miRNA的發(fā)現(xiàn)，與一位祖籍波蘭的生物學家維克托·安博斯（VictorAmbros）的工作有關(guān)——他在線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA lin-4。
許多人認為，首次發(fā)現(xiàn)miRNA的安博斯同樣應該在諾貝爾獎的歷史上留下名字。由于諾貝爾獎評選委員會很少會針對同一個領(lǐng)域重復頒獎，所以盡管安博斯曾一度被提名諾貝爾生理或醫(yī)學獎，卻最終失之交臂。
但我們不得不承認，過去的幾十年是我們對基因表達和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控理解上的一場革命。
以前，蛋白質(zhì)的基因組結(jié)構(gòu)和亞型（例如轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳介體）被認為是基因表達的唯一調(diào)節(jié)劑。
但是，近年來，參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的miRNA和其他ncRNA揭示了對多種細胞功能至關(guān)重要的調(diào)控機制。
目前，研究人員在理解miRNA的生物發(fā)生和功能、編碼miRNA的基因結(jié)構(gòu)、靶向miRNA的序列特異性以及miRNA的應用方面取得了長足的進步，人們越來越關(guān)注miRNA作為細胞過程的重要調(diào)節(jié)劑以及在疾病的發(fā)生和發(fā)展中的作用。
今天我們就一起來探索一下這類小RNA的獨特之處。
MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源編碼的?22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，占哺乳動物基因組的2％。30年前，人們在研究線蟲發(fā)育過程時發(fā)現(xiàn)lin-14mRNA的活性受到一個特殊負調(diào)控機制的影響，后來證明此負調(diào)控機制是lin-14編碼的miRNA片段，能與lin-14mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）不完全互補從而調(diào)控lin-14的翻譯，從此開啟了miRNA研究的新紀元。miRNA的生物合成來源于RNA聚合酶II和III直接從基因組DNA的不同區(qū)域轉(zhuǎn)錄長度高達幾千bp的初始miRNA轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）。隨后，pri-miRNA由RNAse III酶Drosha和輔助因子DGCR8共同組成的復合體進一步加工以形成莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體miRNA（pre-miRNA）。然后轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5（XPO5）、Ran-GTP轉(zhuǎn)運子將pre-miRNA從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)。在這里，它們被另一種RNAse III酶(dicer酶)剪切成小的雙鏈RNA（dsRNA），其中5’端熱力學穩(wěn)定性最差的一條與TRBP結(jié)合并富集Argonaute蛋白（AGO），形成RNA誘導的沉默復合物（RISC），這條鏈即為成熟miRNA，另一條為互補鏈。RISC復合物通過miRNA與mRNA的3'-UTR的靶位點結(jié)合來進行翻譯抑制和靶向mRNA降解，繼而介導基因沉默。另一條互補鏈本應趨向于降解，但Ro及其同事對小鼠和人的969個miRNA分析時發(fā)現(xiàn)了117條互補鏈，說明可能存在雙鏈miRNA，且不論是成熟體還是互補鏈都具有組織特異性。長期以來，研究人員已經(jīng)觀察到RISC可以在細胞核以及細胞質(zhì)中介導轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS），從而影響胚胎發(fā)育，調(diào)控物質(zhì)代謝，介導信號傳導，參與細胞凋亡、病毒感染以及疾病的發(fā)生。miRNA與其靶mRNA結(jié)合的主要決定因素是miRNA 5'端的6-8個核苷酸序列，即“種子”序列。miRNA與種子區(qū)域之間的任何序列互補都會觸發(fā)靶mRNA表達水平的下降。種子序列匹配可發(fā)生在基因的任何區(qū)域，但更可能存在于mRNA的3'UTR，根據(jù)與3'UTR靶序列同源的程度，miRNA可以誘導mRNA的翻譯抑制或降解。鑒于每個miRNA能夠調(diào)節(jié)許多基因的表達，所以每個miRNA可以同時調(diào)節(jié)多個細胞信號通路。細胞質(zhì)中的PTGS是miRNA通過miRISC介導的經(jīng)典功能。如，miR-139-5p和miR-144能夠在mRNA和蛋白質(zhì)水平上降低TET2和TET3的表達。PTGS的第一步是識別，基本原則包括規(guī)范的Watson-Crick AU、GC配對和非規(guī)范的GU配對。在靶mRNA上有一個特殊的miRNA反應元件（MRE），用于miRNA識別和結(jié)合。MRE與TET2和TET3 mRNA一樣，大多位于mRNA的3'-UTR，但是一些研究表明，它也出現(xiàn)在5'-UTR中，甚至出現(xiàn)在蛋白質(zhì)編碼序列中。miRNA在細胞核中可以起增強子的作用。增強子是能夠上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄的基因組順式調(diào)控元件。在miRNA基因（MIR）中發(fā)現(xiàn)了包括H3K27ac在內(nèi)的一些增強子標記。一些miRNA，如miR-26a-1，miR-339，miR-3179，miR-24-1，miR-24-2，已被證明能夠誘導鄰近基因的表達。由miRNA誘導的增強子激活需要Ago2直接在基因座處發(fā)揮作用或?qū)⒊墒斓膍iRNA從細胞質(zhì)帶到細胞核。除了上述miRNA的傳統(tǒng)作用機制外，最近還發(fā)現(xiàn)了其他“非經(jīng)典”作用機制。一些證據(jù)表明，miRNA可以通過在靶mRNA的AU富集區(qū)域募集蛋白質(zhì)復合物來增加靶mRNA的翻譯，或者通過相互作用和調(diào)節(jié)阻遏蛋白來間接提高靶mRNA的水平。另有證據(jù)表明部分miRNA能提高核糖體合成，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，或跳過細胞周期停滯，從而激活靶基因抑制。自從1993年發(fā)現(xiàn)第一個miRNA lin-4以來，已經(jīng)鑒定了271個物種中的48885個成熟miRNA，并將其存放在金標準存儲庫miRBase中。至今，已經(jīng)針對miRNA生物發(fā)生的每個過程開發(fā)了許多生物信息學工具，包括用于miRNA預測發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)分析和靶標預測。miRNA研究的歷史時間表以及生物學數(shù)據(jù)庫開發(fā)[3]
每個miRNA序列、pre-miRNA二級結(jié)構(gòu)和miRNA基因位點等都需要一個miRNA數(shù)據(jù)存儲庫。miRBase是此領(lǐng)域主要的存儲庫，收集了所有已知的miRNA序列和所有物種的注釋。Rfam是用于RNA注釋的統(tǒng)一系統(tǒng)，包含了miRNA家族信息。miRIAD容納了miRNA及其宿主基因的信息，mirtronPred從內(nèi)含子序列預測mirtrons，mirSTP用于識別miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS），MetaMirClust提供有關(guān)miRNA簇及其保守性的全面信息。其次，miRNA的二級和三級結(jié)構(gòu)對于特異性結(jié)合蛋白的識別或與其他RNA的相互作用非常重要，結(jié)構(gòu)特征和自由能是預測miRNA分子的關(guān)鍵特征。ViennaRNA和RNAstructure是代表性的miRNA結(jié)構(gòu)預測工具。miRNA的鑒定識別系統(tǒng)也是一個重要工具，MiRscan可用于鑒定線蟲中保守的miRNA。miRNAFold是一種 ab initio 用于從基因組中大規(guī)模預測miRNA 的快速工。還有基于下一代測序（NGS）數(shù)據(jù)識別miRNA的工具，如miRDeep和miRanalyzer。切割位點、結(jié)合和靶標發(fā)現(xiàn)工具對于miRNA研究也十分重要。LBSizeCleav和PHDcleav工具可以用來預測pre-miRNA中的Dicer切割位點。miRBShunter、Antar和miRTar2GO可以用來檢測來自AGO-CLIP-Seq（例如AGO-PAR-CLIP和AGO-HITS-CLIP）的miRNA結(jié)合位點。還有miRanda，TargetScan，PicTar，RNAhybrid和PITA等也可以用來預測miRNA，研究其功能，miRecords和miRTarBase也是經(jīng)過驗證的miRNA目標數(shù)據(jù)庫。另外，將miRNA與表型相關(guān)聯(lián)是注釋miRNA功能的另一種方法。HMDD收集了人工治愈的人類疾病相關(guān)的miRNA，PASmiR包含用于植物的特定miRNA，CERNA包含miRNA的反應元件（MRE）。miRNA相互作用網(wǎng)絡也是時下流行的研究方向，starBase和PceRBase等數(shù)據(jù)庫記錄了特定類型的RNA相互作用（例如，miRNA-lncRNA，miRNA-circRNA和miRNA-mRNA）。細胞外miRNA是臨床應用的潛在生物標志物，專門收集在miRandola和ExoCarta等數(shù)據(jù)庫中。miRNA是許多生理功能的重要調(diào)節(jié)劑，在細胞發(fā)育、分化和體內(nèi)平衡過程中形成了復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，其功能的失調(diào)與越來越多的人類疾?。ㄓ绕涫前┌Y）相關(guān)，研究人員希望能用miRNA來開發(fā)新的疾病治療策略。miRNA失調(diào)，無論是致癌性miRNA的過表達還是抑癌性miRNA的下調(diào)，都可能引起惡性腫瘤。據(jù)報道，核miRNA通過作用于相應基因位點的啟動子而參與多種腫瘤啟動子/阻遏物基因或與癌癥相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。使用miRNA來開發(fā)新的腫瘤治療策略主要基于以下兩種方法：1）將miRNA用作藥物分子，基于特定寡核苷酸的合成和傳遞，能夠增加或降低腫瘤組織中miRNA的水平；2）調(diào)節(jié)miRNA結(jié)合非基于miRNA的藥物療法以提高常規(guī)療法的療效。基于miRNA的癌癥療法是一種通過恢復miRNA對抗發(fā)病機制的策略。主要采用拮抗劑和模擬寡核苷酸（通常稱為“antagomiR”）以抑制在人類疾病中病變的miRNA。miRNA通過高度特異性的Watson-Crick堿基配對作用，對于高表達的致癌性miRNA，配對堿基可被antagomiR封閉，該寡核苷酸可與miRISCs高親和力結(jié)合從而破壞其抑制功能。對于抑制腫瘤的miRNA，miRNA模擬物可以恢復miRNA的功能。目前許多制藥公司也在開發(fā)靶向miRNA和拮抗miRNA療法，其中最成功的基于antagomiR療法是針對miR-122的靶向治療。miR-122在肝臟中高表達，是HCV復制中必不可少的輔助因子。研究人員用與miR-122完全互補的2'-OMe反義RNA處理細胞系消除了HCV復制。由Santaris Pharma和Hoffman-La Roche開發(fā)的Miravirsen基于miR-122的療法已經(jīng)進入臨床試驗，并且在非人類靈長類動物中具有良好的耐受性，大大降低了HCV負擔，很可能成為第一個基于miRNA的治療藥物進入市場。miR-21的過表達與幾種類型的癌癥發(fā)病機理有關(guān)，其體外抑制實驗導致膠質(zhì)母細胞瘤、乳腺癌和肝癌細胞死亡。Regulus Pharmaceuticals已開始研究抗miR-21用于肝癌和Alport綜合征的研究，并已經(jīng)開始了肝癌治療的臨床前試驗。4.2 miRNAs作為診斷和判斷預后的生物標志物在臨床醫(yī)學檢測中，我們經(jīng)常對生物標志物進行測量以幫助診斷，此標志物應具有特異性、敏感性、無創(chuàng)性、在流行病學組之間保持一致、易于量化且具有成本效益的特點，重要的生物標志物也應隨疾病或治療的進展而改變，以便于監(jiān)測。由于miRNA可由實體瘤分泌到周圍環(huán)境中并且在體液中穩(wěn)定存在，能在血漿、唾液、牛奶和腦脊液等體液中檢測到，且易于通過微陣列、NGS和定量PCR進行檢測，所以是生物標志物的理想候選者。MiR-21是研究最多的癌基因miRNA標志物之一，在幾乎所有人類癌癥中都檢測到過表達，它負調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因PTEN以及促凋亡蛋白BAX的表達。因此，miR-21的過表達與腫瘤侵襲性相關(guān)，同時抑制細胞凋亡。在淋巴瘤（DLBCL）患者的血清樣本中miR-21、miR-155和miR-210表達上調(diào)。在乳腺癌（BC）患者血液中miR-195、miR-29a、miR-21、miR-16、miR-25、miR-222和miR-324-3p表達升高。miR-155在B細胞成熟中起作用，在B細胞和血漿中檢測到miR-155升高可診斷為B-CLL。AML患者血清中的miR-150和miR-342含量較高，且在完全緩解的AML患者中，miR-150和miR-342恢復到正常水平，表明這兩種miRNA可以成為監(jiān)測治療效果的生物標志物。除了用于疾病的預測外，miRNA還可作為藥物治療的預測生物標志物。miRNA的表達受藥物影響，而且本身也可能影響藥物的代謝和毒性，因此miRNA的表達也可用作藥物功效的潛在生物標記，特別是循環(huán)miRNA，例如，miR-21的高表達和miR-200b的表達下調(diào)與對多種化療藥物的耐藥性有關(guān)，可以作為患者對化療反應的預測性替代生物標志物。4.3 microRNAs用于藥物功效和藥物安全性評估藥物引起的肝損傷、心臟毒性和腎毒性是藥物開發(fā)過程中的主要問題。由于miRNA參與了不同器官在藥物誘導的毒性中的作用（例如肝臟、心臟、腎臟、肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖器官等），因此可以利用miRNA評估藥物安全性。目前檢測患者藥物性肝損傷的臨床實踐標準是測量血液樣本中的生物標志物水平，如ALT、AST 、ALP和膽紅素，然而，這些生物標志物敏感性和特異性低，不能進行早期診斷。在器官損傷期間，miRNA通常會釋放到生物流體中且穩(wěn)定存在，因此，在血液或尿中的miRNA可被作為非侵入性生物標記物用于檢測肝臟疾病和毒性，且檢測方法簡單、經(jīng)濟、高效。目前，已經(jīng)鑒定出指示肝損傷的肝特異性miRNA，如miR-122。在藥物心臟毒性的預測中，最廣泛使用的血清蛋白生物標志物cTnI和cTnT只在組織損傷已經(jīng)發(fā)生3-12小時內(nèi)升高，敏感性低，不適合快速測定。研究人員在使用嚙齒動物進行的急性心臟毒性研究和人類心肌損傷的研究中，已經(jīng)在血液中檢測到了心肌特異性miRNA，這些miRNA用作心臟毒性的相對無創(chuàng)性循環(huán)預測指標在藥物安全性評估中具有巨大潛力，尤其是在臨床前模型中。總尿蛋白、葡萄糖N-乙?；?β-（D）-氨基葡萄糖苷酶、血清肌酐和尿素氮（BUN）已被用作腎毒性的生物標志物，這些標志物的升高通常與已確定的腎損傷有關(guān)，不能進行早期快速的檢測，Blatt 等人報道了使用miRNA檢測順鉑的腎毒性，表明miRNA在腎臟損傷的發(fā)病機理中起作用，并且可以充當腎毒性的生物標志物。miRNA調(diào)節(jié)藥物療效和安全性[4]
自從1993年發(fā)現(xiàn)miRNA以來，人們不斷深入探索此領(lǐng)域，了解了它們在基因組中的編碼方式、轉(zhuǎn)錄方式和加工方式以及抑制蛋白質(zhì)翻譯的機制，逐漸認識到這些轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子在生理調(diào)控中的重要性，同時也意識到這些小RNA作為疾病診斷治療的巨大潛力。但目前我們對miRNA的了解尚淺，基于miRNA的治療與診斷還有很長的路要走，基于miRNA的療法的主要問題是如何組織特異性遞送，為了避免miRNA的快速降解和排泄，開發(fā)出可以增強穩(wěn)定性和靶向組織的新遞送系統(tǒng)也極為重要。總之，miRNA為疾病的診斷治療提供了嶄新的平臺和思路，將成為精準醫(yī)療領(lǐng)域的后起之秀。
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