新型冠狀病毒（2019-nCoV）特異IgM和IgG抗體檢測寫進了國家衛(wèi)生健康委于2020年3月3日發(fā)布的“新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）“，作為臨床確診標準，國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）也應(yīng)急審批了廣州萬孚（膠體金試紙條）、英諾特（唐山）（膠體金試劑條）、博奧賽斯（重慶）（化學發(fā)光免疫法）和廈門萬泰凱瑞（化學發(fā)光免疫法）等四家企業(yè)的五個抗體檢測試劑盒，其中廣州萬孚和廈門萬泰凱瑞檢測的是抗新型冠狀病毒總抗體，其他兩家檢測的是IgM和IgG抗體，臨床已開始廣泛應(yīng)用這些試劑對患者進行檢測，其他一些正申請審批的試劑如獲得CE認證的深圳亞輝龍的IgM和IgG抗體試劑（化學發(fā)光免疫法）也在臨床大量應(yīng)用。徐萬洲等在19例核酸檢測陰性但基于臨床癥狀確診的 COVID-19 患者中，有 16 例患者 2019-nCoV IgM陽性，其陽性率達到 84.21%，有 18 例患者 2019-nCoV IgG 陽性，其陽性率達到 94.74%，說明抗體的檢測可以有效地彌補核酸檢測漏檢的風險，發(fā)揮其在新型冠狀肺炎（COVID-19）的及時診治及防控中的作用。但臨床現(xiàn)也有反映出現(xiàn)了較多的假陽性，困擾臨床決策。2019-nCoV特異IgM和IgG抗體檢測出現(xiàn)假陽性的原因是什么？如何最大程度的識別假陽性并避免假陽性對臨床的誤導(dǎo)？以及在臨床應(yīng)用中，究竟要如何去用才能最有效地發(fā)揮其對2019-nCoV感染的診斷和防控價值？是一個必須要直接面對并且無法回避的問題。
一、 2019-nCoV特異IgM和IgG抗體的診斷意義
從機體對病原體的體液免疫應(yīng)答來看，病原體的特定蛋白如2019-nCoV的S蛋白和N蛋白等會刺激免疫系統(tǒng)引起抗體應(yīng)答，最早出現(xiàn)的抗體是IgM及其后的IgA抗體，然后是IgG抗體，從急性感染的一般過程，當IgG抗體出現(xiàn)后，濃度會持續(xù)增高，IgM則持續(xù)降低，直至消失，IgG抗體會較長時間存在。因此，特異IgM和IgG抗體是一對出現(xiàn)有序，此消彼長的一個關(guān)系。所以我們曾提出，正確地利用及觀察IgM/IgG的動態(tài)變化（如圖1），有助于在病毒核酸檢測這個臨床診斷“金標準”失效后（因病程、標本采集等所致的假陰性）的2019-nCoV感染的診斷。 那為什么一定要是動態(tài)的，而不能是靜態(tài)的檢測一次呢？這是由免疫檢測的特性所決定的，也就是抗體檢測會因為臨床標本中的一些干擾物質(zhì)的存在而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。也許有同道要問，那為什么我們檢測乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人類免疫缺陷病毒（HIV）等則可以靜態(tài)只檢測一次呢？其實也不是一次，這些病毒感染主要為慢性感染，無法如上述急性感染那樣去動態(tài)觀察確認，只能是通過如下辦法確證：如HBV有多個標志物（如“兩對半”），可相互確認，出現(xiàn)罕見的單獨HBsAg陽性，則有中和實驗確證；抗-HCV和抗-HIV陽性，也必須經(jīng)過確證實驗如病毒核酸檢測或免疫印跡實驗后，才能報出陽性結(jié)果。圖1. IgM/IgG用于判斷急性或近期感染的動態(tài)檢測及判斷方法二、 IgM和IgG抗體檢測假陽性的原因以及如何最大程度的避免特異IgM和IgG免疫測定假陽性通常有以下兩個方面的原因，一是試劑盒陽性判斷值（Cut-off value）的設(shè)定，一些處于陽性判斷值附近的弱陽性結(jié)果，很可能是假陽性；其二是患者標本中存在導(dǎo)致免疫測定假陽性的內(nèi)源性或外源性干擾物質(zhì)。
（一）陽性判斷值的設(shè)定
膠體金試紙條檢測是通過肉眼觀察顏色有否來判斷陽性和陰性，不存在陽性判斷值的問題，但會存在不同檢測者判斷的差異?；瘜W發(fā)光免疫試驗（CLIA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）則需要設(shè)定陽性判斷值，其較好的做法是通過測定大量的陰性人群（可數(shù)千份）和一定數(shù)量（可數(shù)百份）的已知陽性人群標本，會得到如圖2的一個分布，采用接受機工作特性（Receiver Operating characteristic，ROC）曲線或其他統(tǒng)計學方法得到的陽性判斷值，通常為假陽性和假陰性均較低且達到平衡狀態(tài)時的測定信號如OD值或發(fā)光值。因此，不可避免處于其周邊陽性一側(cè)的結(jié)果，會有一部分弱陽性其實際為假陽性。
圖2. 依據(jù)陰性和陽性人群檢測值的分布確定陽性判斷值
1. 內(nèi)源性 內(nèi)源性干擾物質(zhì)一般包括類風濕因子、嗜異性抗體、補體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig 抗體等。在日常的臨床血清（漿）標本中，有相當比例的標本不同程度的含有上述各種干擾物質(zhì)，從而可能導(dǎo)致測定結(jié)果的假陽性。（1）類風濕因子（Rheumatoid factors，RF）在類風濕患者、其他疾病以及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的RF，其通常為IgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點，因此在免疫測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的標記的特異抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。尤其是在捕獲法IgM型特異抗體的測定中表現(xiàn)最為明顯，因為此時固相包被的抗體為抗人μ鏈抗體，IgM型RF的存在可使其大量結(jié)合于固相。為避免RF的干擾，通常可采取以下措施：1）稀釋標本。這在判斷急性病原體感染的特異IgM抗體檢測等尤為有用。因為急性感染時，血循環(huán)中特異的IgM抗體滴度通常很高，而RF滴度通常相對要低很多。因此，在測定前對標本進行稀釋，特異的IgM因高滴度仍可檢出，而非特異的RF則會因為稀釋變成很低的滴度，從而不影響測定。2）改變酶標抗體。由于RF結(jié)合的是IgG的Fc片段，如果將標記抗體的Fc片段酶切去除，僅留下具有特異結(jié)合功能的F(ab’)2部分用于標記，則在測定中即可避免RF的干擾。3）標本中RF用變性IgG預(yù)先封閉。將經(jīng)熱變性（63℃，10 min）的動物如兔、羊等的IgG加入到標本稀釋液中。此外，在測定特異IgM時，也可使用抗人IgG去除臨床標本中RF和IgG。4）測定時，可在標本中加入一定濃度的尿素，其可以解離低親合力結(jié)合的RF和IgG，因而可以去除RF的干擾。（2）嗜異性抗體（Heterophilicantibodies） 人類血清中可能會含有抗嚙齒類動物（如鼠、馬、羊等）的抗體，即天然嗜異性抗體。有研究表明，天然的嗜異性抗體（IgG）可分為兩類，一類（85%的假陽性由其引起）可結(jié)合于山羊、小鼠、大鼠、馬和牛IgG的Fab區(qū)域，但不與兔IgG的Fab區(qū)結(jié)合。另一類（15%的假陽性由其引起）可結(jié)合于小鼠、馬、牛和兔IgG的FC區(qū)表位，但不與山羊和大鼠IgG的FC區(qū)表位結(jié)合。嗜異性抗體可通過交聯(lián)固相和標記的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。由嗜異性抗體引起的干擾可通過下述方法避免：1）使用特異的兔F(ab’)2片段作為固相或測定標記抗體。2）在標本或標本稀釋液中加入過量的動物Ig，封閉可能存在的嗜異性抗體。但加入量不足或亞類不同時無效。 在固相免疫測定中，來自哺乳動物的固相特異抗體和標記二抗均可以激活人補體系統(tǒng)。因為其在固相吸附及結(jié)合過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)， Fc段的補體C1q結(jié)合位點被暴露出來，這樣C1q就成為一個中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。由補體引起的干擾可采用56℃30 min加熱可使標本中的補體C1q滅活。但實施前，一定要有實驗證明這種滅活不會影響特定試劑的檢測結(jié)果。（4）因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig 抗體在臨床上，有可能使用鼠源性單克隆抗體進行靶向治療，及使用放射性核素標記鼠源性單克隆抗體進行影像診斷等，均有可能使相應(yīng)患者體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體。這種抗鼠抗體對使用鼠源性單克隆抗體的免疫測定，可產(chǎn)生假陽性結(jié)果。由抗鼠抗體引起的干擾可通過下述方法避免：1）使用特異的抗體F(ab’)2片段作為固相或測定酶標抗體。2）在標本或標本稀釋液中加入過量的鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體。
（5）溶菌酶
溶菌酶可與等電點較低的蛋白有強的結(jié)合能力。免疫球蛋白等電點約為5，因此，在免疫測定中，溶菌酶可在包被的IgG和標記的IgG間形成橋接，從而導(dǎo)致假陽性。Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶，防止其聯(lián)接IgG。
2. 外源性 外源性干擾物質(zhì)包括標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存時間過長和標本凝固不全等。要注意避免出現(xiàn)嚴重溶血。血紅蛋白的血紅素基團有類似過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標記酶的ELISA和CLIA中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其在溫育過程中會吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色或發(fā)光，導(dǎo)致假陽性。（2）標本貯存時間過長 標本在2~8℃下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法免疫測定中會導(dǎo)致本底過深、甚至造成假陽性。（3）標本凝固不全 血液采集后，如收集管中無促凝劑和抗凝劑，則血液通常在半小時后開始凝固，18~24h完全凝固。日常檢驗中，有可能在血液還未開始凝固時即離心分離血清，此時因血液沒有完全凝固，離出的“血清”并非為完全的血清，其中仍殘留部分纖維蛋白原，如將其加入微孔中，在ELISA測定過程中仍可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果。因此，血液標本采集后，應(yīng)使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽?/span>綜上所述，盡管從方法學設(shè)計及臨床應(yīng)用中，通過一些方法和措施可以大大減少IgM和IgG抗體檢測的假陽性，但無法完全避免。
三、如何才能最有效地發(fā)揮特異IgM和IgG抗體檢測對新冠病毒感染的診斷和防控價值
任何一個臨床檢測項目，都是為了特定患者人群在其疾病發(fā)生發(fā)展過程中某個特定時間的疾病的診斷或治療的，簡單的講，就是要對正確的患者（who）在正確的時間（when）開出正確的檢驗申請單（what）。那么，2019-nCoV特異的IgM和IgG抗體只能是用于在臨床疑似COVID-19且病毒核酸檢測陰性時，為明確診斷，可按照圖1所示動態(tài)多次（2次以上）檢測患者，通過動態(tài)變化來判IgM和IgG檢測陽性的真假，從而避免假陽性結(jié)果對臨床診斷的誤導(dǎo)。當然，對于臨床疑似患者，特異IgM和IgG抗體的檢測也可與病毒核酸檢測同時進行，當核酸檢測為陰性時，抗體檢測出現(xiàn)圖1中的四種模式的任何之一，不管后續(xù)的核酸檢測是否陽性，只要是真正的病毒感染者，應(yīng)基本上都可以通過后續(xù)的抗體動態(tài)檢測出現(xiàn)的結(jié)果模式明確診斷。此外，針對2019-nCoV刺突（S）蛋白的抗體具中和病毒的作用，采用S蛋白作為抗原的檢測到的IgG抗體的出現(xiàn)并持續(xù)升高，應(yīng)具有很好的預(yù)后及康復(fù)指示價值。要注意的是，現(xiàn)在出現(xiàn)了將特異抗體的檢測大規(guī)模用于復(fù)工或一般人群篩查的現(xiàn)象，是不可以的，其原因就是因為上述假陽性的出現(xiàn)是無法完全避免的。一般人群篩查，一旦出現(xiàn)陽性，會造成大量人群不需要的隔離，帶來混亂。并且，抗體檢測陰性，也不能排除2019-nCoV的感染。所以這種篩查的成本效益極低。NMPA在已批準的2019-nCoV的特異抗體試劑盒說明書中的預(yù)期用途中都明確寫出：僅用作對新型冠狀病毒核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測指標或疑似病例診斷中與核酸檢測協(xié)同使用，不能作為新型冠狀病毒感染的肺炎確診和排除的依據(jù)，不適用于一般人群的篩查。 綜上所述，COVID-19特異IgM/IgG抗體完全可以作為COVID-19在病毒核酸檢測陰性情況下的確診標準，其前提是需要2次以上的動態(tài)檢測，以避免因標本中RF等免疫測定干擾物質(zhì)的存在所致的假陽性結(jié)果的誤導(dǎo)。正因為有這種假陽性的存在，特異IgM/IgG抗體檢測不適用復(fù)工等一般人群的篩查，這是必須要強調(diào)的。
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