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COVID-19大流行將mRNA疫苗推向了生物技術(shù)和制藥工業(yè)的中心階段。疫苗開發(fā)的速度也超出了預(yù)期，在SARS-CoV-2序列公開10個月后就有疫苗面世。這一成功不僅證明了生物技術(shù)和制藥工業(yè)有能力應(yīng)對緊迫和未得到滿足的全球需求，而且也證明了mRNA作為一種藥物形式的固有能力，與常規(guī)疫苗相比，mRNA疫苗具有成本低、生產(chǎn)效率高、安全性高的優(yōu)勢，且擁有合成任何一種蛋白的潛能，因此，對于傳統(tǒng)疫苗無力應(yīng)對的新型傳染性病毒有巨大應(yīng)用潛力。然而，由于mRNA分子的不穩(wěn)定性、先天免疫原性高及體內(nèi)遞送效率低等原因，mRNA疫苗的應(yīng)用一直受到限制。要實現(xiàn)mRNA疫苗的廣泛應(yīng)用，需重點解決遞送技術(shù)。mRNA 疫苗需要有合適的遞送載體將其遞送至體內(nèi)，才能有更好的免疫效果，開發(fā)高效無毒的遞送系統(tǒng)是 mRNA 疫苗成功的關(guān)鍵。美國喬治梅森大學生物工程系主任Michael D. Buschmann教授在綜述中闡述了mRNA傳遞系統(tǒng)的發(fā)展，總結(jié)SARS-CoV-2 mRNA疫苗的臨床前和臨床研究結(jié)果，重點介紹了目前SARS-CoV-2疫苗臨床試驗中使用的脂質(zhì)納米粒，并且對脂質(zhì)納米粒在mRNA疫苗中的作用進行了分析。

在COVID-19之前，mRNA疫苗已用于臨床前和臨床研究，包括流感，寨卡病毒，艾滋病毒，埃博拉病毒，狂犬病，瘧疾，生殖器皰疹，弓形蟲病等。在目前針對新型冠狀病毒COVID19疫苗競賽中，基于mRNA疫苗已初見成效，目前正在進行的mRNA疫苗人體試驗共有八個，分別是由BioNTech/Pfizer、Moderna、CureVac、Sanofi/TranslateBio、Arcturus/Duke NUS新加坡醫(yī)學院、倫敦帝國理工學院、泰國Chula-longkorn大學和Providence Therapeutics領(lǐng)導。值得注意的是，其中兩項試驗公布了中期第3階段試驗結(jié)果，報告了兩次30μg或100μg劑量后編碼棘突蛋白免疫原的mRNA序列（以脂質(zhì)納米顆粒形式遞送）以及SARS-CoV-2感染率降低94%以上的療效。

mRNA疫苗的早期遞送系統(tǒng)

遞送技術(shù)平臺是 mRNA 疫苗的關(guān)鍵之一，已經(jīng)有大量的mRNA制劑系統(tǒng)見諸報道，其中的很多已經(jīng)進入臨床試驗階段。這些制劑技術(shù)都是通過形成特殊的mRNA載體，來實現(xiàn)mRNA疫苗的遞送，這些載體技術(shù)包括：魚精蛋白載體技術(shù)、納米顆粒脂質(zhì)體載體技術(shù)、多聚體載體技術(shù)。

魚精蛋白載體技術(shù)：魚精蛋白是一種天然的陽離子蛋白，可以把帶負電的mRNA分子絡(luò)合成納米級別的核酸顆粒，從而保護mRNA不被血清中的RNA酶降解；但是由于魚精蛋白和mRNA的結(jié)合太緊密，因此采用這種制劑的mRNA疫苗的蛋白表達效率會受限，另外抗原的表達很大程度上也受到魚精蛋白和mRNA比例的影響。近年來，魚精蛋白mRNA遞送系統(tǒng)已廣泛用于臨床并獲得了很好的臨床治療效果，例如CureVac采用了這種方法來生產(chǎn)狂犬病疫苗候選藥物，CV7201，一種凍干的，溫度穩(wěn)定的未修飾的mRNA由編碼狂犬病病毒糖蛋白的游離和魚精蛋白復合mRNA組成。

用于mRNA傳遞的聚合物

幾十年來，陽離子聚合物已廣泛用于核酸遞送，例如poly(L-lysine), PEI, DEAE-dextran, PBAE和殼聚糖。在最簡單的形式中，陽離子聚合物與核酸過量混合形成靜電結(jié)合的陽離子聚合物。盡管已經(jīng)開發(fā)出許多聚合物，但是它們在核酸遞送方面還不如脂質(zhì)納米粒那么先進，并且將它們成功地應(yīng)用于疫苗的動物研究數(shù)量有限。

用于當前SARS-CoV-2臨床試驗的脂質(zhì)納米顆粒的開發(fā)

最早使用的脂質(zhì)體遞送材料是陽離子脂質(zhì)體。帶正電荷的陽離子脂質(zhì)體與帶負電荷的 mRNA 通過經(jīng)靜電作用聚集形成多層囊狀復合物，稱為脂質(zhì)體復合物 (lipoplex，LP)，復合物中包封的 mRNA 不易被 RNase 降解，能被成功遞送至細胞翻譯成功能性蛋白。2 - 二油?；u丙基 - 3-N，N，N - 三甲銨氯(DOTAP) 和二油酰磷脂酰乙醇胺 (DOPE) 是已被證實有效的遞送載體。陽離子聚合物具有濃縮 mRNA 的作用，mRNA 與聚合物濃縮后被陽離子脂質(zhì)體包裹在囊狀空腔中則形成脂質(zhì)體聚合物(lipopolyplex，LPR)。LPR 最早用于 DNA 轉(zhuǎn)染，后來也用于 siRNA 和 mRNA 轉(zhuǎn)染。

脂質(zhì)體納米粒 LNP 一般由被脂質(zhì)雙層殼包圍的水性核心組成，脂質(zhì)雙層殼由不同的脂質(zhì)組成，每種脂質(zhì)都發(fā)揮著不同的功能。LNP 是目前主流的遞送載體之一。由于其比較容易被抗原呈遞細胞吸收，因此最常被用于疫苗，目前三大mRNA疫苗巨頭企業(yè)，Moderna、CureVac和BioNTech均采用了LNP遞送技術(shù)。

LNP通常由四種成分組成：可電離陽離子脂質(zhì)、聚乙二醇、膽固醇和磷脂。目前，擁有LNP自主知識產(chǎn)權(quán)的公司主要包括ModeRNA、Arcturus、Acuitas、Arbutus、Genevant、艾博生物、深信生物等。而在傳染性疾病領(lǐng)域的應(yīng)用，進入臨床試驗階段的僅ModeRNA、Arcturus、Acuitas和艾博生物。

mRNA脂質(zhì)納米顆粒的鼻內(nèi)遞送

對于mRNA疫苗，絕大多數(shù)研究和所有當前的臨床試驗都使用肌肉注射，而對皮內(nèi)注射也進行了研究，通常與肌內(nèi)途徑平行。盡管到目前為止還沒有高度發(fā)展，但是鼻內(nèi)注射疫苗具有諸如激活等優(yōu)點，可減少依賴于針為基礎(chǔ)的免疫

疫苗mRNA遞送系統(tǒng)性能的決定因素

mRNA傳遞系統(tǒng)性能的決定因素是多因素和相互作用的，包括：（1）它們傳遞到適當細胞并有效地將mRNA釋放到細胞質(zhì)翻譯機制的效力或能力；（2）它們的佐劑性，可以增強免疫應(yīng)答；（3）使任何貢獻最小化可能由注射部位過度炎癥或全身分布和靶向表達引起的不良事件或毒性。

脂質(zhì)納米粒在當前SARS-CoV-2臨床試驗中的應(yīng)用

1.BioNTech /輝瑞

Acuitas ALC-0315（表2）與DSPC、膽固醇和聚乙二醇-脂質(zhì)結(jié)合是BioNTech的SARS-COV-2試驗中的輸送系統(tǒng)。CureVac和倫敦帝國學院也可使用ALC-0315，或可能使用A9（表2）。BioNTech開始開發(fā)其SARS-CoV-2疫苗，其中4個mRNA編碼免疫原，其中兩個是核苷修飾的，一個未修飾，一個是自擴增的。報告可用于兩種核苷修飾的mRNAs：BNT162b1是一個短~1kb的序列，編碼spike蛋白的受體結(jié)合域，經(jīng)foldon三聚化域修飾以通過多價展示增加免疫原性。較長的4.3kb BNT162b2編碼一種二丙氨酸穩(wěn)定的全長膜結(jié)合蛋白。BNT162b2最近獲得了歐盟和美國的緊急批準。

2.Moderna

Moderna公司的mRNA-1273是一款基于mRNA，編碼全長新冠病毒刺突蛋白的疫苗。它設(shè)計用來誘導中和抗體，中和抗體指向冠狀病毒SARS-ConV-2“刺突”蛋白的一部分，該病毒利用刺突蛋白結(jié)合并進入人體細胞。在Moderna的研究中，核苷修飾的mRNA編碼的免疫原是一種跨膜錨定的二丙氨酸穩(wěn)定的融合前峰，具有天然的furin裂解位點，并在LNP中傳遞，該LNP遵循原型MC3 LNP，但用脂質(zhì)H（SM-102）代替MC3。

3.CureVac

CureVac的mRNA疫苗CVnCoV是由脂質(zhì)納米粒子（LNP）封裝的、序列優(yōu)化的基于mRNA的SARS-CoV-2疫苗，它編碼全長的、預(yù)融合穩(wěn)定的S蛋白。與其他基于mRNA的方法不同，CVnCoV完全由非化學修飾的核苷酸組成，可以在相對較低的劑量下應(yīng)用。

4.Translate Bio

Translate Bio使用未修飾的mRNA編碼雙突變形式的雙脯氨酸穩(wěn)定的刺突蛋白以LNP的形式傳遞可離子化脂質(zhì)C12-200，但可能是來自ICE或基于半胱氨酸的可電離脂質(zhì)家族。該疫苗在非人類靈長類動物身上進行了研究，大多數(shù)靈長類動物在一劑疫苗后產(chǎn)生了中和抗體，所有生物的抗體效價在第二劑疫苗后都達到了明顯高于人類康復血清中的水平。

5.Arcturus

Arcturus Therapeutics公司的LUNAR-COV19是一種極低劑量，潛在的單次（im）單次自我復制mRNA疫苗，不含任何病毒物質(zhì)或輔助佐劑。臨床前體外數(shù)據(jù)顯示，施用LUNAR-COV19可以有效表達COVID-19病毒刺突蛋白，即形成保護性抗體的抗原Arcturus已完成1期臨床試驗，劑量為1-10μg，并選擇了7.5μg進行3期試驗。

6.倫敦帝國理工學院

倫敦帝國理工學院研發(fā)的Acuitas LNP中遞送的自我擴增型RNA疫苗能有效地向人體肌肉中注射新的遺傳密碼，引導肌肉產(chǎn)生一種出現(xiàn)在新型冠狀病毒表面的蛋白質(zhì)，從而讓其產(chǎn)生保護性的免疫反應(yīng)。該疫苗的1期臨床試驗即將開始

7.賓夕法尼亞大學、朱拉隆功大學

朱拉隆功大學與賓夕法尼亞大學合作，使用Genevant開發(fā)天然的穗狀免疫原核苷修飾的mRNA LNP，可能是CL1脂質(zhì)。他們的目標是在2021年第一季度開始第一階段的臨床試驗，在2021年第4季度開始向泰國及附近的7個低收入國家分發(fā)疫苗。

8.Providence Therapeutics

Providence therapeutics獲得了加拿大衛(wèi)生部的授權(quán)，可以進行PTX-COVID-19B mRNA LNP疫苗的人體臨床試驗。第一階段臨床試驗計劃于2021年第一季度開始，疫苗的生產(chǎn)和銷售將在同一年獲得監(jiān)管部門的批準。

9.儲存與分配

實驗室制造的大多數(shù)RNA LNP在4℃下穩(wěn)定數(shù)天，但隨后表現(xiàn)出尺寸增大和生物活性逐漸喪失，如熒光素酶表達。為了穩(wěn)定mRNA-LNP疫苗的儲存和分發(fā)，需要一種冷凍形式。Moderna COVID-19疫苗需要在25℃到15℃之間儲存，但也可以在2℃到8℃之間穩(wěn)定30天，在8℃到25℃之間穩(wěn)定12小時。Pfizer/BioNTech COVID-19疫苗需要在80℃至60℃的溫度下儲存，然后解凍并在2℃至8℃的溫度下儲存最多5天，然后在注射前用生理鹽水稀釋。在分發(fā)和儲存期間，輝瑞公司疫苗所需的干冰溫度比Moderna疫苗所需的常規(guī)冷凍室溫度更難達到。這些溫差背后的原因并不明顯，因為兩種疫苗都含有類似的高濃度蔗糖作為冷凍保護劑。Moderna mRNA LNP在兩種緩沖液中冷凍，即Tris和醋酸鹽，而輝瑞/生物泰克疫苗僅使用磷酸鹽緩沖液。眾所周知，磷酸鹽緩沖液不適合冷凍，因為它們易于沉淀，并在冰結(jié)晶開始時導致pH值突然變化。冷凍干燥對mRNA LNPs一直是一個挑戰(zhàn)。然而，Arcturus已經(jīng)聲明他們的COVID-19 mRNA疫苗在凍干形式下是穩(wěn)定的，這可能會大大簡化分布，盡管這種凍干制劑的溫度穩(wěn)定性尚未披露。

總結(jié)

在過去的二十年中，mRNA治療學的進展是非同尋常的，首先是通過修飾核苷和序列工程來確定控制mRNA固有免疫原性的方法，以及mRNA在疫苗和其他治療適應(yīng)癥中的應(yīng)用。脂質(zhì)納米粒原型機的采用使得脂質(zhì)納米粒的遞送效率比以前的系統(tǒng)提高了一個數(shù)量級，并且正在不斷提高，這主要是由于新型可電離脂質(zhì)的設(shè)計。mRNA-LNP的結(jié)構(gòu)、功能、效價、靶向性和生物學特性，如佐劑性等許多方面仍有待于探索，以充分發(fā)揮這種強大的和具有變革性的治療方式的潛力。

為了推動全球新冠疫苗的研發(fā)進度，促進各國研發(fā)機構(gòu)間的交流合作和信息共享，解決臨床研究中存在的問題和可能面臨的風險挑戰(zhàn)，由四葉草會展、生物制品圈等單位主辦的2021全球新冠疫苗研發(fā)峰會將于5月16-17日在中國上海舉行。本屆峰會以“全球合力、加速研發(fā)”為主題，組委會將邀請國際國內(nèi)主要新冠疫苗研發(fā)機構(gòu)代表圍繞研發(fā)進展情況、工藝和質(zhì)量控制、臨床研究進展、注冊和申報等內(nèi)容進行深入研討。

會議內(nèi)容

時間：2021年5月16-17日

地點：上海（具體地點報名后通知）

規(guī)模：500-600人

主辦單位：四葉草會展、生物制品圈

協(xié)辦單位：Cytiva中國

支持單位：南京諾唯贊生物

會議費用：為疫苗技術(shù)研發(fā)人員提供參會福利，4月8日之前報名FREE!（僅收取100元定金，僅含茶歇、會議資料，定金繳納后概不退還），先到先得，報完即止，4月8日以后報名將收取會議費！

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