研究表明，miRNA在膀胱癌中異常表達，對促進或抑制致癌，發(fā)育，凋亡，侵襲和轉(zhuǎn)移具有多重影響。circRNA可以充當“miRNA海綿”起作用，對miRNA產(chǎn)生負調(diào)控作用。然而，作為“miRNA海綿”的circRNA的功能尚未在膀胱癌中明確闡明。華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院泌尿外科曾甫清課題組李亞偉博士近期發(fā)表在《EMBO reports》的研究提供了circRNAs可作為“miRNA海綿”的證據(jù)，并提出了治療膀胱癌的新靶點。 摘 要 越來越多證據(jù)表明環(huán)狀RNA（circRNA）在調(diào)節(jié)基因表達方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在本研究中，作者進行RNA-seq并鑒定人類膀胱癌和正常膀胱組織中的6,154種不同的circRNA。發(fā)現(xiàn)數(shù)百個circRNA在人膀胱癌組織中顯著失調(diào)。進一步表明稱為膀胱癌相關(guān)環(huán)狀RNA-2（BCRC-2）的circHIPK3在膀胱癌組織和細胞系中顯著下調(diào)，分別與膀胱癌分級，侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。circHIPK3過表達可有效抑制膀胱癌細胞的體外遷移，侵襲和血管生成，并抑制體內(nèi)膀胱癌生長和轉(zhuǎn)移。機制研究表明，circHIPK3含有microRNA miR-558的兩個關(guān)鍵結(jié)合位點，可以大量充當miR-558海綿來抑制乙酰肝素酶（HPSE）的表達。綜上所述，本研究結(jié)果提供證據(jù)表明circRNAs作為“microRNA海綿”，并提出了治療膀胱癌的新治療靶點。 概要 1、circHIPK3在人膀胱癌組織和細胞系中下調(diào) 2、circHIPK3有效地在膀胱癌細胞中充當miR-558海綿 3、circHIPK3通過靶向miR-558/乙酰肝素酶軸來抑制癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移 技術(shù)流程 1、膀胱癌組織和正常組織CircRNA表達譜：RNA-seq（銳博生物提供） 2、circHIPK3鑒定及定位：RT-PCR、Sanger測序、Northern blot分析、RNA熒光原位雜交（銳博生物提供） 3、circHIPK3體外功能驗證：circHIPK3表達載體轉(zhuǎn)染、細胞劃痕實驗、transwell遷移和侵襲實驗、siRNA 4、機制研究（circHIPK3充當miR-558海綿作用）：序列預(yù)測比對、miR-558/circHIPK3探針（銳博生物提供）、pull down、real-time PCR、miR-558 mimics、RNA FISH 5、miR-558體外功能驗證：miR-558 mimics、anti-miR-558 inhibitor、real-time PCR、Western blot、細胞劃痕與transwell實驗 6、circHIPK3與miR-558相互作用研究：共轉(zhuǎn)染實驗、transwell侵襲、細胞劃痕實驗 7、circHIPK3體內(nèi)功能驗證：構(gòu)建異種移植腫瘤（轉(zhuǎn)移）模型、免疫組織化學(xué) 研究結(jié)果 1 膀胱癌組織和正常組織CircRNA表達譜 首先，作者通過RNA-seq鑒定circRNA。發(fā)現(xiàn)人類膀胱癌和正常膀胱組織中的6,154個不同的circRNA，其中有1,623個新的circRNA。有88.35%的circRNAs來源于外顯子（圖1A），其他來源于內(nèi)含子、基因間區(qū)域、3’UTR和5’UTR等。膀胱癌組織中524個circRNAs顯著下調(diào)，47個上調(diào)（圖1B）。 2 circHIPK3鑒定及定位 然后作者選擇了幾種顯著差異表達的circRNA來驗證其在膀胱癌細胞系中的存在。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)circHIPK3在兩種細胞系中穩(wěn)定表達。circHIPK3（hsa_circ_0000284）來源于HIPK3基因，由外顯子2（1,099bp）頭對尾剪接組成，在膀胱癌組織中下調(diào)。Sanger測序確認了circHIPK3頭對尾剪接及預(yù)期的大小（圖2C）。 然而，頭對尾剪接可以通過反式剪接或基因組重排產(chǎn)生。首先，作者設(shè)計收斂引物和發(fā)散性引物分別擴增HIPK3 mRNA和circHIPK3。發(fā)現(xiàn)circHIPK3僅能在cDNA中通過發(fā)散性引物擴增，在gDNA中沒有擴增（圖3D）。其次，Northern blot分析顯示circHIPK3有預(yù)期大小條帶。與此同時，檢測HIPK3轉(zhuǎn)錄本的環(huán)狀和線性形式發(fā)現(xiàn)RNase R可酶切線性的HIPK3片段而circHIPK3被保留，通過RT-PCR進一步證實（圖3E,F）。 接下來，檢測circHIPK3在膀胱癌組織與正常組織中的表達水平發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，79.5%的膀胱癌組織中circHIPK3的表達顯著減少，分別與膀胱癌分級，侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)（圖3G）。RNA熒光原位雜交表明circHIPK3主要位于細胞質(zhì)（圖3I）。 3 circHIPK3體外功能驗證 為了探討circHIPK3在膀胱癌細胞中的功能，作者將circHIPK3表達載體轉(zhuǎn)染到T24T和UMUC3細胞。顯示circHIPK3的表達顯著增加，過表達的circHIPK3對RNase R處理具有抗性，可被RNase R降解的HIPK3 mRNA表達無明顯變化（圖4A）。細胞劃痕實驗表明circHIPK3過表達顯著抑制T24T和UMUC3細胞中的細胞遷移（圖4B）。transwell遷移和侵襲實驗顯示circHIPK3過表達也抑制膀胱癌細胞系的遷移和侵襲（圖4C,D）。 另一方面，作者將靶向circHIPK3連接位點的siRNA轉(zhuǎn)染到T24T和UMUC3細胞中，以評估對circHIPK3和HIPK3 mRNA表達的影響。發(fā)現(xiàn)這些siRNA顯著降低circHIPK3的表達，但對HIPK3 mRNA無影響（圖5E）。轉(zhuǎn)染最有效的circHIPK3 siRNA（si circHIPK3-1）后膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力增加（圖5F-H）。這些結(jié)果表明，circHIPK3過表達可以抑制膀胱癌細胞在體外的遷移和侵襲。 4 circHIPK3作用機制研究 為了確定circHIPK3是否能夠在膀胱癌細胞中充當miRNA海綿的作用，作者通過數(shù)據(jù)庫序列預(yù)測比對選擇了12個候選miRNAs（圖6A）。那么circHIPK3是否可以直接結(jié)合這些候選miRNA？作者設(shè)計并驗證了生物素標記的circHIPK3探針在膀胱癌細胞系中可pull down circHIPK3，并且circHIPK3過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中的下拉效率顯著增強（圖6B,C）。提取pull down后的miRNA，real-time PCR檢測12個候選miRNA水平，顯示miR-558是唯一一個在T24T和UMUC3細胞中被circHIPK3大量pull down的（圖6D）。 CircHIPK3包含miR-558的6個預(yù)測結(jié)合位點。為了確認哪個結(jié)合位點是功能性的，作者在circHIPK3表達載體中突變了每個位點，以測試它是否仍然可以下拉miR-558。發(fā)現(xiàn)突變的circHIPK3也可以通過circHIPK3探針下拉（圖7E）。隨后，評估每個突變的circHIPK3下拉的miR-558的相對水平顯示突變位點1或位點2后miR-558的相對結(jié)合顯著降低，而其他4個位點的突變未顯示出下降（圖7F）。這些結(jié)果表明，結(jié)合位點1和位點2而不是其他四個結(jié)合位點對于circHIPK3充當miR-558海綿是至關(guān)重要。 接下來應(yīng)用生物素標記的miR-558 探針進一步驗證miR-558和circHIPK3的直接結(jié)合。real-time PCR檢測circHIPK3與miRNA mimics或突變體的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)與破壞circHIPK3和miR-558之間堿基配對的突變體相比，在野生型miR-558的捕獲部分中circHIPK3的富集更高（圖8G）。RNA FISH測定顯示circHIPK3和miR-558共定位于細胞質(zhì)中（圖8H）。上述結(jié)果表明，circHIPK3可以直接結(jié)合T24T和UMUC3細胞中的miR-558。 5 miR-558體外功能驗證 224個定義明確的膀胱癌病例的Kaplan-Meier生存曲線顯示，HPSE高表達患者的生存概率較差（圖9A）。real-time PCR發(fā)現(xiàn)與對照相比，miR-558在膀胱癌組織及T24T和UMUC3細胞中均上調(diào)（圖9B,C）。為了研究miR-558在膀胱癌細胞系中的功能，作者進行了miRNA的抑制和過表達實驗。細胞劃痕與transwell實驗顯示miR-558過表達顯著促進膀胱癌細胞的遷移和侵襲（圖9D）。通過用miR-558 mimics轉(zhuǎn)染的T24T和UMUC3細胞的預(yù)處理培養(yǎng)基處理HUVEC細胞，使得管形成能力也得到提高。相比之下，anti-miR-558 inhibitor的轉(zhuǎn)染顯著抑制T24T和UMUC3細胞遷移與侵襲，并抑制HUVEC細胞的管形成（圖9C,E,F）。Real-time PCR和Western blot實驗表明miR-558 mimics可增加膀胱癌細胞中HPSE，VEGF和MMP-9的表達，anti-miR-558 inhibitor則降低其表達（圖9G,H）。這些結(jié)果表明miR-558可以通過體外靶向HPSE來顯著促進膀胱癌的遷移，侵襲和血管生成。 6 circHIPK3與miR-558相互作用研究 為了確定circHIPK3是否通過與miR-558相互作用抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲，作者將miR-558 mimics和circHIPK3表達載體共轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞。與單獨用miR-558 mimics轉(zhuǎn)染的細胞相比，共轉(zhuǎn)染的膀胱癌細胞中HPSE，MMP-9和VEGF的表達顯著降低（圖10A-D）。同時，transwell侵襲和細胞劃痕實驗表明，與miR-558 mimics轉(zhuǎn)染的細胞相比，共轉(zhuǎn)染的膀胱癌細胞顯示出侵襲和遷移能力的降低（圖10E,G）。此外，用miR-558 mimics和circHIPK3共轉(zhuǎn)染細胞的預(yù)處理培養(yǎng)基處理HUVEC細胞導(dǎo)致管形成能力也下調(diào)（圖10F）。這些數(shù)據(jù)表明circHIPK3通過充當miR-558海綿并且隨后抑制HPSE的表達來抑制細胞遷移，侵襲和血管生成。 7 circHIPK3體內(nèi)功能驗證 進一步研究了circHIPK3強制表達對體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤生長，轉(zhuǎn)移和血管生成的影響。作者將circHIPK3表達載體或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染的T24T細胞皮下注射到BALB/c裸鼠中。發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的異種移植腫瘤的生長速度和腫瘤重量降低（圖11A,B）。免疫組織化學(xué)顯示HPSE，MMP-9和VEGF的表達被過表達circHIPK3抑制。此外，導(dǎo)致CD31+微血管和平均腫瘤內(nèi)血管密度減少（圖11C）。還通過尾靜脈注射構(gòu)建轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果顯示circHIPK3轉(zhuǎn)染裸鼠形成的肺轉(zhuǎn)移菌群比對照組少（圖11D）。這些結(jié)果表明，circHIPK3的強制表達有效地抑制膀胱癌體內(nèi)生長，血管生成和轉(zhuǎn)移。 銳博生物可提供完美的circRNA研究方案，涵蓋circRNA目標發(fā)現(xiàn)到功能機制驗證研究所需的多種服務(wù)及產(chǎn)品。其中特色產(chǎn)品有：circRNA高通量測序及生物信息分析、circRNA qPCR產(chǎn)品及服務(wù)、circRNA功能驗證產(chǎn)品及服務(wù)（siRNA，ASO，miRNA mimics等等），可為廣大科研人員進行circRNA功能及作用機制研究提供使用便捷的產(chǎn)品與服務(wù)。 原文 Li Y, Zheng F, Xiao X, et al. CircHIPK3 sponges miR‐558 to suppress heparanase expression in bladder cancer cells[J]. EMBO reports, 2017: e201643581.
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