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前幾天看到生信交流群（群號：659344871）有童鞋問qPCR引物設(shè)計的問題，今天就給大家推薦一款在線引物設(shè)計神器：Primer-BLAST。它是NCBI的一個在線工具，網(wǎng)址是：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

下面就以比較著名的“SWEET”基因為例，看下如何設(shè)計qPCR的引物吧。

打開NCBI的首頁，數(shù)據(jù)庫選擇gene，輸入基因的名稱（Gene symbol）SWEET1，如下圖，然后點擊Search 按鈕。

在搜到的結(jié)果中，選擇擬南芥的sweet1基因，單擊基因名稱，進入該基因的頁面。

找到該基因的對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本的ID，比如，NM_101997.3（以NM開頭），單擊進入詳情頁面。有了轉(zhuǎn)錄本的就可以進行引物設(shè)計啦，你也可以把相應(yīng)的cDNA序列下載下來，方法如下圖。

在Analyse this sequence 列表中找到Pick Primers單擊，方法如下，進入引物設(shè)計頁面。當(dāng)然也可在NCBI首頁的下部找到Primer-BLAST，單擊進入相同的頁面。

然后將PCR product size 設(shè)置為100~200bp，返回的引物數(shù)這里保持默認的10對，退火溫度保持默認。

關(guān)于引物的跨內(nèi)含子設(shè)計主要是為了避免cDNA的PCR過程受到基因組DNA的影響，引物是否跨內(nèi)含子設(shè)計以及引物的特異性檢測，這里保持默認設(shè)置即可，點擊Get Primers 提交任務(wù) 。

一般等數(shù)十秒后，就會給出結(jié)果頁面，它比OmicShare用的時間要久得多，需耐心一點。引物的圖形展示頁面如下，形象的展示了擴增片段的位置和大小。

滾動頁面，就可看到引物的詳細列表信息，如下圖。嗯，接下來就可以進行后續(xù)的引物合成、篩選、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化等等。當(dāng)然，Primer-BLAST也可以用來設(shè)計常規(guī)PCR的引物！

今天的內(nèi)容就到這里啦~

參考文獻

Chen LQ, et al. Nature, 2010Nov 25. PMID 21107422

Xuan YH, et al. Proc Natl Acad Sci U S A,2013 Sep 24. PMID 24027245