導(dǎo)語
轉(zhuǎn)錄的定向調(diào)節(jié)對理解復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)有著重要的意義，并且在醫(yī)學(xué)和工業(yè)應(yīng)用上也有著巨大的潛力。在目標(biāo)基因組激活和抑制的領(lǐng)域里，CRISPR是一種新興的實驗技術(shù)，同時它也能參與基因的編輯。以下為大家介紹在哺乳動物細胞中，如何設(shè)計、構(gòu)建和驗證向?qū)?span>RNA（sgRNA，single guide RNAs）對特定的轉(zhuǎn)錄序列進行抑制或者激活。
在 CRISPR 技術(shù)中，去活性的核酸酶 Cas9 蛋白（dCas9）被釋放出來，為RNA導(dǎo)向基因組任何位置的目標(biāo)DNA提供了一個平臺。而不同種sgRNA能激活或抑制不同的基因。并且使用scRNAs（scaffold RNAs）能夠讓不同的效應(yīng)蛋白招募到不同的基因序列中，從而激活一部分基因，抑制另一些基因。CRISPRi和CRISPRa的方法為基因表達的特異性調(diào)節(jié)提供了有效的工具，使人們能夠更好地了解基因的功能。[1]
一、名詞解釋
CRISPR：規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)（Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats），這是一類廣泛分布于細菌和古菌基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)。
CRISPRi：（sequence-specific repression）基因特異性干擾
CRISPRa：（sequence-specificactivation）基因特異性激活
dCas9：（deactivated Cas9）去活性的Cas9蛋白。
sgRNA：（single guide RNA）向?qū)NA。
二、實驗材料
1.試劑：
a. CRISPR activation (CRISPRa) dCas9–SunTag表達載體：
b. CRISPR interference (CRISPRi) dCas9–KRAB表達載體：
sgRNA表達載體：
慢病毒包裝載體pCMV-dR8.2和pMD2.G ：
注：詳細載體信息可登陸http://www.addgene.org/查詢。
大腸桿菌感受態(tài)細胞
dNTPs(10mM)
ddH2O
高糖的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基
胎牛血清（FBS）
HEK293T細胞
瓊脂糖
DNA maker
溴化乙錠或goldview
TAE buffer
DNA連接試劑盒
熒光定量試劑盒
反轉(zhuǎn)錄試劑盒
慢病毒包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.91和pMD2.G
含有羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基（液體和固體平板）
轉(zhuǎn)染試劑盒
雙抗（Penicillin-Streptomycin (100×)
高保真酶
質(zhì)粒提取試劑盒（去內(nèi)毒素）
膠回收試劑盒
PCR產(chǎn)物純化試劑盒
限制性內(nèi)切酶BstXI，XhoI和DpnI
Trypsin-EDTA（0.05%）
2.引物：
sgRNA-F: 5′-CCCTTGGAGAACCACCTTGTTGGN(19)GTTTAA5′-GATCCTAGTACTCGAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3′
（注：sgRNA-F引物序列包含了sgRNA對應(yīng)的靶點序列）
測序引物: 5′-GAGGCTTAATGTGCGATAAAAGA-3′
3.設(shè)備：
流式細胞儀
熒光定量PCR儀
CO2培養(yǎng)箱
凝膠成像系統(tǒng)
細菌培養(yǎng)箱
核酸定量儀
PCR儀
三、實驗步驟
1、確實目標(biāo)基因的DNA序列（可以使用基因組數(shù)據(jù)庫，如UCSC genome browser（http://genome.ucsc.edu/））。[2]
2、獲取目標(biāo)基因的注釋信息，包括轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）的位置。
3、在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）附近找GN(19)NGG樣式的序列，GN(19)樣式的序列是sgRNA的結(jié)合位點，NGG是Cas9蛋白結(jié)合DNA的一個基序，稱為PAM（protospacer adjacent motif）。
備注：1.本步驟中的sgRNA的表達構(gòu)建用的是老鼠的U6啟動子，需要在5’末端加一個G，這樣能夠有效的轉(zhuǎn)錄。同時，找到目的基因的GN（19）基序作為sgRNA的結(jié)合位點。如果用的是其他的啟動子，很有可能5’末端的第一個核苷酸會不一樣。
2.推薦的CRISPR干擾（CRISPRi）區(qū)域范圍是在目的基因的轉(zhuǎn)錄起始位點的?50 - 300 bp左右。CRISPR激活（CRISPRa）則是在（?400）-（?50）bp，通常sgRNA的最適結(jié)合位點需要通過實驗摸索。
3.很多的哺乳動物的基因擁有多個不同轉(zhuǎn)錄起始位點的轉(zhuǎn)錄本亞型，因此，需要設(shè)計不同的sgRNAs來對應(yīng)不同的轉(zhuǎn)錄本。目前，還沒有直接的證據(jù)證明CRISPRi和CRISPRa的活性與DNA鏈或者GC含量有關(guān)。
4、設(shè)計sgRNA序列時，保證sgRNA的堿基對序列與目的DNA上的GN(19)序列（步驟3中確定）是反向互補的。
6、將GN(19)序列的3’端加到最佳的sgRNA序列上，從而產(chǎn)生完整長度的sgRNA。如下：5′-GN(19)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCATAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3′。[4]
7、確定GN(19)序列中不含有U6啟動子的任何的轉(zhuǎn)錄終止序列。[5]
8、用限制性內(nèi)切酶BstXl和XhoI來酶切空的sgRNA表達載體， 37°C，4-16h（根據(jù)不同的酶的相關(guān)說明書）。
9、將酶切后的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，緩沖液是1×TAE buffer，用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，確定載體的條帶是在8kb左右。
10、使用膠回收試劑盒來回收酶切后的質(zhì)粒，將回收的質(zhì)粒DNA保存在?20°C以便后面的步驟中使用。
11、進行PCR擴增實驗，用含有20-nt目標(biāo)基因序列的引物（步驟3中確定的）。以下為PCR反應(yīng)體系：
| 反應(yīng)物 | 體積 | |
| 沒有酶切的空sgRNA表達載體（100 ng/μL） | 0.5 μL | |
| 上游引物（sgRNA-F）（10 μM） | 2.5 μL | |
| 下游引物（sgRNA-R）（10 μM） | 2.5 μL | |
| dNTPs (10 mM) | 2 μL | |
| 高保真酶（2 U/μL） | 0.5 μL | |
| 酶緩存液（5×） | 10 μL | |
| ddH2O | 32 μL | |
| 總體積 | 50 μL | |
| 1 cycle | 98°C | 30 sec |
25 cycles | 98°C | 10 sec |
| 62°C | 30 sec | |
| 72°C | 10 sec | |
| 1 cycle | 72°C | 5 min |
| 1 cycle | 4°C | Forever |
12、取5 μL PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖跑膠，確保成功擴增出大約150bp的目的片段。
13、加1 μL DpnI (20 U/μL)到PCR產(chǎn)物中，37°C溫育1h。（Dpnl能夠消化PCR模板）
14、用PCR產(chǎn)品純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，得到的DNA保存在?20°C。
15、用核酸定量儀（NanoDropUV-Vis 8000）檢測酶切純化后的sgRNA載體和步驟14得到的PCR產(chǎn)物。
16.連接sgRNA載體和PCR產(chǎn)物，連接體積如下：
| 連接酶（如：In-Fusion HD Enzyme Premix (5×)） | 1 μL |
| 線性的sgRNA載體 | 50 ng |
| 純化的PCR產(chǎn)物 | 25 ng |
| ddH2O | x μL |
| 總體積 | 5 μL |
50°C溫育15min。冰上放置5min后，?20°C保存。
17、將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂到含有100 μg/mL羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板中，放到培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)過夜。
18、待平板中長出菌落，用無菌的移液槍槍頭挑單菌落到5ml的LB培養(yǎng)液中（含有100 μg/mL羧芐青霉素），將其放到搖床中，37°C，200 rpm/min培養(yǎng)過夜。
19、取0.5 mL上述過夜的菌液到含有50mlLB培養(yǎng)基（含有100 μg/mL羧芐青霉素）的錐形瓶中，將其放到搖床中，37°C，200 rpm/min培養(yǎng)過夜。
20、取4.5 mL的菌液，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒。
21、將提取的重組質(zhì)粒和測序引物送到測序公司測序。
22、測序成功后，用質(zhì)粒中提試劑盒提取50ml菌液的質(zhì)粒，保存在?20°C中，等待步驟27用。
23、根據(jù)實驗?zāi)康?，將對?yīng)的dCas9表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，將轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂到含有100 μg/mL羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板中，放到培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)過夜。
24、待平板中長出菌落，用無菌的移液槍槍頭挑單菌落到50ml的LB培養(yǎng)液中（含有100 μg/mL羧芐青霉素），將其放到搖床中，37°C，200 rpm/min培養(yǎng)過夜。
25、用質(zhì)粒中提試劑盒提取50ml菌液的質(zhì)粒，保存在?20°C中，等待步驟27。
26、轉(zhuǎn)染前，按每孔2–3 × 105 HEK293T細胞接種到6孔培養(yǎng)板中（每孔2 ml的高糖DMEM（含10%FBS）），在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)過夜。
備注：HEK293T細胞能在培養(yǎng)基（含高糖的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10%FBS，100 U/mL鏈霉素和100 U/mL的青霉素）中生長，0.05% (w/v) trypsin–EDTA消化傳代。但轉(zhuǎn)染時在無抗生素的培養(yǎng)基中進行更有效。
27、培養(yǎng)24h后，細胞貼壁，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染體系：
a.將以下的質(zhì)粒預(yù)混：
pCMV-dR8.91 (lentiviral packaging plasmid) 1.32 μg
pMD2.G (lentiviral packaging plasmid) 165 ng
dCas9 or sgRNA expression construct 1.51 μg
注：可用不含目的基因序列的sgRNA載體或沒有融合表達的dCas9質(zhì)粒作為陰性對照。
b.取上述3 μg量的DNA預(yù)混物到250 μL的Opti-MEM Reduced-Serum培養(yǎng)基中，用移液器上下吹打。
c.加7.5 μL的MirusTransIT-LT1轉(zhuǎn)染試劑到上述混合物中，上下吹打混勻。
d.將上述混合物在常溫下放置30min，使其形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體。
28、將培養(yǎng)了細胞的6孔板中的培養(yǎng)基吸去250 μL。
29、將步驟27中的混合物加到6孔板的其中一個孔中，來回輕輕搖擺混勻，37°C，5% CO2培養(yǎng)24h。
注：轉(zhuǎn)染24h后，細胞開始產(chǎn)生病毒。
30、轉(zhuǎn)染24h后，吸去6孔板中的培養(yǎng)基，重新加入2.5mL新鮮的DMEM（含10% FBS）。
注：如果轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)時需要其他成分的培養(yǎng)基，可在換培養(yǎng)基時加入相應(yīng)的成分。
31、換液后培養(yǎng)24-48h，用無菌的注射器收集病毒上清，0.45 μm的針式濾器過濾上清，用圓錐管收集。
注：過濾后的總體積大約為2 mL，慢病毒顆粒在4°C條件下可保存1周，用液氮速凍保存在?80°C，可保存幾個月。但是推薦收集后馬上使用。
注：在以下實驗中，用HEK293T細胞作為例子，對于其他類型的細胞，請適當(dāng)修改步驟，如：細胞的數(shù)量和培養(yǎng)基等。
32、在轉(zhuǎn)導(dǎo)前16h，按每孔1.5–2 ×105 HEK293T細胞接種到6孔培養(yǎng)板中（每孔2 ml的高糖DMEM（含10%FBS）），在培養(yǎng)箱中，37°C，5% CO2培養(yǎng)過夜。
33、吸去細胞上清培養(yǎng)基，加入1 mL的DMEM（含10%FBS）和1 mL的步驟31收集的病毒上清液到培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)過夜。
注：對于不同的細胞，根據(jù)病毒的滴度，適當(dāng)加培養(yǎng)基來稀釋病毒上清液。適當(dāng)濃度的聚凝胺能夠增加病毒感染細胞的效率；但是它對一些細胞有毒性，包括HEK293T細胞。
34、吸去病毒上清液，重新加入2 mL新鮮的DMEM（含10% FBS），37°C，5% CO2培養(yǎng)48h。
注：細胞通常在加入慢病毒顆粒后48h會表達dCas9蛋白，但是對于抑制實驗，建議是感染72h后收集細胞，以至于能最小限度地降低之前已存在于細胞中的目的基因mRNA的干擾。
35、使用流式細胞分選儀（BD FACSAriaII Cell Sorter）來收集細胞。
a.對CRISPRi系統(tǒng)，需要收集藍色熒光蛋白（BFP）和紅色熒光蛋白（mCherry）陽性的細胞。
注：藍色熒光蛋白陽性細胞表達dCas9蛋白，紅色熒光蛋白陽性細胞表達sgRNA。
b.對CRISPRa(dCas9–Suntag)系統(tǒng)，需要收集BFP，mCherry和綠色熒光蛋白（GFP）陽性的細胞。
注：綠色熒光蛋白陽性細胞表達scFv-sfGFP-VP64融合蛋白。
36、收集細胞后，37°C，5% CO2培養(yǎng)。
注：細胞生長之后，用qPCR的方法分析目的基因的表達水平。
37、收集細胞，使用RNA提取試劑盒提取細胞的總RNA。
注：通常提總RNA至少需要0.5–1 × 106個細胞。
38、用核酸定量儀（NanoDropspectrophotometer）來檢測總RNA的濃度。
39、用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，步驟可根據(jù)相應(yīng)的試劑盒說明書。
40、用qPCR檢測分析目的基因的表達量。
四、參考文獻
[1]Dan Du, Lei S. Qi. 2016. CRISPRTechnology for Genome Activation and Repression in Mammalian Cells. Cold SpringHarb Protocol: doi:10.1101.
[2] Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, RoskinKM, Pringle TH, Zahler AM, Haussler D. 2002. The human genome browser at UCSC.Genome Res 12: 996–1006.
[3] Bhagwat M, Young L, Robison R.R. 2012.Using BLAT to find sequence similarity in closely related genomes. Curr ProtocBioinformatics Chapter 10: Unit 10.18.
[4] Chen B, Gilbert LA, Cimini BA,Schnitzbauer J, Zhang W, Li GW, Park J, Blackburn EH, Weissman JS, Qi LS, etal. 2013. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimizedCRISPR/Cas system. Cell 155: 1479–1491.
[5] Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z,Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, etal. 2013. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription ineukaryotes. Cell 154: 442–451.
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