NGS 技術(shù)在臨床上的應(yīng)用逐步趨于成熟，從早期的腫瘤基因檢測(cè)，到如今大熱的微生物病原核酸檢測(cè)，NGS 技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確和高分辨率的特點(diǎn)，發(fā)揮著無可替代的作用。
微生物在地球上無處不在，從陸地到海洋，從衣物到皮膚，甚至我們的身體內(nèi)部。
繁衍、變異、自然選擇和生存斗爭(zhēng)，是所有生物必須經(jīng)歷的。
因?yàn)樯牡谝灰x，是生存。
為了生存，必須斗爭(zhēng)，生物之間為了爭(zhēng)奪資源，以及生物與自然環(huán)境之間，都存在著斗爭(zhēng) ，在這個(gè)過程中，有些微生物能夠與人類和平共處，甚至互利共生，而有的微生物則會(huì)使人患病，通常有細(xì)菌、真菌、病毒、支原體，以及衣原體，這些就是臨床上的病原微生物。
冠狀病毒示意圖
自然選擇需要經(jīng)歷漫長(zhǎng)的過程，但是近年來環(huán)境污染，藥物濫用，加快了病原微生物的進(jìn)化速度，耐藥菌，超級(jí)菌的出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著人類健康。
還有一些微生物，本來與人類沒有交集，原先只存在于自然界，而有人為了獵奇，食用野生動(dòng)物，從而把這些動(dòng)物身上攜帶的病毒帶到了人類社會(huì)，如本世紀(jì)初的非典病毒（Severe Acute Respiratory Syndromes, SARS）就是例子，這類新型病毒對(duì)公共衛(wèi)生健康形成了巨大的挑戰(zhàn)，個(gè)別人的貪婪，給全世界的人們帶來了巨大的災(zāi)難。
當(dāng)健康受到了威脅，對(duì)付細(xì)菌，人類發(fā)明了抗生素， 對(duì)付病毒，發(fā)明了抗病毒藥物，但要如何治療，第一步是找出元兇，而這在臨床上往往存在困難。
傳統(tǒng)的血常規(guī)，或者器官和組織的影像學(xué)指標(biāo)能夠判斷感染的可能性，但并不能作為確診的依據(jù)，比如血常規(guī)只能告訴你是否有細(xì)菌或病毒感染，但不能告訴你是什么細(xì)菌或病毒，還需要進(jìn)一步檢查才能確診，以便對(duì)癥下藥。
實(shí)驗(yàn)室檢查，如抗原檢測(cè)、核酸檢測(cè)、代謝產(chǎn)物檢測(cè)以及毒素檢測(cè)才是明確感染、指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后的重要手段。
細(xì)菌和真菌檢測(cè)。通常需要先進(jìn)行分離培養(yǎng)，再結(jié)合生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，這種模式是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室慣用的經(jīng)典模式，為臨床解決了很多關(guān)鍵問題，然而其周期長(zhǎng)、陽(yáng)性率低、通量低等弊端往往難以滿足臨床日益增長(zhǎng)的需求。
病毒、支原體、衣原體檢測(cè)。難以像細(xì)菌一樣進(jìn)行分離培養(yǎng)，通常采用分子生物學(xué)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）測(cè)定核酸，靈敏快速，但只限于已知病原體的檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果提供的信息相對(duì)有限，難以解決由變異帶來的醫(yī)學(xué)問題。
為了克服傳統(tǒng)方法的不足，下一代測(cè)序技術(shù)（Next-generation sequencing technology，NGS）在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用具有非常大的優(yōu)勢(shì)，如：
通量大，一次可檢測(cè)成百上千個(gè)物種，特別是未知的病原，測(cè)定其核酸序列是必不可少的手段；
直接測(cè)定病原微生物的核酸序列，能為臨床提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，如物種鑒定、分型以及耐藥突變等；
更低的檢測(cè)限，即使病原微生物的豐度很低，也能夠檢測(cè)到。
當(dāng)然，NGS 的缺點(diǎn)也是有的：
相對(duì)于 PCR，時(shí)效性處于劣勢(shì)；
成本較高，暫時(shí)不會(huì)完全取代現(xiàn)行的常規(guī)鑒定手段。
即便有不足，但 NGS 的技術(shù)優(yōu)勢(shì)更為明顯，在疑難微生物，以及難以培養(yǎng)甚至無法分離培養(yǎng)的少見菌屬的鑒定，特別是新型病原微生物的暴發(fā)流行監(jiān)測(cè)方面，NGS 快速、準(zhǔn)確和高分辨率的特點(diǎn)，使其成為病毒鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，在流行病學(xué)分型中發(fā)揮著重要作用。
新型冠狀病毒（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）正肆虐全球，目前尚無疫苗和特效藥，人們除了戴口罩，注意個(gè)人衛(wèi)生以及增加社交距離外別無他法，面對(duì)洶涌的疫情，再一次提醒人類，要放下自己是萬物之靈的傲慢，因?yàn)槲⑸锊攀钱?dāng)之無愧的地球之王，它們?cè)谶@個(gè)星球上生存的歷史比人類更長(zhǎng)，種類和數(shù)量也比人類要多得多。
佩戴口罩防病毒感染
我們不能，也不應(yīng)該試圖消滅所有微生物。我們之間的關(guān)系，不只有對(duì)抗，還有合作，但是當(dāng)我們的健康受到威脅時(shí)，也要勇于斗爭(zhēng)。
物競(jìng)天擇，適者生存，人類與微生物的合作與斗爭(zhēng)，必將永遠(yuǎn)進(jìn)行下去。
臨床微生物高通量檢測(cè)，應(yīng)用場(chǎng)景不同，各種測(cè)序技術(shù)令人眼花繚亂，但我們可以做如下總結(jié)。
檢測(cè)對(duì)象：病原體核酸，或人宿主自身核酸
測(cè)序技術(shù)：DNA 測(cè)序，或 RNA 測(cè)序
測(cè)序范圍：DNA 靶向，或 DNA 非靶向；所有 RNA，或部分 RNA
進(jìn)而可以歸納為兩大類，四小類測(cè)序策略。
以微生物核酸為檢測(cè)對(duì)象：
病原基因組測(cè)序（metagenomic）
病原轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（metatranscriptomic）
以人宿主自身核酸為檢測(cè)對(duì)象：
人基因組測(cè)序（DNA-Seq）
人轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）
目前，”病原微生物基因檢測(cè)“約等于”病原宏基因組檢測(cè)“，正如“精準(zhǔn)醫(yī)療”約等于“腫瘤基因檢測(cè)”一樣。
作為宏基因組的補(bǔ)充，基于多重 PCR 的靶向測(cè)序，具有非常大的應(yīng)用情景。
而其他技術(shù)，如宏轉(zhuǎn)錄組、RNA-Seq 研究病原與人的互作等目前都還處于探索階段。
1. 非靶向測(cè)序（untargeted NGS，mNGS）
非靶向的宏基因組測(cè)序，優(yōu)勢(shì)是大而全，不管有多少種微生物感染，理論上都一次給測(cè)出來。不僅能測(cè)已知病原，還能發(fā)現(xiàn)未知病原體。
但是它最大的缺點(diǎn)，就是靈敏度嚴(yán)重依賴于受背景干擾的程度。特別是組織樣本，含有大量人體細(xì)胞，測(cè)出來的數(shù)據(jù) 99% 都是人的 DNA 序列。
因此可以說，宏基因組測(cè)序，就是大海撈針。而靶向測(cè)序，則可與之互為補(bǔ)充。
2. 靶向測(cè)序（targeted NGS, tNGS）
靶向擴(kuò)增子測(cè)序是先富集目的 DNA 序列，再測(cè)序。這樣可以增加測(cè)序數(shù)據(jù)中目標(biāo)序列的比例，進(jìn)而提高檢測(cè)的靈敏度。
常用于富含 DNA 的手段有擴(kuò)增和捕獲兩種。
擴(kuò)增： 通過 PCR 反應(yīng)增加目的片段的數(shù)量。
捕獲： 通過核酸探針與目的片段進(jìn)行雜交，從而抓取目的序列進(jìn)行測(cè)序。
顯然，靶向測(cè)序只能用于核酸序列已知的病原體的檢測(cè)。其好處是靈敏度高、成本低。
參考文獻(xiàn)：
Chiu C Y , Miller S A . Clinical metagenomics[J]. Nature Reviews Genetics, 2019.
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