本周的《自然》有篇神奇的文章，點進去一看版都沒排就發(fā)布了。再仔細看，從接收到在線發(fā)表，也就用了一個月！看看內(nèi)容，其實對為啥這么著急發(fā)布也不難理解。畢竟炙手可熱的CRISPR獲得了一個質(zhì)的飛躍，這么重磅的消息，換誰誰不急啊！
這篇文章來自博德研究所（Broad Insititude）的大牛David Liu。這位在CRISPR領(lǐng)域頗有建樹的年輕科學家，此次為我們帶來了全新的進化版Cas酶——xCas9[1]，比起目前使用最廣泛的spCas9，xCas9在轉(zhuǎn)錄激活、DNA剪切、單堿基編輯等方面的應(yīng)用范圍擴大了四倍！這意味著，利用CRISPR-Cas9對目前已知致病突變修改的可能，從原來的不到三成猛漲到七成以上！與此同時，令研究者喜出望外的是，xCas9的脫靶效應(yīng)比spCas9低得多得多，部分序列的試驗數(shù)據(jù)僅有原始版的1/100！
這是我們認知范圍里，能夠應(yīng)用在哺乳動物細胞中的、適用范圍最廣泛的Cas9變體，也是首次實現(xiàn)了適用范圍、DNA特異性、剪切活性的全面提升。
劉大衛(wèi)老師！迷妹呼喚你趕緊拍新宣傳照！起碼要趕上刷nature的頻率啊！
要想說清楚xCas9為啥這么厲害，還得從Cas酶的限制說起。
大家都知道，CRISPR/Cas系統(tǒng)原本是原核生物為了應(yīng)付外源遺傳物質(zhì)入侵的一種防衛(wèi)機制，所謂的CRISPR序列，就是敵人的“黑名單”。每當有一個新的敵人入侵，CRISPR/Cas系統(tǒng)就會剪下它的一段基因作為“身份證”，插入CRISPR序列中保存起來，以備下一次敵襲。我們科學家也正是利用CRISPR/Cas系統(tǒng)的這個特點來實現(xiàn)對目標基因的剪切和替換。
但是啊，這段剪下來的“身份證”可不是隨意選擇的，它們的附近往往具有一段特殊的序列，我們把它叫做原間隔序列臨近基序（PAM）。這段序列根據(jù)Cas酶的種類不同而有所不同，像現(xiàn)在科學家最常使用、最成熟的spCas9，主要識別的就是NGG序列（N指任意堿基）。spCas9也是目前PAM適用最廣泛的Cas酶。
這個最廣泛有多廣泛？我們簡單計算一下，DNA存在四種堿基，NGG出現(xiàn)的可能性只有十六分之一！對于沉默特定基因來說，這個范圍差不多夠用了，但是近年來，單堿基編輯技術(shù)不斷走向成熟，這項技術(shù)要求PAM位于目標堿基的15±2個核苷酸范圍內(nèi)[2,3]，spCas9顯然不能滿足研究者的需求。而且如果能夠進一步把PAM適應(yīng)范圍擴大，讓其落在DNA同源重組位點附近，重組效率也能夠獲得一定的提升[4,5]。
想要改變Cas酶的功能就要改變蛋白的結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)實驗室方法是在蛋白的編碼序列中人為制造突變，再進行功能篩查。但是想一想，這效率也太低了，一個個合成再篩選得篩到哪年去，累死科學家啊。
David Liu不怕，他有個獨門殺器，噬菌體輔助持續(xù)進化器（PACE）[6]！簡單來說，就是把需要突變的蛋白基因序列放進噬菌體基因組，利用噬菌體生命周期短暫的特點，進行大批量持續(xù)性的突變。噬菌體所寄宿的大腸桿菌內(nèi)含有誘導突變的質(zhì)粒，能夠加速突變的發(fā)生。噬菌體最短十分種就能傳代一次，一周內(nèi)就能夠?qū)崿F(xiàn)成百上千次的傳代變異，還完全不用科學家插手，比傳統(tǒng)方法效率提高了100倍。
在編碼的時候，把Cas酶編碼成噬菌體存活的必需基因，這樣就可以利用其生命周期自動篩選掉沒有表達的噬菌體了
利用這個獨門殺器，研究者們很快篩選出了一批PAM適用更廣泛的Cas酶——xCas9，其中xCas9（3.7）效果最好，xCas9（3.6）次之。
研究者決定對xCas9的真本事在人細胞中做一下測試。在激活轉(zhuǎn)錄這一點上，可以說xCas9（3.7）簡直完勝，針對各PAM效率比spCas9高出數(shù)倍不止；切割DNA的能力，xCas9也完全沒在怕的，spCas9的老強項NGG上已經(jīng)贏過一頭，對spCas9無能為力的NG、GAA、GAT上均表現(xiàn)出了不俗的能力。這意味著，如果使用xCas9，CRISPR/Cas系統(tǒng)的適用范圍至少擴大了四倍！
轉(zhuǎn)錄激活上xCas9（綠）完勝
DNA切割能力上xCas9也明顯更勝一籌
這個擴大的PAM范圍拿到單堿基編輯上，則更令科學家們振奮了，畢竟目前為止，單堿基編輯器還只限于NGG這一段PAM，能夠進行修改的序列很有限。xCas9到手，單堿基編輯的適用范圍也大大增加。
根據(jù)ClinVar數(shù)據(jù)庫[9]顯示，能夠利用C·G→T·A修正的致病突變共有4422個，原本單堿基編輯的適用范圍只有26%，xCas9使這個數(shù)字躍升到73%！同樣，能夠利用A·T→G·C修正的致病突變有14969個，修正可能從28%躍升到71%！
單堿基編輯的適用范圍也大大增加
PAM適用范圍擴大了這么多，CRISPR原本就是個問題的脫靶效應(yīng)想必更嚴重了吧。。。然而并沒有！研究者在對常見的幾條基因序列進行了模擬，發(fā)現(xiàn)xCas9（3.7）的脫靶效應(yīng)竟然遠低于spCas9！在EMX1序列中，spCas9的脫靶效應(yīng)接近百分之二十，xCas9（3.7）居然百分之百“命中紅心”；HEK site4和VEGFA這樣有名的復雜基因，xCas9（3.7）命中率也有4-9倍的提升，真是厲害了！
xCas9的脫靶效應(yīng)超乎意料的低
100%?。?！
遺憾的是，xCas9為什么實現(xiàn)更廣泛PAM 的同時，脫靶效應(yīng)還低了，這個問題并沒有得到解決，David Liu面對采訪坦然回答“不知道”。
Liu在采訪中指出，spCas9經(jīng)過多年的實驗驗證，但xCas9只經(jīng)過幾十個位點的測試，并不能百分百肯定xCas9就比spCas9更好（他謙虛了）。但不可否認的是，這種雙贏的局面十分驚人，已經(jīng)有科學家表示想要趕快在自己的實驗室中使用xCas9。
話說PACE這項技術(shù)也實在是很厲害，趕快拿來改造下其他的Cas酶，估計還有大發(fā)現(xiàn)！
參考資料：
[1] https://www.nature.com/articles/nature26155
[2] Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programm editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424, doi:10.1038/nature17946 (2016)
[3] Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464–471, doi:10.1038/nature24644(2017)
[4] Findlay, G. M., Boyle, E. A., Hause, R. J., Klein, J. C. & Shendure, J. Saturation editing of genomic regions by multiplex homology-directed repair. Nature 513,120–123, doi:10.1038/nature13695 (2014)
[5] Yang, L. et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing.Nucleic Acids Res 41, 9049–9061, doi:10.1093/nar/gkt555 (2013)
[6] https://www.nature.com/articles/nature09929
[7]http://www.sciencemag.org/news/2018/02/upgrade-makes-genome-editor-crispr-more-muscular-precise
[8] https://www.nature.com/articles/d41586-018-02540-x
[9]Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of relationships among sequence
variation and human phenotype. Nucleic Acids Res 42, D980–985,
doi:10.1093/nar/gkt1113 (2014).
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