認(rèn)為全基因組測(cè)序（WGS）方法正在成為流行病學(xué)和耐藥性常規(guī)監(jiān)測(cè)的更強(qiáng)大工具，有望快速同時(shí)篩查所有臨床相關(guān)突變，以確定對(duì)第一，第二線(xiàn)的抗性和新的抗結(jié)核藥物。WGS技術(shù)對(duì)病原體的高跟蹤力、高辨別力使得其戰(zhàn)勝傳統(tǒng)分子工具，以標(biāo)準(zhǔn)化方式提供深入和廣泛的信息。經(jīng)典測(cè)序和NGS方法已成功應(yīng)用于最近在結(jié)核病和耐多藥結(jié)核病（MDR-TB）負(fù)擔(dān)高的五個(gè)國(guó)家進(jìn)行的研究。使用DNA測(cè)序鑒定pncA基因及其啟動(dòng)子區(qū)域（pncA區(qū)域）中的突變以確定對(duì)PZA的基因型抗性，旨在通過(guò)pncA測(cè)序研究結(jié)核病患者對(duì)吡嗪酰胺的耐藥水平[70]。這項(xiàng)工作創(chuàng)新地證明了在國(guó)家（外圍和參考實(shí)驗(yàn)室）和超國(guó)家實(shí)驗(yàn)室之間建立了強(qiáng)有力的聯(lián)系，前者可能處理間接或直接樣本并生成測(cè)序數(shù)據(jù)，后者支持它們進(jìn)行生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)解釋?zhuān)?2013年的一項(xiàng)回顧性研究，研究者在分枝桿菌生長(zhǎng)指示試管（ＭＧＩＴ）培養(yǎng)患者痰液，3天后直接從培養(yǎng)物中提取DNA，并使用Illumina Miseq 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果鑒定出患者混合感染了２種不同的結(jié)核多藥耐藥菌株，并通過(guò)耐藥基因的變異情況預(yù)測(cè)了其耐藥譜，這項(xiàng)研究揭示了快速全基因組測(cè)序的潛力，且大大減少了診斷XDR結(jié)核病的時(shí)間[71]。Farhat MR等[72]使用116個(gè)新測(cè)序的和7個(gè)先前測(cè)序的結(jié)核分枝桿菌全基因組，我們鑒定了對(duì)47 種耐藥菌株特異性的陽(yáng)性 選擇的全基因組特征，恢復(fù)了100％的已知抗性標(biāo)記，對(duì)一種基因ponA1突變的功能性遺傳分析證明了在藥物利福平存在下的體外生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。
病原體毒力檢測(cè)：
微生物毒力是一種復(fù)雜的、多因素的表型，與病原體的進(jìn)化軌跡錯(cuò)綜復(fù)雜地聯(lián)系在一起，是許多細(xì)菌病原體的主要毒力因子，影響任何感染嚴(yán)重性的關(guān)鍵因素就是感染生物的毒力潛力，許多病原菌中的毒力島一般指染色體上一段編碼細(xì)菌毒力 的DNA片段，兩側(cè)常有重復(fù)序列和插入元件，其DNA片段 的G+C 百分比、密碼使用與宿主菌染色體具有明顯差異。目前有相關(guān)研究表明，二代測(cè)序技術(shù)可以直接從其基因組序列確定毒力表型從而預(yù)測(cè)毒力，如Laabei M等利用全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）和機(jī)器學(xué)習(xí)方法確定了從90株MRSA分離株的基因組序列中預(yù)測(cè)毒力的可行性，證實(shí)了使用全基因組序列數(shù)據(jù)分析大量菌株以鑒定與特定性狀相關(guān)的遺傳特征可用于從基因型推斷復(fù)雜表型[73]。
21世紀(jì)以來(lái)，隨著抗生素在臨床上越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，感染性疾病的診治也變得越來(lái)越困難，而呼吸系統(tǒng)是我們的“門(mén)戶(hù)”，所以在肺部感染的表現(xiàn)則更為突出，主要表現(xiàn)為疑難病原體感染率增加，重癥感染發(fā)生率高，細(xì)菌毒力增加，耐藥率也明顯增加，逐漸出現(xiàn)多重耐藥甚至廣泛耐藥的病原體，這不僅大大加大了醫(yī)生對(duì)感染性疾病的診治難度，而且大大延長(zhǎng)了患者患病時(shí)間，增加了感染死亡率。而對(duì)于肺部感染更是如此。
二代測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，使得同時(shí)測(cè)定幾百萬(wàn)甚至上億條DNA或RNA序列的愿望成為了現(xiàn)實(shí)，并在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏基因組學(xué)研究等方面也取得了大量研究成果，并逐步深入到微生物學(xué)研究領(lǐng)域中。且經(jīng)過(guò)二十余年的發(fā)展，目前NGS測(cè)序主要障礙成本問(wèn)題已經(jīng)逐步在得到解決，NGS的成本較前已經(jīng)明顯降低［74.75.76］。而NGS技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)于肺部不明、疑難病原體，我們可以不依賴(lài)于培養(yǎng)結(jié)果，直接從樣本中獲得病原體的核酸序列信息；對(duì)于新爆發(fā)的或以呼吸道傳播為主的流行性疾病，我們可以對(duì)其進(jìn)行病原體的溯源與監(jiān)測(cè)；對(duì)于肺部泛耐結(jié)核、MASA等耐藥病原體，我們可以使用全基因組序列數(shù)據(jù)分析大量菌株以鑒定其病原體毒力并預(yù)測(cè)了其耐藥譜，與Sanger 測(cè)序相比, NGS 不需要靶特異性引 物, 其優(yōu)勢(shì)在于單次運(yùn)行即可用于所有病原體的鑒定和分型。NGS技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)提供無(wú)與倫比的高分辨率基因分型，因此, 該技術(shù)可在醫(yī)學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室和流行病學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮巨大作用。
參考文獻(xiàn)：略
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