有時(shí)候跟非藥學(xué)專業(yè)的同學(xué)聊天，他們會(huì)問我做新藥難不難。我可以羅列一堆臨床試驗(yàn)成功率數(shù)據(jù)來論證做新藥有多艱難，不過拿PARP抑制劑的研發(fā)過程來舉個(gè)例子更合適不過了。
PARP的全稱是多聚ADP核糖多聚酶，上世紀(jì)60年代就被發(fā)現(xiàn)，但直到80年代初期通過化學(xué)探針抑制酶活性才確定了該酶的功能。科學(xué)家們?cè)缭趲资昵熬烷_始嘗試研發(fā)靶向PARP酶家族的藥物，之后對(duì)PARP抑制劑主要作用機(jī)制的理解則不斷深入。
科研人員最初認(rèn)為PAPP抑制劑的藥效是單純的通過抑制PARP催化活性產(chǎn)生的，使DNA單鏈損傷無法得到修復(fù)，而DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的復(fù)制叉行進(jìn)至PARP結(jié)合的損傷位點(diǎn)時(shí)，可能會(huì)引起復(fù)制叉被破壞進(jìn)而引起DNA雙鏈損傷，從而引發(fā)DNA損傷反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 [1]。
但最近幾年的多項(xiàng)研究表明，一些PARP抑制劑能夠使PARP1無法從DNA損傷位點(diǎn)脫離，影響PARP1酶的催化循環(huán)過程，進(jìn)而影響DNA穩(wěn)定性并導(dǎo)致細(xì)胞毒性作用 [2-4]。這種作用機(jī)制與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的作用機(jī)制比較類似，該酶抑制劑的作用機(jī)制同樣是使DNA修復(fù)蛋白無法從雙鏈DNA上脫離。
依據(jù)PARP抑制劑的藥理機(jī)制，科學(xué)家們提出了PARP抑制劑在腫瘤領(lǐng)域的兩種臨床應(yīng)用策略。
第一種策略是PARP抑制劑與化療藥物聯(lián)用治療各種類型的癌癥，該策略如果成功毫無疑問將會(huì)帶來巨額的商業(yè)利潤，因此制藥公司開始投入巨額經(jīng)費(fèi)研究PARP抑制劑與各種化療藥物的聯(lián)用。但科研人員在研究過程中發(fā)現(xiàn)化療與PAPP抑制劑聯(lián)用的毒性太大，兩類藥物產(chǎn)生的協(xié)同作用可以產(chǎn)生嚴(yán)重的骨髓抑制，很難找到PAPR抑制劑與化療藥物聯(lián)用的安全藥物劑量。
另一種策略是基于合成致死（synthetic lethality）的理念。Synthetic lethality經(jīng)常被翻譯為合成致死，個(gè)人認(rèn)為翻譯為協(xié)同致死或者綜合致死可能更為貼切，但出于閱讀習(xí)慣考慮，本文沿用合成致死。這個(gè)策略的出發(fā)點(diǎn)是：單個(gè)基因突變不會(huì)對(duì)細(xì)胞生存產(chǎn)生明顯影響，但兩種關(guān)鍵基因損傷同時(shí)發(fā)生會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
腫瘤細(xì)胞具有兩種DNA損傷修復(fù)能力，一種是修復(fù)雙鏈DNA斷裂的同源重組 (HR) 修復(fù)，另一種是PARP參與的單鏈DNA修復(fù)。如果同時(shí)削弱腫瘤細(xì)胞的兩種DNA損傷修復(fù)機(jī)制可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這正是合成致死理念的最好詮釋。
這也意味著如果腫瘤細(xì)胞HR修復(fù)功能本身就存在問題，那么PARP抑制劑就可以作為單藥使用。而在此之前科學(xué)家們就發(fā)現(xiàn)存在BRCA突變的腫瘤細(xì)胞HR修復(fù)功能會(huì)存在缺陷。2005年Nature同期發(fā)表了兩篇文章證實(shí)了存在BRCA突變的腫瘤細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑非常敏感 [5-6]。該研究也引發(fā)了PARP抑制劑研究的第二輪熱潮。
by Jerry
與聯(lián)合化療的方案相同，合成致死策略的早期臨床研究并沒有獲得積極的療效數(shù)據(jù)，導(dǎo)致PARP抑制劑的兩種臨床應(yīng)用之路在當(dāng)時(shí)看來似乎都行不通。不過進(jìn)行臨床前動(dòng)物模型研究的科研人員也發(fā)現(xiàn)，PARP抑制劑與化療聯(lián)用和單藥使用時(shí)的作用模式存在明顯差別。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，如果PARP抑制劑聯(lián)用某種DNA損傷藥物，PARP抑制劑的給藥劑量必須非常低，而且用藥周期必須很短，否則會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡。而如果單獨(dú)使用PARP抑制劑的話，給藥劑量必須非常高，而且必須保證足夠長的用藥周期才能抑制腫瘤的生長。
換句話說，第二種策略是單獨(dú)用藥，安全性不存在問題，理論上可行性更高。只不過科研人員最初在單獨(dú)使用PARP抑制劑時(shí)，給藥劑量是參照與化療聯(lián)用時(shí)使用的劑量，認(rèn)為低劑量及短期給藥就足以發(fā)揮藥效。由于當(dāng)時(shí)人們并不知道如何合理使用該類抑制劑，由此導(dǎo)致臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)上存在缺陷，試驗(yàn)失敗也是情理之中的事情。
I
波 折
PARP抑制劑的研發(fā)過程真可謂是一波三折，雖然對(duì)于用藥劑量問題的研究已經(jīng)比較深入，但接下來的臨床開發(fā)依然十分不順利。該類藥物開發(fā)過程中最重大的挫折來源于BiPar Sciences開發(fā)的抑制劑BSI-201。2009年4月賽諾菲以大約5億美金的價(jià)格收購BiPar Sciences獲得了該藥的權(quán)益。賽諾菲當(dāng)時(shí)以為自己撿了個(gè)大便宜，很快在ASCO2009大會(huì)上公布了該藥 (后更名為iniparib) 的II期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，稱iniparib聯(lián)合吉西他濱和卡鉑能夠延長三陰乳腺癌患者的生存期，而且PARP抑制劑的聯(lián)用方案并沒有產(chǎn)生明顯安全性問題。2010年，賽諾菲又在ESMO會(huì)議上公布了該試驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)，稱該聯(lián)用方案可以使患者的生存期延長近5個(gè)月。
但接下來發(fā)生的事情卻讓賽諾菲高興不起來了。2011年初，賽諾菲宣布iniparib在一項(xiàng)III期試驗(yàn)中無法延長三陰乳腺癌患者的生存期 。由于iniparib之前的影響力太大，該結(jié)果的公布瞬間澆滅了整個(gè)制藥行業(yè)對(duì)PARP抑制劑的開發(fā)熱情。
阿斯利康在同一時(shí)間宣布停止自己PARP抑制劑olaparib用于BRCA陽性乳腺癌患者的開發(fā)。而且在2011年末，阿斯利康宣布olaparib一項(xiàng)針對(duì)卵巢癌患者的II期臨床試驗(yàn)失敗，選擇停止該適應(yīng)癥的開發(fā)。數(shù)據(jù)顯示雖然olaparib能夠延緩卵巢癌患者疾病進(jìn)展，但無法延長患者生存期。
在同一時(shí)間，輝瑞將自家的rucaparib賣給了Clovis Oncology，而默克也在2012年將niraparib賣給了Tesaro。由于存在太多的不確定性，大多數(shù)制藥公司不太愿意再啟動(dòng)新的臨床研究。
然而，2012年拉瓦爾大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的Kaufmann發(fā)表文章稱賽諾菲的iniparib并不是真正的PARP抑制劑 [7]?？梢哉f這一發(fā)現(xiàn)讓腫瘤學(xué)家和投資人倍感欣慰，因?yàn)楹茉缰八麄兙陀X得iniparib的臨床數(shù)據(jù)非常奇怪，與其他多個(gè)PARP抑制劑的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并不一致，而且臨床研究中iniparib聯(lián)用卡鉑和吉西他濱并不會(huì)產(chǎn)生明顯的骨髓抑制現(xiàn)象。但由于賽諾菲和BiPar當(dāng)時(shí)沒有公開臨床研究過程中的的用藥劑量等關(guān)鍵數(shù)據(jù)，因此科學(xué)家們也沒有確認(rèn)iniparib的體外活性。
其實(shí)Clovis Oncology在購買輝瑞的rucaparib權(quán)益之前了解到iniparib不會(huì)產(chǎn)生骨髓抑制作用，他們就開始懷疑iniparib不是真正的PARP抑制劑，這也可能是Clovis Oncology果斷從輝瑞購買rucaparib繼續(xù)開發(fā)的原因。
2012年末，阿斯利康在對(duì)olaparib卵巢癌II期臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析之后發(fā)現(xiàn)，部分患者使用olaparib后確實(shí)能夠產(chǎn)生明顯獲益，隨即在ASCO2013大會(huì)上公布了回顧性分析結(jié)果——攜帶BRCA突變的卵巢癌患者相比不攜帶突變患者對(duì)olaparib的響應(yīng)率更高，而且相比安慰劑組，攜帶突變的患者能夠使PFS（無進(jìn)展生存期）延長6.9個(gè)月。更重要的是，攜帶BRCA突變并使用Olaparib的患者相比安慰劑組可使生存期延長3個(gè)月。受以上數(shù)據(jù)的鼓舞，阿斯利康2013年下半年啟動(dòng)了兩項(xiàng)III期研究以評(píng)價(jià)olaparib單藥維持治療攜帶BRCA突變的卵巢癌患者的療效。
2014年12月21日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)olaparib上市用于既往經(jīng)至少3次化療治療失敗的BRCA胚系突變晚期卵巢癌患者的治療。2016年12月19日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Clovis的PARP抑制劑rucaparib上市，用于治療已接受兩種及以上化療方案的且存在胚系或者體細(xì)胞BRCA基因突變的晚期卵巢癌患者的治療。
盡管早期的臨床研究主要集中于對(duì)存在BRCA胚系突變的腫瘤的有效性研究上，但后來發(fā)現(xiàn)不攜帶該類突變的患者也能夠產(chǎn)生應(yīng)答 [9]。其實(shí)從PARP抑制劑和合成致死的作用機(jī)制的角度很容易解釋這一現(xiàn)象。
PARP抑制劑可以抑制PAPR的催化循環(huán)過程，使PARP無法從已結(jié)合的DNA上脫離，由此引發(fā)DNA損傷反應(yīng) (DDR)，而BRCA1/2 參與的同源重組修復(fù) (HRR)是DDR中最佳的DNA修復(fù)手段，能夠有效修復(fù)和重啟由于PARP抑制劑引發(fā)的復(fù)制叉行進(jìn)中止。如果HRR機(jī)制存在缺陷的話將有可能產(chǎn)生合成致死效應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。然而BRCA1/2 并不是HRR機(jī)制中唯一的重要組分，參與編碼同源重組修復(fù)通路中的其他重要蛋白的基因突變也有可能引發(fā)HRR機(jī)制缺陷，產(chǎn)生合成致死。因此理論上來講BRCA1/2并不是PARP抑制劑的唯一生物標(biāo)志物 (biomarker)。
最終，臨床試驗(yàn)也證實(shí)了PARP抑制劑的有效性并不局限于BRCA基因突變。因此FDA在今年3月27日批準(zhǔn)Tesaro公司的niraparib上市，用于接收鉑類藥物治療后完全應(yīng)答或部分應(yīng)答但又疾病復(fù)發(fā)的成人卵巢上皮癌、輸卵管癌和原發(fā)性腹膜癌患者的維持治療。8月17日，olaparib與niraparib相同的適應(yīng)癥獲得FDA批準(zhǔn)。
其實(shí)PAPR抑制劑有效性超越BRCA基因突變局限性這一理念的驗(yàn)證，不僅擴(kuò)大了PARP抑制劑的應(yīng)用范圍，也同時(shí)帶動(dòng)了PARP抑制劑生物標(biāo)志物的研究以及恢復(fù)了科研人員對(duì)整個(gè)合成致死領(lǐng)域研究的信心。
II
合成致死的復(fù)興
當(dāng)前主流的腫瘤靶向藥物的開發(fā)主要是基于原癌基因成癮性 (oncogene addiction）的機(jī)制來研發(fā)的，也就是說通過抑制腫瘤生長依賴的原癌基因或者相關(guān)通路來研發(fā)藥物。盡管這些藥物對(duì)某些類型的腫瘤有效，但并不是所有腫瘤都攜帶具有成藥性的功能獲得性原癌基因突變，這些腫瘤中攜帶的非原癌基因突變可能與其他腫瘤特異性基因突變相互作用，兩類基因同時(shí)抑制時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生合成致死效應(yīng)，因此合成致死理念的應(yīng)用可大范圍的擴(kuò)展抗腫瘤藥物研發(fā)的潛在靶標(biāo)。
但由于PARP抑制劑開發(fā)過程中的波折，尤其是iniparib烏龍事件的影響，即使在olaparib獲批上市之后，制藥行業(yè)對(duì)于基于合成致死理念的新藥研發(fā)熱情依然不高。除了iniparib的影響，該領(lǐng)域研究進(jìn)展比較緩慢的一個(gè)非常重要的原因是缺乏高效的研究工具。
直到最近幾年，制藥公司和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)的研究人員一直在使用RNAi技術(shù)來尋找抗腫瘤藥物靶點(diǎn)，通過大批量篩選能夠抑制基因表達(dá)的siRNA/短發(fā)夾RNA干擾文庫來篩選能夠產(chǎn)生合成致死作用的基因。但RNAi技術(shù)存在一個(gè)致命的缺陷：脫靶效應(yīng)太強(qiáng)?；赗NAi技術(shù)的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虍a(chǎn)生大量的假陽性結(jié)果，因此使靶點(diǎn)的驗(yàn)證變得非常困難。這也是很多專注于合成致死領(lǐng)域研究的生物制藥公司始終沒能取得很大進(jìn)展的主要原因之一。
但最近一兩年內(nèi)出現(xiàn)了另一批專注于合成致死領(lǐng)域的生物制藥公司，這些公司使用的是比RNAi高效的多的研究工具: CRISPR。自從2013年CRISPR基因編輯工具誕生以來，該技術(shù)對(duì)基礎(chǔ)科研，農(nóng)業(yè)，醫(yī)藥等領(lǐng)域產(chǎn)生了極大的影響。筆者在之前的文章里非常詳細(xì)地介紹了該技術(shù)的基礎(chǔ)概念，發(fā)展過程以及對(duì)多個(gè)領(lǐng)域的影響（見：為什么CRISPR必須拿諾獎(jiǎng)？（上）；為什么CRISPR必須拿諾獎(jiǎng)？（下）)。通過CRISPR gRNA分子庫來尋找能夠產(chǎn)生合成致死相互作用基因也成了該類公司融資的基礎(chǔ)。
今年6月Repare首輪融資6800萬美金，這應(yīng)該是2017年上半年生物制藥行業(yè)金額最大的一筆早期融資。上個(gè)月KSQ Therapeutics融資7600萬美金，部分資金將用于合成致死藥物靶點(diǎn)的研究。
學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)和制藥公司的科研人員通常使用兩種基于CRISPR技術(shù)的策略來篩選合成致死藥物靶點(diǎn)。第一種是使用CRISPR gRNA分子庫對(duì)細(xì)胞關(guān)鍵基因逐個(gè)進(jìn)行敲除，并與未進(jìn)行基因敲除的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，尋找能夠影響細(xì)胞功能的基因。而另一種策略是使用的是包含或者不包含已知的合成致死相關(guān)基因突變 (比如BRCA基因突變) 的兩種細(xì)胞株，使用CRISPR分子庫逐個(gè)敲除兩種細(xì)胞株的基因，通過對(duì)比兩類細(xì)胞基因敲除之后的影響來篩選靶點(diǎn)。
以上兩種方法相比RNAi技術(shù)都能獲得更優(yōu)質(zhì)的藥物靶點(diǎn)，但在技術(shù)的具體應(yīng)用過程中每個(gè)公司都各有不同。例如Tango公司首先會(huì)尋找一部分病人，并使用與每位病人基因相匹配的細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用經(jīng)過成藥性優(yōu)化的CRISPR gRNA分子庫 (只篩選可能成藥的基因靶標(biāo)) 來獲得藥物靶點(diǎn)。而KSQ則是對(duì)將近600多個(gè)細(xì)胞株的全基因組基因逐個(gè)進(jìn)行敲除 (人大約有19000個(gè)基因，這種敲除效率在CRISPR出現(xiàn)之前是無法想象的)，從而獲得大量的基因敲除對(duì)細(xì)胞功能影響的數(shù)據(jù)。
盡管CRISPR技術(shù)極其高效，但并非完美無缺，其中最重要的一點(diǎn)是基因敲除與使用RNAi進(jìn)行基因沉默以及通過小分子抑制蛋白功能產(chǎn)生的效應(yīng)可能完全不同，因此如何對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解讀變得十分重要。而且合成致死相互作用的篩選也存在諸多問題，比如很多合成致死相互作用是條件依賴性的，在細(xì)胞環(huán)境改變之后其相互作用可能消失。
無論是CRISPR技術(shù)還是RNAi，都是通過細(xì)胞水平的功能研究來獲得藥物靶點(diǎn)，細(xì)胞水平的功能影響并不一定意味著能夠?qū)φw動(dòng)物或者人體中的腫瘤產(chǎn)生影響，即使獲得了大量的潛在藥物靶點(diǎn)，也必須經(jīng)過繁瑣的進(jìn)一步靶點(diǎn)驗(yàn)證過程，基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)合成研究過程，以及臨床試驗(yàn)研究。尋找藥物靶點(diǎn)只是萬里長征的第一步。
近兩年合成致死領(lǐng)域的生物技術(shù)公司融資情況
III
未 來
近幾年，腫瘤免疫療法的迅速發(fā)展已經(jīng)對(duì)抗腫瘤領(lǐng)域的新藥研發(fā)產(chǎn)生了極大影響。幾乎每一個(gè)涉足抗腫瘤新藥領(lǐng)域的制藥公司都不得不去考慮現(xiàn)有療法如何與已上市的腫瘤免疫療法聯(lián)用。
存在BRCA1/2突變以及HRR缺陷的腫瘤通常具有更高的突變率，因此可能產(chǎn)生更多的新抗原 (neo-antigen)，從而引發(fā)更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。所以理論上來講，PARP抑制劑或DNA損傷抑制劑聯(lián)用PD-1或者CTLA-4抑制劑治療存在HRR缺陷的腫瘤能夠提高藥物療效/患者響應(yīng)率 [9-10]。而且有研究顯示BRCA缺陷能夠引發(fā)STING依賴性的固有免疫應(yīng)答，這也為PARPi/腫瘤免疫療法提供了依據(jù) [11]。
盡管PARP抑制劑/腫瘤免疫療法聯(lián)用理論上可行，而且已有制藥公司開始進(jìn)行該方面的臨床研究（例如NCT02734004，臨床1/2期，olaparib/durvalumab），但仍然需要經(jīng)歷漫長的臨床研究才能確定該策略的有效性與安全性。早期PARP抑制劑/化療聯(lián)用臨床研究的失?。ɑ?PARP抑制劑聯(lián)用從理論機(jī)制上講更加合理）也提醒我們不應(yīng)該過度的樂觀 [12]。
國內(nèi)做PARP抑制劑的制藥公司以及學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)也非常多，進(jìn)入臨床的包括百濟(jì)神州的BGB-290，恒瑞的SHR-3162等等，需要指出的是不同結(jié)構(gòu)的PARP抑制劑療效和作用機(jī)制差別可能會(huì)特別大。
國內(nèi)注冊(cè)申報(bào)的PARP抑制劑
來源：醫(yī)藥魔方發(fā)現(xiàn)
PARP抑制劑不僅能夠抑制該蛋白的活性，更重要的是能夠抑制PAPR從DNA上脫離，而不同的抑制劑這兩方面性質(zhì)可能存在明顯差異。例如臨床研究中使用替莫唑胺 /veliparib聯(lián)用，理論上來說PARP抑制劑可以通過抑制PARP的DNA脫離來增強(qiáng)DNA烷化劑替莫唑胺的DNA損傷作用，但是由于veliparib抑制PAPR蛋白DNA脫離的作用非常弱，所以導(dǎo)致veliparib無法提高替莫唑胺的療效 [13]。
我的同學(xué)當(dāng)中也有人在做PARP抑制劑，其實(shí)從某種層面上來講做藥化方面的研究并不是一件容易的事情，有些化合物的合成過程本身就讓人非常頭疼，經(jīng)過一兩年的折騰合成出幾十個(gè)化合物之后，幾輪篩選和結(jié)構(gòu)優(yōu)化也難找到活性高選擇性好的小分子。即使得到活性比較好的化合物，后續(xù)的細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物模型安全性有效性實(shí)驗(yàn)的過程中也存在重重障礙，ADMET性質(zhì)的優(yōu)化也會(huì)很讓人崩潰。
對(duì)于PARP抑制劑來說臨床研究則更加困難，從化療聯(lián)用以及2005年Nature文章[5-6] 驗(yàn)證的PARP抑制劑/BRCA合成致死理念到olaparib的上市總共花費(fèi)了超過10年的時(shí)間。10年之后我們才逐漸理解臨床中如何合理的應(yīng)用PARP抑制劑。我們很難預(yù)計(jì)該領(lǐng)域未來還會(huì)遇到多少阻礙，但借用我導(dǎo)師的一句口頭禪——Always hope for the best.
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