一、引言
單核苷酸多態(tài)性( single nucleotide polymorphism,SNP),是美國MT人類基因組中心負責人 Lander e s等人于1996年發(fā)現(xiàn)的新一代遺傳標記,它主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,即指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上,存在兩種不同的核苷酸且其出現(xiàn)的頻率大于1%,如果出現(xiàn)頻率低于1%,則看作點突變。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在,平均每500~1000個堿基對中就有1個,估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多
由于遺傳密碼中包含了大約300萬個差異,這些差異導致了人類基因組中存在廣泛的多態(tài)性,這種多態(tài)性可能由RFLP引起,也可能是SSR造成,而90%的差異是由SNP造成的。因此,作為第三代遺傳標記的單核甘酸多態(tài)性(SNP)的研究就顯得尤為重要。
SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及單個堿基的變異,這種變異可以是轉換(CT,GA),也可以是顛換(CA,GT,CG,AT),也可由單個堿基的插入或缺失所導致。但大多數(shù)是轉換,具有轉換型變異的SNP約占2/3,其它幾種變異的發(fā)生概率相似。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁。而且多半是C轉換成T,因為人類基因組中大多數(shù)的二核苷酸CpG的胞嘧啶是甲基化的,C常自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶T殘基2
在基因組DNA中,SNP既可以發(fā)生在非編碼序列中,也可以分布在編碼序列中。編碼序列中的SNP稱之為cSNP( coding SNP,cSNP),cSNP根據(jù)是否改變編碼產(chǎn)生的氨基酸,可進一步分為“非同義的”和“同義的”,cSNP中約有一半為非同義cSNP。SNP在整個基因組中的分布密度是不同的,基因組平均變異數(shù)是相似的,大約每1330個堿基對中就有1個SNP存在,人類300萬個左右的SNP中有142萬多個SNP已在基因組范圍的圖上進行了標記。在包含基因的區(qū)域里估計每1萬個堿基中有8個,另外,常染色體與性染色體中的SNP分布密度是不同的,個體中常染色體的差異是很小的。差異數(shù)目從每1萬個堿基5.19個(第21號染色體)至每1萬個堿基8.79個(第15號染色體)不等;人類在性染色體上的差異更小,X染色體之間的差異大約是每1萬個堿基有4.69個,Y染色體的差異更小,是每1萬個堿基有151個?？偟膩碚f,位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP比較少,因為在外顯子內(nèi)其變異率只有周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義。因此對cSNP的研究更受關注。
由于每個SNP位點通常僅含2種等位基因—雙等位基因(dll,就單個SNP而言只有兩種變異體,變異程度低于微衛(wèi)星DNA,但SNP在整個基因組中數(shù)量巨大、分布密集,因此就整體而論,SNP的多態(tài)性要高得多。而且由于SNP是二態(tài)的,在基因組中篩查SNP往往只需+/分析,易于自動化批量檢測,因而被認為是新一代的遺傳標記。
二、原理
SNP-PCR的原理因使用的方法不同而有所差異,一般說來用SNP檢測技術分型根據(jù)其原理可大致分為四類,引物延伸法,特異探針雜交法,核苷酸連接法,損傷切除法;針對結果分析方法的不同可以分為熒光法,化學發(fā)光法,分子量測定法,酶聯(lián)反應法等。從圖136~圖139中可以了解其原理。
1.引物延伸法
(1)質(zhì)譜檢測法[圖136(a)]這種方法是利用一個引物在SNP上游一個堿基位點退火延伸時結合 ddNTP。延伸產(chǎn)物被質(zhì)譜檢測,延伸產(chǎn)物的質(zhì)量不同,引物識別摻入的核苷酸并確定SNP基因型
(2)毛細管電泳法熒光檢測[圖13-6(b)]這種方法是利用引物在延伸SNP上游的堿基位點時,延伸產(chǎn)物 ddNTP帶有不同的熒光標簽。毛細管電泳后通過熒光檢測產(chǎn)物,根據(jù)染料的顏色指示摻入堿基的種類,從而達到SNP基因分型。
(3)等位基因特異性引物檢測PCR產(chǎn)物[圖136(c)]這種方法是利用兩個等位基因特異性引物在延伸時,它們的3末端在SNP位點,和一個普通的反向引物共同進行PCR反應。這個反應只在正向引物的3末端能完全延伸到SNP位點,反應才會發(fā)生,根據(jù)PCR的產(chǎn)物能推測基因型
2.特異探針雜交法
如圖13-7所示。
3.核苷酸連接法(圖13-8)
(1)用CFET標簽檢測這種方法是使用兩個帶有不同CFET標簽的等位基因特異性探針和個帶有生物素標簽的普通探針,與鄰近的序列雜交。如果在SNP位點正確配對,等位基因特異性探針連接普通探針,反之,不連接。通過普通探針的生物素標簽和來自CFET標簽的熒光信號來確認連接法,進而確定SNP基因型。
(2)掛鎖探針的連接法這種方法是使用兩個等位基因特異性探針與日標DNA雜交,SNP位點處它的末端與鄰近的序列雜交成一環(huán)形。如果正確配對,則探針的一個末端即特異性等位基因與另一端連接,形成環(huán)形?？梢杂靡环N特殊引物通過滾環(huán)擴增檢測,經(jīng)過凝膠電泳分析產(chǎn)物。
4酶切法(圖13-9)
三、材料及方法
1.DNA的提取
在法醫(yī)的物證鑒定過程中,針對獲取的微量血液DNA及血痕DNA主要應用 chelex-100法提取,也可以用酚抽提和二步消化法提取,如混合斑中的精子DNA。DNA提取的方法很多,現(xiàn)在市面上也有一些操作方便的DNA提取試劑盒,因物而易,選擇簡單、適合的方法進行DNA的提取。在法醫(yī)學中,可以通過搜索檢測帶有SNP的DNA鏈,來確定物證如血斑、毛發(fā)等的基因型,進而來排除嫌疑人等。
2.DNA的定量
用于SNP檢測的DNA用量微小,只需幾十納克,其定量方法同STR分析定量方法相似。
3.DNA的擴增
2× TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒與40× TaqMan SNP Genotyping Assays試劑盒聯(lián)合使用。
(1)DNA、引物及探針用量DNA純度:OD260/OD280=1.6~2.0,濃度1~20ng/pl。
引物和探針濃度:
引物/ Probe mix 貯存液(20×) 工作液(1×) 每反應用量
6-FAM Probe 4Hmol/L 0Onmol/L 5pmol/ Rxn
VIC Probe 4umol/L 200nmol/L.
Forward Primer 18umol/L. 900nmol/L 22. 5pmol/ Rxn
Reverse Primer 18umol/L
注:Rxn即表示平行實驗中每“一個反應”的符號。
(2)PCR反應體系
試劑 用量/rl40× Probe/ Primer mix 0.625(1×)
DNA(20ng/ul) 1 H2O
2× Universal PCr 總體積
Master mix, no UNG 12.5(1×)
(3)PCR循環(huán)參數(shù)95℃10min-(92℃15s-60℃lmin)×40個循環(huán)。
四、 SNP-PCR檢測方法
SNP的檢測方法有很多種?；赑CR技術的常用方法主要有限制性酶切片段長度多態(tài)性( restriction fragment length polymorphism,RFLP)、單鏈構象多態(tài)性( single strand conformation polymorphism,SsCP)(后面章節(jié)有詳細的介紹)、異源雙鏈分析( heteroduplex analysis,HA)7,這些是早期的常用方法。由于SNP的特點,在進行法醫(yī)鑒定時需要檢測的量是STR的4倍以上,也即大概60個。為此,近年來建立了許多新的SNP分型方法和技術,如變性高壓液相色譜分析( denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC),引物延伸結合飛行時間質(zhì)譜分析( matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS),動態(tài)等位基因特異性雜交( dynamic allele specific hybridizationDASH)0和基因芯片法、 TaqMan探針技術和焦磷酸測序技術等。它們的靈敏度及通量都比之前的方法大大提高,使其在法醫(yī)檢測中得到越來越廣泛的應用。這些技術雖然能完成對SNP的檢測,但應用上也有些不足。有些檢測過程繁瑣,需要限制性內(nèi)切酶消化;有些需兩步PCR擴增反應:有些新技術雖具有通量高、易于自動化等優(yōu)點,但要求成本昂貴的儀器設備。
基于原理的差異,下面簡要介紹幾種SNP的檢測分析技術
1.陣列雜交分析( array hybridization assays)
基于寡核苷酸與不同靶序列變異配對時的雜交穩(wěn)定性差異原理,主要有兩種形式:第一種是ASO( allele specific oligonucleotide hybridization,等位基因特異性寡核苷酸雜交)探針與DNA樣品的多重PCR產(chǎn)物陣列雜交,適用于掃描多個病例樣品中數(shù)個致病等位基因,如 MA SDA(mul-tiplexed allele specific diagnostic assay,多重等位基因特異性診斷分析);第二種是ASO探針與寡核苷酸陣列雜交,適用于多個SNP的平行分析,成功的關鍵在于要同時制備數(shù)千個用于平行檢測的PCR產(chǎn)物,如DA( variant detector array,變異檢測陣列)、SNP芯片等。由于ASO技術成熟,已被廣泛運用于臨床診斷上,如ASO可用于以PAH基因第399密碼子由A→T的序列多態(tài)性為遺傳標記的苯丙酮尿癥產(chǎn)前診斷等的臨床診斷。
2.基因芯片技術
基因芯片( gene chips)又稱DNA芯片( DNA chips),或生物芯片( biological chips),是用標記的探針與特定的DNA樣品雜交,然后通過檢測雜交信號的強弱判斷樣品中靶分子的數(shù)量。
由于該技術可以將大量的探針同時固定于支持物上,所以一次可以對大量的DNA分子進行檢測分析,從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術復雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少、效率低的問題?；蛐酒瑱z測技術的主要過程:首先,用生物素標記擴增后的靶序列或樣品,然后再與芯片上大量的探針進行雜交;其次,用含鏈霉素的熒光素作為顯色物質(zhì),圖像的分析則用激光共聚焦顯微鏡或其它熒光顯微鏡對芯片掃描,由計算機搜集熒光信號,并對每個點的熒光強度數(shù)字化后進行分析。由于完全正常的 Watson-Crick配對雙鏈與具有錯配堿基的雙鏈分子相比具有較高的熱力學穩(wěn)定性,所以前者的熒光強度要比后者強5%~35%。從這一點來說,該方法是具有定特異性的,而且熒光信號的強度還與樣品中靶分子含量呈一定的線性關系。因此基因芯片已廣泛用于SNP檢測和多態(tài)性分析等方面。如人類線粒體基因組多態(tài)性分析,人類基因組單核苷酸多態(tài)性鑒定、作圖及分型等。盡管基因芯片技術憑其大信息量,自動化和低成本的特點已得到大規(guī)模的發(fā)展,但它也存在許多難以解決的問題,例如檢測靈敏度低、多態(tài)性差、分析范圍較窄等
3.同源雜交( homogenous hybridization)
有兩種基于PCR的同源雜交方法可用于等位基因區(qū)分。第一種方法為 TaqMan系統(tǒng)。它利用Taq酶的5'核酸外切酶活性,切割與PCR擴增產(chǎn)物結合的DNA探針,此探針帶有一個供體受體熒光染料對,兩者能發(fā)生熒光共振能量轉移( fluorescence resonance energy transfer,FRET)。Taq酶切割使供體染料與猝滅的受體染料分離,結果使供體染料的熒光極大增強。TaqMan在PCR的同時既可得到檢測結果,又可將PCR污染的風險降至最低。但該方法對反應試劑及反應條件有嚴格要求,由于需要重疊光譜,不能同時用兩個探針進行分析。另一種以PCR為基礎的同源雜交方法是分子信標( molecular beacons)。供體和受體熒光染料分別位于有互補序列的探針兩側,當未與靶序列雜交時,探針形成一個“發(fā)夾環(huán)”結構,使供體受體染料對相互靠近而產(chǎn)生猝滅。反之,探針與正確的靶序列雜交時,染料對分離,熒光信號可增強至900倍。探針的發(fā)夾結構設計使錯誤雜交更加不穩(wěn)定,增加了對SNP的選擇性。探針與靶序列的雜交設計在PCR的退火步驟,而不像 TaqMan那樣設計在延伸步驟,從而增加了檢測的靈敏性。由于無需供體與受體染料的重疊光譜,該法可以同時使用4個或更多不同標記的探針。
4.限制性酶切法
如果SNP產(chǎn)生或消除了某個限制性內(nèi)切酶位點,則可以通過對PCR產(chǎn)物酶切,電泳后檢測,估計有半數(shù)的SNP并不導致酶切位點的改變,在PCR中引入錯配引物可克服這一不足(如上酶切法原理所述)。該方法適宜于非大量的尋找或檢測
5.直接測序法( direct sequencing)
直接測序是最容易實施的SNP檢測方法。通過直接測序檢測SNP的基本原理是:通過對不同個體同一基因或基因片段進行測序和序列比較,以確定所研究的堿基是否變異,其檢出率可達100%。采用直接測序法,還可以得到SNP的類型及其準確位置等SNP分型所需要的重要參數(shù)。隨著DNA測序自動化和測序成本的降低,直接測序法將越來越多地用于SNP的檢測與分型。
6.焦磷酸熒光法
用大量級聯(lián)的酶反應檢測DNA合成時核苷酸的滲人,在DNA聚合酶作用下,當dNTP加人到正在生長的新鏈末端時,就會釋放1分子PPi,在磷酸化酶作用下,轉化為化學能,如有熒光素酶時,可使熒光素氧化,并發(fā)出光亮,反應液中還有核苷酸酶,當加人的dNTP未結合時便迅速分解,無光亮。此法,首先是作為一種DNA測序法,閱讀序列較短,但特異性高,可作為種精確的SNP分型法。
7. MALDITOF質(zhì)譜分析( matrix assisted laser desorption ionization time of flighttrometry)
1988年, Karas和 Hillenkamp應用 MALDI對生物大分子進行離子化和質(zhì)量分析時發(fā)現(xiàn):
適當大小的有機分子晶體(介質(zhì))用接近其吸收光譜的激光瞬時激發(fā),會發(fā)生能量轉移及解吸附過程,如將低濃度的蛋白質(zhì)或核酸分子加入介質(zhì)溶液中并加以干燥,蛋白質(zhì)或核酸分子將嵌入到介質(zhì)晶體中,將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空小室,用瞬時(納秒)強激光激發(fā),晶體中的蛋白質(zhì)或核酸分子就會解吸附,轉變成氣相的離子態(tài),此時可通過質(zhì)譜分析這些離子。
MALDI-TOF-MS分析核酸的優(yōu)點:①速度快,核酸分子的離子化、分離及檢測僅在幾毫秒內(nèi)完成;②分析結果的絕對性,質(zhì)譜對核酸分子的分離僅與其自身的質(zhì)量/電荷(m/z)有關,而傳統(tǒng)的電泳或雜交方法易受核酸二級結構的影響;③自動化操作。從樣品制備到數(shù)據(jù)的采集加工都可自動化完成,適合大規(guī)模篩查,有廣泛用于檢測已知和未知SNP及基因分型和定位研究的前景
近年來,有很多研究是應用熒光定量PCR中的SNP分析平臺,其主要是基于等位基因特異性雜交原理,通過檢測PCR過程中產(chǎn)生的熒光信號來區(qū)分等位基因,每檢測一個SNP位點需要對 TaqMan探針(或分子信標)和一對位于檢測位點的上下游引物。下面介紹一種新的基于熒光定量PCR檢測SNP位點的方法,它不需要設計特異性的 Taq Man探針,只是通過溶解曲線的分析來區(qū)分等位基因,從而大大降低了檢測成本
該方法使用了兩種不同的等位基因特異性正向引物,每個正向引物3端的最后一個堿基對應于SNP位點的二等位基因,反向引物都一樣,并使用熒光染料( SYBR green)來檢測PCR產(chǎn)物。純合子基因組DNA只能被與其完全匹配的正向引物擴增,而雜合子基因組DNA能同時和兩種正向引物結合擴增出兩種PCR產(chǎn)物。
為了區(qū)分這兩種擴增產(chǎn)物,在其中一個等位基因特異性引物的5加一個20b左右含(G+C的重復序列。由于DNA的溶解溫度主要與其片段長度和(G+C)含量有關,經(jīng)過修飾后的引物的長度和(G+C)含量明顯高于另一個等位基因特異引物,因此,使用這兩種引物后的PCR擴增產(chǎn)物有著不同的T值。在PCR擴增結束后,運行一個溶解曲線程序,即讓產(chǎn)物慢慢從60℃升溫到90℃,從溶解曲線圖上就可以分析出哪種等位基因參與了PCR擴增,由此也得到了相應的基因組的基因型。
在PCR反應體系中,加入過量 SYBR green熒光染料,SYBR莢光染料摻人DNA雙鏈后熒光信號顯著增強;當DNA變性時 SYBR green I染料釋放出來,熒光急劇減少;隨后在聚合延伸過程中引物退火并形成PCR產(chǎn)物, SYBR green染料與雙鏈產(chǎn)物結合,經(jīng)檢測獲得熒光的凈增量。熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
熒光染料可以在反應末尾對擴增產(chǎn)物進行熔解,稱為熔解曲線分析。在熔解曲線分析過程中,隨著溫度從低于產(chǎn)物熔解點緩慢升到高于產(chǎn)物熔解點,定量PCR儀連續(xù)監(jiān)測每個樣品的熒光值?；诋a(chǎn)物長度和(G+C)含量的不同,擴增產(chǎn)物會在不同的溫度點解鏈隨著產(chǎn)物的解鏈就可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對熔解曲線進行微分可以計算岀熔解峰。熔解峰可以反映反應中擴增到的產(chǎn)物,因此用熔解曲線數(shù)據(jù)就可以進行定量監(jiān)督了
以上分類并無嚴格的區(qū)分界線,PCR與熒光檢測常同時使用,它們已成為基因分型最基本的方法?，F(xiàn)在至少存在20多種SNP分型方法,有些新方法具有操作簡單。易于自動化的優(yōu)點但其高額的成本以及昂貴的檢測系統(tǒng)是許多實驗室所無法承擔的,限制了廣泛使用,但由于人類基因組測序完成,需進行大量基因組SNP研究,必須發(fā)展高通量SNP分型技術。如一年分析1000個樣品,10萬個SNP,每天要有大于30萬基因型通量
五、數(shù)據(jù)庫
人們對SNP的研究方法進行了許多探索和改進。SNP分析技術按其研究對象主要分為兩大類。①對未知SNP進行分析,即找尋未知的SNP或確定某一未知SNP與某遺傳病的關系。檢測未知SNP有許多種方法可以使用,如溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)、變性的高效液相色譜檢測( DHPLC)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)等,但這些方法只能發(fā)現(xiàn)含有SNP的DNA鏈,不能確知突變的位置和堿基類別,要想做到這一點,必須對那些含有SNP的DNA鏈進行測序。在法醫(yī)學中,可以通過搜索檢測帶有SNP的DNA鏈,來確定物證的基因型,進而來排除嫌疑人等。②對已知SNP進行分析,即對不同群體SNP遺傳多樣性檢測或在臨床上對已知致病基因的遺傳病進行基因診斷。篩查已知SNP的方法有等位基因特異寡核苷酸片段分析(ASO)、突變錯配擴增檢驗(MAMA)、基因芯片技術( gene chips)等。由于人類基因工程的帶動,許多物種都已開始了基因組的項目,并建立了大量數(shù)據(jù)庫(見表13-8),比較這些來自不同實驗室不同個體的序列,就可以檢測到SNP。
六、應用
SNP自身的特性決定了它更適合于對復雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識別等方面的研究
1.醫(yī)學方面的應用
據(jù)美國1994年的報告,因藥物副作用而入院的患者達200萬人,因藥物副作用而死亡的人數(shù)達10萬人,占死亡原因的第4位,比因交通事故死亡的人數(shù)還多得多。因此,通過對不同個體的藥物代謝相關酶、轉運因子、藥物作用靶點的基因多態(tài)性研究,在分子診斷學水平上建立基因分型方法,在治療患者的各種疾病前,進行個體SNP分型,來更精確地選擇適當?shù)乃幬?、減少不良反應的發(fā)生,是預防毒副作用并提高藥物療效的關鍵。而人類基因組之間的單個核苷酸的不同,就決定了疾病易感性、保護人體免受疾病侵害、在疾病發(fā)作時耐受疾病的能力不同,因此,這些信息在醫(yī)學研究中有巨大的潛力。
(1)疾病基因、易感基因的定位通過對比健康和患病人群SNP發(fā)生頻率的差異,確定SNP與疾病之間的相關性,或者比較高危人群與低發(fā)人群SNP的差異,就可以鑒別出哪些SNP和哪些疾病有關。應用高密度的SNP圖譜,用相關分析的方法來定位一系列多基因疾病,諸如癌癥、糖尿病、高血壓、憂郁癥和哮喘等復雜疾病的主基因及尋找疾病易感性的遺傳標記目前30個以上的疾病基因是直接依據(jù)已獲得的公開的基因組序列而定位克隆的,如神經(jīng)遞質(zhì)受體和生長因子的發(fā)現(xiàn)、阿爾奇海默癥和帕金森癥的基因定位等。目前在單個SNP與疾病相關性的檢測方面報道的較多,大規(guī)?；蛉蚪M范圍內(nèi)檢測SNP與疾病相關性的報道較少。高建平等應用自動實時熒光技術,分析了78例肝癌患者和112例健康志愿者N乙酰基轉移酶(NAT2)4個位點的基因多態(tài)性,探討NAT2基因多態(tài)性與肝癌易感性的關系,結果表明攜帶NAT2慢乙?；蛐偷奈鼰熣呖赡苁歉伟┑母呶Ｈ巳骸１茄拾┦俏覈鴱V東地區(qū)高發(fā)性的腫瘤,我國國家基因組南方中心已對鼻咽癌等多種疾病展開深入研究,建立了家系收集網(wǎng)絡,取得了一定進展。Tx是來自鼻咽癌細胞株CNE2的轉化基因克隆,冷曙光在癌基因組剖析計劃數(shù)據(jù)庫中進行生物信息學分析,確定其存在SNP位點,并預測出8個候選SNP位點,采用變性高壓液相色譜分析了80名健康個體與82名鼻咽癌患者基因組中這些確定位點的分布,結果顯示鼻咽癌患者中雜合型(GC/CG)頻率(52.44%)顯著高于健康個體(33.75%),而純合型(GG)頻率(31.70%)則低于健康個體(56.25%),由此推論Tx雜合型可能是鼻咽癌的危險因子目前已有實驗將SNP應用于腫瘤預后及易感性的判斷,例如肺癌致癌物的易感性存在個體差異對此研究較多的有代謝酶基因多態(tài)性,如I相代謝酶人細胞色素P450CYP450和髓過氧化酶MPO)等,研究證實MPO基因啟動子(-463G>A)多態(tài)性導致該基因較低的表達,可以降低肺癌患病的危險性。另外日本學者還發(fā)現(xiàn)了HER2基因編碼區(qū)的一個SNP與胃癌的發(fā)展及惡性程度有關{。阮黎等運用 PCR-RFLP方法,檢測血液標本中鈣粘連素(CDH1)基因啟動子上游一160處C/A的SNP,探討膀胱移行細胞癌(TCCB)E鈣粘連素(CDH1)基因啟動子一160處C/A單核苷酸多態(tài)性與TCCB復發(fā)及低分化的關系,結果顯示:CDH1基因啟動子160處SNP對膀胱移行細胞癌的復發(fā)可能具有重要作用,檢測該SNP也可作為一種預測患者術后復發(fā)的指標聊。蘇湛等采用引物引人限制性內(nèi)切酶分析( PIRA-PER)、四引物擴增阻滯突變系統(tǒng)以及單鏈構象多態(tài)性技術,對100名正常人和88例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者bcl-2基因的3個SNP位點( dbsNP:rsl800477,rsl801018.rs1564483),belx基因的3個SNP位點(dbSNP:rs6060900,rs6089046,rs5841091)及bax基因的1個微衛(wèi)星位點進行了分析,結果表明bet2基因rs1800477和rs1564483二位點多態(tài)性可能與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關)。周晶等應用自動測序儀對106名中國漢族非親緣關系人的生長激素受體(GHR)基因部分外顯子進行序列測定,觀察這些SNP在漢族人群中的分布,結果顯示出生長激素受體基因SNP呈不均勻分布且具有種族差異性。王?？〉韧ㄟ^選擇184名重度肥胖和184名低體重青少年,對促生長激素分泌素受體(GHSR)基因兩個單核苷酸多態(tài)性進行快速高通量基因型分析,來了解GHSR基因多態(tài)性與青少年肥胖的關系,結果未發(fā)現(xiàn)該人群中GHSR基因2個多態(tài)性與青少年肥胖有關聯(lián),李義等通過公共SNP數(shù)據(jù)庫和對樣本庫全基因測序?qū)ふ襍NP位點的途徑,在定位區(qū)域內(nèi)選擇了33個候選基因中的124個SNP位點,用測序法對236例北方漢族散發(fā)Ⅱ型糖尿病患者及152例正常對照個體進行SNP基因分型及病例對照關聯(lián)分析,并對具顯著性差異的SNP位點進行單倍型分析,發(fā)現(xiàn)SAC,PANK4和CASP9基因為中國北方漢族人群Ⅱ型糖尿病候選易感基因,由此推論這3個基因可能在Ⅱ型糖尿病易感性上有協(xié)同作用。隨著高自動化、高通量高準確性和低成本SNP檢測技術的發(fā)展,Zhou等利用兩條常染色體上的20個SNP,使用熒光定量PCR的方法,檢測早期結腸癌患者的等位位點來判斷病人預后。 Mohammad等利用高密度SNP芯片(包含近1500個SNP)分析,在全基因組范圍內(nèi)檢測了膀胱癌患者的SNP發(fā)生情況,這種全基因組范圍內(nèi)的SNP分析具有潛在的預后和診斷價值。
通過基因易感性的分析,能夠確認特定疾病的好發(fā)性人群,從而對該人群進行生活或飲食方式的干預,促進其健康
(2)藥靶的研究人類遺傳性的疾病達到了8000多種,而目前市場上存在的所有的藥靶不到500個,則,一且了解了全部人類基因和蛋白質(zhì),將大大擴展所適合的藥靶范圍,即使是一小部分基因或基因表達產(chǎn)物被證明可以作為藥靶,預期藥靶數(shù)目也會超過幾千個
2.法醫(yī)學
法醫(yī)學中生物檢材的個人認定正是利用人類群體具有高度的DNA多態(tài)性作為工具進行的,從最早的RFLP技術到現(xiàn)在大多數(shù)法醫(yī)DNA實驗室廣泛使用的STR基因分型技術,都存在不足之處。特別是當遇有髙度腐敗、降解、陳舊檢材和小片段DNA不能進行STR擴增,這時就可進行SNPs檢測,為個體識別提供有效的方法
SNP用于法醫(yī)學主要有三方面優(yōu)勢:①低突變率,穩(wěn)定遺傳,有利于個體識別和親權鑒定;②雙等位基因變化,可用高通量的方法自動分型,易于建立“罪犯DNA數(shù)據(jù)庫”;③Y染色體SNP較敏感,可用于種族起源預測和男性鑒定。有作者采用寡核苷酸連接分析( PCR -OLA)測定含有20個常見SNP的PCR擴增片段作基因分型,這種分型可以采用比色分光光度方法,并自動化完成,因而能在較大群體中進行。
單核甘酸多態(tài)性(SNP)對于法醫(yī)學提出的特殊問題不只是由于結果與目前構成國家數(shù)據(jù)庫的STR圖譜不相容。而且,在法醫(yī)學中個性化是必要的,因此每一種樣品都需要對數(shù)百種SNP進行分析,因為每一樣品就本身而言可能僅僅是雙態(tài)的。使人感興趣的是因為許多雙態(tài)位點在人群中很普遍,所以一個隨機個體與現(xiàn)場犯罪材料有相同的SNP圖譜的統(tǒng)計學概率實際上很高現(xiàn)在一致公認的原則是:從倫理學上考慮,只能使用非編碼區(qū)DNA進行法醫(yī)案件的調(diào)查,以防止無意中了解一個人對某種疾病的易感性。目前正在建立用于臨床診斷的SNP數(shù)定會吸引法醫(yī)科學家使用這些現(xiàn)成的數(shù)據(jù)庫,這在將來可能引起倫理的反對。這種進步必將導致驗室的完全自動化,可以預見不久的將來,從接收到提取、定量、擴增到結果的分析、解釋將實現(xiàn)全面自動化;進一步研究把實驗室過程微型化為可移動的系統(tǒng),這種系統(tǒng)需要把富含PCR產(chǎn)物的區(qū)域與樣品輸入的區(qū)域分離。任何背離已經(jīng)建立的原則都將導致對結果的可靠性的質(zhì)疑犯罪審判系統(tǒng)順應出現(xiàn)的新技術將是一項艱巨的任務,維護證據(jù)的保護措施是很重要的
