天天天天操,2021久久天天躁狠狠躁夜夜

2021年2月12日，Cell雜志在線發(fā)表了來(lái)自中國(guó)科學(xué)院遺傳發(fā)育所高彩霞組發(fā)表題為“Genome engineering for crop improvement and future agriculture”的綜述文章。該綜述系統(tǒng)總結(jié)了CRISPR-Cas技術(shù)與現(xiàn)代育種方法的結(jié)合，將在作物改良計(jì)劃中發(fā)揮重要作用。此外，還描述了植物基因組編輯的當(dāng)前研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了使用這些技術(shù)可以產(chǎn)生的遺傳修飾，以及將植物基因組編輯作為下一代植物育種技術(shù)用于作物改良的應(yīng)用。

值得注意的是2020年11月6日，Nature Review Molecular Cell Biology雜志在線發(fā)表了來(lái)自中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞課題組題為“Applications of CRISPR–Cas in agriculture and plant biotechnology”的綜述文章。該文章首先重點(diǎn)介紹最新的精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)，例如堿基編輯和引導(dǎo)編輯系統(tǒng)。之后討論了CRISPR–Cas系統(tǒng)在提高植物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性和抗除草劑及繁殖和加速馴化中的作用。最后重點(diǎn)介紹CRISPR-Cas相關(guān)聯(lián)的植物生物技術(shù)的最新突破，包括CRISPR-Cas元件遞送，基因調(diào)控，多重基因編輯和誘變以及定向進(jìn)化技術(shù)Nat Rev（IF 55.4）高彩霞組綜述CRISPR/Cas在農(nóng)業(yè)和植物生物技術(shù)中的應(yīng)用，值得收藏。

此外，2019年該課題組在Annual Review of Plant Biology雜志發(fā)表題為“CRISPR/Cas Genome Editing and Precision Plant Breeding in Agriculture”的綜述文章。能夠連續(xù)在三大權(quán)威頂尖綜述雜志上發(fā)表關(guān)于基因編輯在農(nóng)業(yè)育種中應(yīng)用的綜述文章，也從另一個(gè)方面說(shuō)明了該課題組利用基因編輯在農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域上處在世界領(lǐng)先水平。為此，我們簡(jiǎn)單的對(duì)Cell這篇綜述進(jìn)行全文的翻譯，以饗讀者！

養(yǎng)活不斷增長(zhǎng)的人口是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，尤其是在氣候條件迅速變化的情況下?；蚪M編輯將徹底改變植物育種，并有助于確保全球糧食供應(yīng)。該文將重點(diǎn)介紹新開發(fā)的技術(shù)，同時(shí)回顧植物中基因組編輯工具的開發(fā)和應(yīng)用。并描述了基于基因組編輯的育種新植物的策略，并討論了它們對(duì)農(nóng)作物生產(chǎn)的影響，重點(diǎn)介紹了傳統(tǒng)育種無(wú)法實(shí)現(xiàn)的基于基因組編輯的植物改良的最新進(jìn)展。同時(shí)還討論了基因組編輯面臨的挑戰(zhàn)，在實(shí)現(xiàn)該技術(shù)對(duì)未來(lái)作物和糧食生產(chǎn)的全部潛力之前，必須克服哪些挑戰(zhàn)？

前言

到2050年，預(yù)計(jì)人口將達(dá)到100億。我們這個(gè)時(shí)代的主要挑戰(zhàn)是學(xué)習(xí)如何養(yǎng)活不斷增長(zhǎng)的人口并成功做到這一點(diǎn)。由于綠色革命和植物育種技術(shù)的進(jìn)步，目前的農(nóng)作物產(chǎn)量可以為大多數(shù)人口提供充足的糧食。然而，由于氣候變化和耕地有限，農(nóng)作物產(chǎn)量似乎處于停滯甚至下降的狀態(tài)。要養(yǎng)活100億全球人口，就需要將產(chǎn)量提高60％。因此，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率和可持續(xù)性對(duì)整個(gè)世界至關(guān)重要。迫切需要作物生產(chǎn)中的科學(xué)突破和技術(shù)創(chuàng)新，以確保未來(lái)的全球糧食安全。

遺傳變異是農(nóng)業(yè)改良的基礎(chǔ)。植物育種的目的是創(chuàng)造和利用這些遺傳變異。在植物育種的悠久歷史中，已使用了四種主要技術(shù)：雜交育種，突變育種，轉(zhuǎn)基因育種和通過(guò)基因組編輯育種。傳統(tǒng)的植物育種（雜交）涉及有針對(duì)性地雜交植物，以通過(guò)同源重組來(lái)結(jié)合理想的性狀，在提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力方面發(fā)揮了重要作用。1950年代末開始的第一次綠色革命就是這種策略的例證，其中將“矮化”基因突變雜交到主要的主要農(nóng)作物中，例如小麥（Triticum aestivum）和水稻（Oryza sativa），以獲得高產(chǎn)品種。但是，由于雜交育種只能用來(lái)引入親本基因組中已經(jīng)存在的性狀，因此優(yōu)良種質(zhì)的低遺傳變異性限制了該技術(shù)的使用（圖1）。在突變育種中，化學(xué)或輻射誘導(dǎo)的誘變被用于誘導(dǎo)全基因組范圍內(nèi)的隨機(jī)突變，從而大大擴(kuò)展了遺傳變異。但是，從大量誘變植物中鑒定出具有所需性狀的植株需要?jiǎng)趧?dòng)密集型且耗時(shí)的（圖1）。植物育種的關(guān)鍵突破是轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展，其中將來(lái)自其他生物的基因或性狀引入了農(nóng)作物，從而提高了產(chǎn)量，減少了農(nóng)藥的使用并改善了營(yíng)養(yǎng)。然而，到目前為止，由于這種技術(shù)將外來(lái)DNA隨機(jī)整合到植物基因組中，因此只有少數(shù)轉(zhuǎn)基因作物被利用，而這些轉(zhuǎn)基因生物（GMO）受到嚴(yán)格的政府監(jiān)管（圖1）。另外，關(guān)于這些產(chǎn)品安全性的不良公眾意見限制了它們的潛力。

已經(jīng)開發(fā)了基因組編輯技術(shù)，可以將精確的和可預(yù)測(cè)的基因組修飾引入植物中以獲得所需的性狀，并且它們產(chǎn)生了定義下一代植物育種的精確育種技術(shù)（圖1）。CRISPR-Cas已成為作物基因組工程的最先進(jìn)系統(tǒng)之一。這項(xiàng)技術(shù)已迅速擴(kuò)展，并已應(yīng)用于主要作物，例如水稻，小麥和玉米，以及對(duì)糧食安全至關(guān)重要的其他作物，例如馬鈴薯和木薯。此外，最近開發(fā)的與CRISPR相關(guān)的工具（如堿基編輯器）極大地?cái)U(kuò)展了基因組編輯的范圍，允許創(chuàng)建精確的核苷酸替換以及靶向的DNA缺失和插入。CRISPR-Cas技術(shù)與現(xiàn)代育種方法的結(jié)合，將在作物改良計(jì)劃中發(fā)揮重要作用。在這篇綜述中，將描述了植物基因組編輯的當(dāng)前發(fā)展?fàn)顟B(tài)，重點(diǎn)介紹了使用這些技術(shù)可以產(chǎn)生的遺傳修飾，以及將植物基因組編輯作為下一代植物育種技術(shù)用于作物改良的應(yīng)用。

植物基因組編輯技術(shù)

植物基因組編輯是使用可編程序列特異性核酸酶（SSN）進(jìn)行的。SSN包括鋅指核酸酶（ZFN），轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子核酸酶（TALEN）和CRISPR-Cas系統(tǒng)。這些核酸酶在靶位點(diǎn)形成DNA雙鏈斷裂（DSB），并通過(guò)DNA修復(fù)途徑實(shí)現(xiàn)精確的基因組修飾。盡管大范圍核酸酶，ZFN和TALENs通過(guò)蛋白質(zhì)-DNA相互作用識(shí)別靶序列，但CRISPR-Cas系統(tǒng)通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)靶向DNA序列，這取決于靶DNA與可編程“向?qū)А?RNA之間的同源性。由于其低成本，簡(jiǎn)單和高效，CRISPR-Cas系統(tǒng)已成為用于植物基因組編輯的最廣泛使用的系統(tǒng)。在這里，介紹了一般的植物基因組編輯程序，并介紹了可以通過(guò)植物中的基因組編輯產(chǎn)生的許多遺傳修飾。

植物基因組編輯的一般程序

植物基因組編輯的一般過(guò)程可分為六個(gè)步驟：（1）根據(jù)靶序列選擇合適的核酸酶；（2）構(gòu)建基因組編輯載體；（3）使用原生質(zhì)體（從酶消化的組織釋放的無(wú)壁植物細(xì)胞；可選步驟）驗(yàn)證這些載體的活性；（4）將基因組編輯元件輸送到植物細(xì)胞中；（5）通過(guò)組織培養(yǎng)將基因組編輯的細(xì)胞再生為小植株；（6）對(duì)所得的基因組編輯植物進(jìn)行篩選和基因分型（圖2A）。

盡管所有生物都使用相同的編輯工具，但傳遞和再生的某些方面特定于植物?；蚪M編輯元件有時(shí)可以直接轉(zhuǎn)化為原生質(zhì)體，但是在大多數(shù)情況下，它們是通過(guò)用基因槍或農(nóng)桿菌以愈傷組織，胚胎或葉外植體的形式輸送到植物細(xì)胞中的（圖2B和2C）。轉(zhuǎn)化和再生步驟仍然是植物基因組編輯的瓶頸，因?yàn)楸仨氠槍?duì)每個(gè)物種和每個(gè)植物品種優(yōu)化這些過(guò)程，這對(duì)于大多數(shù)優(yōu)良品種和野生物種而言都是艱巨的任務(wù)。

基因組編輯元件的三種常見形式包括CRISPR-Cas9 DNA，RNA（Cas9的體外轉(zhuǎn)錄本和sgRNA）和RNP（核糖核蛋白，由Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA組成）。盡管可以通過(guò)粒子轟擊和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將DNA傳遞到植物細(xì)胞中，但只能通過(guò)粒子轟擊將RNA和RNP傳遞到植物細(xì)胞中。當(dāng)DNA被選擇作為基因組編輯元件時(shí)，兩種不同的策略可用于后續(xù)的組織培養(yǎng)過(guò)程：常規(guī)方法和瞬態(tài)DNA表達(dá)方法（圖2C和2D）。在常規(guī)方法中，在組織培養(yǎng)過(guò)程中使用選擇劑來(lái)選擇抗性愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植物（圖2B和2C）。一旦產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因基因組編輯的突變體，就可以通過(guò)自交或雜交從突變體基因組中分離出基因組編輯載體，從而獲得無(wú)轉(zhuǎn)基因的突變植物（圖2D）。在瞬時(shí)DNA表達(dá)方法中，在組織培養(yǎng)過(guò)程中不使用選擇劑，從而無(wú)需分離過(guò)程即可產(chǎn)生不含轉(zhuǎn)基因的突變體（圖2C和2D）?？梢允褂肦NA或RNP獲得無(wú)外源DNA的基因組編輯。這些瞬時(shí)方法不會(huì)導(dǎo)致基因組整合事件進(jìn)入植物基因組。因此，在隨后的組織培養(yǎng)過(guò)程中不需要選擇劑，并且通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)CRISPR RNA（crRNA）或RNP創(chuàng)建的基因組編輯植物是無(wú)DNA突變體（圖2C和2D）。無(wú)DNA基因組編輯優(yōu)于常規(guī)方法，因?yàn)樗簧婕巴庠碊NA，并且可以大大減少植物中脫靶的編輯事件。

植物基因組編輯產(chǎn)生的遺傳修飾

除了ZFN和TALEN，CRISPR-Cas系統(tǒng)的引入還促進(jìn)了植物基因組編輯的發(fā)展。最廣泛使用的CRISPR-Cas系統(tǒng)是Cas9和Cas12a復(fù)合物，它們都是執(zhí)行核酸切割的單一效應(yīng)蛋白（圖3A）。最近，Cas12b系統(tǒng)也被開發(fā)用于植物基因組編輯。所有這些系統(tǒng)都依賴于crRNA來(lái)指導(dǎo)Cas蛋白靶向靶序列。Cas9蛋白需要一個(gè)額外的RNA分子，稱為反式crRNA（tracrRNA），可以將其與相應(yīng)的crRNA人工融合形成sgRNA。只需將DNA靶標(biāo)原間隔序列設(shè)計(jì)為crRNA或sgRNA，即可對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行編程。具有不同PAM（與原間隔物相鄰的基序）特異性的各種Cas直系同源物和變體已得到鑒定和利用，以最大程度地提高這些工具的編輯范圍。CRISPR-Cas系統(tǒng)和新開發(fā)的工具（例如堿基編輯器（圖3B）和primer editing（圖3C））極大地?cái)U(kuò)展了其潛在應(yīng)用。迄今為止，基因組編輯已用于在植物中產(chǎn)生多種可遺傳的基因組修飾，包括（1）小隨機(jī)插入/缺失（indels）（圖3D）；（2）點(diǎn)突變或核苷酸替代（圖3E）；（3）DNA片段插入（圖3F）；（4）DNA片段缺失（圖3G）；（5）靶向染色體重排（圖3H）。

經(jīng)典的基因組編輯涉及靶基因座處DSB的修復(fù)。將SSN試劑遞送到植物細(xì)胞中后，它們會(huì)識(shí)別并切割目標(biāo)DNA并生成DSB，DSB可通過(guò)內(nèi)源DNA修復(fù)途徑進(jìn)行修復(fù)，包括非同源末端連接（NHEJ）和同源性定向修復(fù)（HDR）。NHEJ是用于修復(fù)DSB的主要途徑，當(dāng)NHEJ修復(fù)DSB時(shí)，可能在重新結(jié)合的染色體的交界處引入插入缺失。產(chǎn)生的插入缺失是隨機(jī)的，其長(zhǎng)度和序列是變化的，并且通常由于移碼突變而導(dǎo)致基因敲除。此外，如果可獲得或提供了同源DNA模板，則可以發(fā)生HDR。通過(guò)HDR介導(dǎo)的基因組編輯可以產(chǎn)生精確的基因替換，點(diǎn)突變以及DNA插入和缺失（圖3A），但是HDR在植物細(xì)胞中的效率非常低。

除DSB介導(dǎo)的基因組編輯外，CRISPR-Cas衍生的堿基編輯器已成為生成可編程的單個(gè)DNA堿基改變的強(qiáng)大工具。堿基編輯器主要有兩類：胞嘧啶基礎(chǔ)編輯器（CBE）和腺嘌呤基礎(chǔ)編輯器（ABE）。堿基編輯者是nCas9 D10A 核酸酶與單鏈DNA（ssDNA）特異性脫氨酶的融合體。這些脫氨酶，例如CBE中的rAPOBEC1和PmCDA1胞嘧啶脫氨酶或ABE中實(shí)驗(yàn)室演變的TadA脫氧腺苷脫氨酶，可催化CRISPR-Cas位于靶位點(diǎn)由R環(huán)誘導(dǎo)的R環(huán)的ssDNA鏈中的C?G轉(zhuǎn)變?yōu)門?A或A?T轉(zhuǎn)變?yōu)镚?C （圖3B和3E）。尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑在CBE中的融合可通過(guò)操縱內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制來(lái)提高堿基編輯效率。CBE和ABE均已針對(duì)植物基因組進(jìn)行了優(yōu)化。使用脫氨基酶PmCDA1，hAID和hAPOBEC3A的其他CBE也已成功用于植物中。結(jié)合CBE和ABE的功能域的雙堿基編輯器可以在同一目標(biāo)位點(diǎn)同時(shí)誘導(dǎo)C?G到T?A和A?T到G?C的變化，從而進(jìn)一步擴(kuò)大了植物堿基編輯的范圍。

當(dāng)前的堿基編輯者僅限于堿基轉(zhuǎn)換（從C?G到T?A，從A?T到G?C），但是無(wú)法產(chǎn)生DNA堿基轉(zhuǎn)換和預(yù)定義的DNA插入和缺失。但是，最近的一項(xiàng)技術(shù)突破（即primer editing）允許在人類細(xì)胞中創(chuàng)建所有12種類型的堿基取代以及小的DNA插入和缺失（圖3C）。primer 編輯器由兩個(gè)部分組成：工程Cas9切口酶（H840A-逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）融合蛋白和primer編輯指南RNA（pegRNA）。該pegRNA是具有3′-延伸的堿基的修飾的sgRNA，其包含引物結(jié)合位點(diǎn)（PBS）和編碼所需編輯的RT模板。Cas9切口酶（H840A）識(shí)別靶位點(diǎn)并切口非靶DNA鏈，釋放出與PBS配對(duì)的ssDNA，并用作RT的引物。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，pegRNA上編碼的編輯被轉(zhuǎn)移到非靶DNA鏈上。隨后通過(guò)DNA修復(fù)將新合成的經(jīng)編輯的DNA襟翼并入靶位點(diǎn)。primer 編輯已迅速適應(yīng)用于植物細(xì)胞，并且主要編輯的水稻和玉米植物已成功再生，盡管目前primer 編輯的編輯效率遠(yuǎn)低于植物基因組大多數(shù)目標(biāo)位點(diǎn)的堿基編輯的效率。

已嘗試通過(guò)使用其他RT，改變pegRNA中PBS和RT模板的長(zhǎng)度，使用其他RT，用核酶處理pegRNA，提高培養(yǎng)溫度以促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄，使用增強(qiáng)的pegRNA啟動(dòng)子來(lái)提高引物編輯的效率表達(dá)，并富集轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過(guò)基于解鏈溫度設(shè)計(jì)pegRNA序列并使用雙PegRNA，還提高了primer 編輯效率。此外，已經(jīng)在水稻中開發(fā)了自動(dòng)化的pegRNA設(shè)計(jì)平臺(tái)（未發(fā)布的數(shù)據(jù)）。

DNA的精確插入使操縱基因功能和堆疊多種作物性狀成為可能。HDR介導(dǎo)的DNA插入植物的效率相對(duì)較低（圖3F）?；蛘弋?dāng)提供供體DNA模板時(shí)，可以利用NHEJ途徑在DSB位點(diǎn)進(jìn)行有效的DNA插入。一個(gè)成功的例子是通過(guò)NHEJ途徑靶向內(nèi)含子實(shí)現(xiàn)的CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因置換和插入（圖3F）。為了增加NHEJ靶向插入的頻率，將短的同源染色體片段添加到供體DNA的末端，以產(chǎn)生與DSB周圍序列兼容的末端或微同源性。也可以用化學(xué)穩(wěn)定的末端帶有5′-磷酸化的雙鏈寡脫氧核苷酸（dsODNs）供體刺激通過(guò)NHEJ的靶向插入。

靶DNA缺失對(duì)于編輯調(diào)節(jié)性和非編碼DNA尤其重要，因?yàn)樾〔迦肴笔Р惶赡軐?dǎo)致功能喪失。通過(guò)使用SSN誘導(dǎo)兩個(gè)獨(dú)立的DSB，可以獲得靶向的DNA缺失（圖3G）。例如，與一對(duì)sgRNA共表達(dá)Cas9可導(dǎo)致兩個(gè)靶位點(diǎn)之間的區(qū)域> 100 kb缺失。此外，通過(guò)將Cas9或Cas12a與T5核酸外切酶融合或通過(guò)將SSN與核酸外切酶共表達(dá)，可以用單個(gè)gRNA產(chǎn)生靶向的缺失，但是這種缺失的長(zhǎng)度受到限制。使用這些策略獲得的缺失的DNA序列是無(wú)法預(yù)測(cè)或精確的，因?yàn)樾迯?fù)是通過(guò)NHEJ途徑進(jìn)行的。

可以通過(guò)微同源介導(dǎo)的末端連接（MMEJ）生成精確的DNA缺失，該連接使用微同源序列在DSB連接之前先對(duì)齊DSB的末端（圖3G）。但是，這種策略只能在兩個(gè)微同源序列之間產(chǎn)生缺失。新開發(fā)的APOBEC-Cas9融合誘導(dǎo)的缺失系統(tǒng)（AFID）可以產(chǎn)生多核苷酸缺失（圖3G）。在這些系統(tǒng)中，Cas9在目標(biāo)DNA序列處生成DSB，同時(shí)APOBEC將非目標(biāo)鏈上的胞苷脫氨為尿苷，然后通過(guò)尿嘧啶DNA糖基化酶將其切除，從而生成無(wú)堿基（AP）位點(diǎn)。通過(guò)AP裂解酶去除AP位點(diǎn)導(dǎo)致可預(yù)測(cè)的和精確的缺失，其從脫氨基胞苷延伸到DSB。

當(dāng)使用SSN誘導(dǎo)DSB時(shí)，也可實(shí)現(xiàn)可用于破壞或固定遺傳連鎖的靶向染色體重排（圖3H）。當(dāng)將成對(duì)的DSB同時(shí)引入同一條染色體時(shí)，兩個(gè)斷裂之間可能會(huì)產(chǎn)生缺失和倒位。這些重排主要?dú)w因于NHEJ流程，有時(shí)歸因于MMEJ。最近顯示，在玉米和擬南芥中可以實(shí)現(xiàn)以兆堿基對(duì)（Mbp）為目標(biāo)的染色體反轉(zhuǎn)。此外，后者證明了通過(guò)這種方法確實(shí)可以實(shí)現(xiàn)遺傳交叉的恢復(fù)。當(dāng)在不同染色體上生成兩個(gè)或多個(gè)DSB時(shí)，也會(huì)觸發(fā)染色體間重排，如交叉，易位和序列交換（圖3H）。最近，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在擬南芥中產(chǎn)生了異源染色體之間的相互易位。重要的是，這些易位在Mbp范圍內(nèi)并且是可遺傳的。盡管如此，必須開發(fā)出更有效的工具來(lái)實(shí)現(xiàn)針對(duì)植物育種的目標(biāo)染色體重排的巨大潛力。

涉及基因組編輯的下一代植物育種技術(shù)

傳統(tǒng)的植物育種已經(jīng)達(dá)到了養(yǎng)活不斷增長(zhǎng)的全球人口的極限。標(biāo)記輔助選擇和基因組輔助育種等技術(shù)進(jìn)步正在進(jìn)一步推動(dòng)這一極限。基因組編輯為植物育種打開了一個(gè)新的工具包，該工具包將以前所未有的速度，高效且具有成本效益的方式進(jìn)行，這將推動(dòng)植物育種超越當(dāng)前的極限，并進(jìn)入下一代。

定向誘變和精確育種

可編程的定向誘變促進(jìn)了所需性狀向作物的轉(zhuǎn)移，并大大減少了廣泛的遺傳雜交和大規(guī)模后代基因分型的需要。BETAINE醛脫氫酶2（BADH2）的直接敲除可阻止2-乙酰基-1-吡咯啉（香米中的主要香精化合物）的生物合成，從而產(chǎn)生香米品種。乙酰乙酸合成酶（ALS）編碼植物中支鏈氨基酸生物合成中的關(guān)鍵酶，并且是各種除草劑的目標(biāo)蛋白，某些殘基處的突變賦予除草劑耐受性。通過(guò)用CBE靶向OsALS的P171和/或G628密碼子，產(chǎn)生了對(duì)ALS抑制性除草劑具有廣譜耐受性的水稻植株，為水稻種植者提供了更好的雜草處理機(jī)會(huì)?；蚪M編輯對(duì)植物育種的主要貢獻(xiàn)是消除了“有害”基因。例如，CRISPR-Cas9被成功用于敲除OsERF922（一種植物中真菌抗藥性的負(fù)調(diào)節(jié)劑），從而產(chǎn)生了抗性水稻。由于某些“有害”負(fù)荷是多基因的，并且是由許多次要效應(yīng)突變引起的，因此有效的多重基因組編輯將是去除所有有害等位基因的有前途的方法。

植物雜交的障礙禁止通過(guò)常規(guī)育種在物種間共享性狀。有效的植物基因組編輯基于對(duì)基因組功能和基因組學(xué)的高級(jí)基礎(chǔ)研究，因?yàn)橹沃饕卣鳎ɡ玳_花時(shí)間，抗性，植物高度和種子大小）的分子機(jī)制通常在不同植物物種中均得到保留?？梢允褂没谀Ｐ椭参镅芯揩@得的遺傳和生物學(xué)信息的基因組編輯技術(shù)，直接改善各種作物物種的復(fù)雜性狀（圖4A）。因此，原則上，重要的性狀可以在物種之間共享。通過(guò)編輯MILDEW RESISTANCE LOCUS（MLO）已經(jīng)證明了這種跨物種性狀“共享”，該基因是在大麥中首次發(fā)現(xiàn)的隱性基因，其失活導(dǎo)致對(duì)白粉病的持久，廣譜抗性。通過(guò)編輯包括小麥，番茄（S. lycopersicum）和葡萄樹（Vitis vinifera）在內(nèi)的多種植物的MLO，已經(jīng)獲得了抗白粉病的能力。OsNP1和ZmIPE1編碼假定的葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶，是雄性不育所必需的。CRISPR-Cas9被用來(lái)編輯小麥中這些基因的直系同源基因（TaNP1），以實(shí)現(xiàn)完全的雄性不育。

當(dāng)必須分離緊密連鎖的基因座時(shí)，尤其是當(dāng)一個(gè)基因座是有益的而另一種是有害的時(shí)，依靠基因重組的雜交育種就具有挑戰(zhàn)性。打破這種遺傳聯(lián)系需要大量回交，這很費(fèi)時(shí)，甚至在某些情況下甚至是不可能的。在這種情況下，可以兩種方式使用編輯來(lái)改變有害等位基因。一種方法是誘導(dǎo)染色體重排以增加重組事件，因?yàn)镾SN具有在植物中產(chǎn)生相互染色體易位和染色體內(nèi)倒置的能力（圖4A）。另一種方法是直接編輯或刪除不需要的等位基因，從而繞過(guò)傳統(tǒng)的基因滲入（圖4A）。編輯已被用來(lái)通過(guò)敲除番茄中不希望的等位基因來(lái)打破連鎖拖累，最近，在玉米中結(jié)合了兩個(gè)緊密相連的遺傳等位基因。小麥中一個(gè)新的RecQ解旋酶基因控制著全基因組的基因轉(zhuǎn)換，并代表了一種內(nèi)源的“連鎖斷裂機(jī)制”，該機(jī)制在DSB修復(fù)過(guò)程中將一個(gè)等位基因覆蓋到另一個(gè)等位基因。通過(guò)基因組編輯利用相同的機(jī)制可以提供一種打破其他物種遺傳聯(lián)系的新方法。

多重基因組編輯和性狀疊加

CRISPR與其他SSN相比的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是它可以同時(shí)編輯多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)。使用轉(zhuǎn)移RNA處理，核酶自我切割，crRNA陣列或Csy4核糖核酸酶切割時(shí)，幾個(gè)sgRNA可以在同一細(xì)胞中表達(dá)。多重基因編輯將大大加速重要特征的基因堆疊。為了進(jìn)一步加快編輯和性狀堆疊的周期，無(wú)需實(shí)驗(yàn)室的方法可以為與諸如快速育種技術(shù)之類的快速循環(huán)系統(tǒng)集成提供方便。

大約四分之一的維管植物是多倍體，其中許多植物在農(nóng)業(yè)上具有重要意義，例如六倍體面包小麥，四倍體蕓苔屬植物，棉花和馬鈴薯。多倍體中的大多數(shù)基因以多份拷貝（同源物）存在，它們執(zhí)行相同的功能以控制特定的植物性狀。這些同源物必須同時(shí)突變以產(chǎn)生隱性變化?；蚪M編輯非常適合此目的（圖4B）。這種方法首先在面包小麥中得到證實(shí)，在該小麥中同時(shí)編輯MLO的三個(gè)同等位基因賦予了對(duì)白粉?。ㄒ环N主要的真菌?。┑目剐浴哪菚r(shí)起，基因組編輯已被部署來(lái)在其他多倍體作物中產(chǎn)生有價(jià)值的農(nóng)藝性狀。對(duì)于劑量依賴性表型很重要的基因劑量，也可以通過(guò)在多倍體作物中進(jìn)行基因編輯來(lái)改變。

對(duì)16個(gè)完全測(cè)序的植物基因組的分析表明，可以將72％的蛋白質(zhì)編碼基因分類為旁系基因家族?；蚣易宓某蓡T通常具有相似的結(jié)構(gòu)和重疊的功能。這種功能冗余提供了遺傳穩(wěn)健性。因此，敲除一個(gè)旁系同源物可能是不夠的，并且經(jīng)常需要突變兩個(gè)或多個(gè)旁系同源物以產(chǎn)生表型效應(yīng)。多重編輯可用于此目的（圖4B）。例如，小麥中的面筋基因家族包括編碼至少29種α-麥醇溶蛋白，18種γ-麥醇溶蛋白和10種ω-麥醇溶蛋白以及16種低分子量和6種高分子量谷蛋白的基因。α-，γ-和ω-麥醇溶蛋白的免疫原性表位以及低分子量谷蛋白的免疫原性表位在1％–2％的人群中引發(fā)自身免疫性疾病乳糜瀉。由于潛在的遺傳復(fù)雜性，很難通過(guò)常規(guī)育種獲得無(wú)麩質(zhì)小麥。CRISPR-Cas9成功地用于同時(shí)編輯六倍體面包小麥中的多個(gè)α-和γ-麥醇溶蛋白基因。令人印象深刻的是，單次成功地突變了35個(gè)基因，免疫反應(yīng)性降低了85％。一種更有效和精確的方法是使用堿基編輯器和primer 編輯器來(lái)特異性修飾免疫原性表位中的氨基酸。

編輯QTL

數(shù)量性狀在農(nóng)學(xué)上非常重要。這些性狀是多基因的，并由數(shù)量性狀基因座（QTL）控制，每個(gè)QTL在相互作用時(shí)直接對(duì)表型產(chǎn)生較小的影響。QTL并非以簡(jiǎn)單的孟德爾方式繼承，因此極難研究和操作。調(diào)查植物中QTL的遺傳變異的主要原因是為了改善作物。必須使用統(tǒng)計(jì)方法（例如QTL作圖和全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS））而非常規(guī)遺傳分析來(lái)鑒定QTL。依賴于可測(cè)量表型的QTL映射通常對(duì)主要QTL表現(xiàn)良好?；谏疃葴y(cè)序的GWAS和泛基因組技術(shù)表明，大量的單核苷酸多態(tài)性（SNP）和結(jié)構(gòu)變異（SV）與植物的數(shù)量性狀變異有關(guān)。這些SNP和SV中的許多位于基因的非編碼或調(diào)控區(qū)域，這使分子表征和確認(rèn)變得復(fù)雜?；蚪M編輯通過(guò)提供將遺傳多態(tài)性與表型差異聯(lián)系起來(lái)的工具，顯示出克服這些限制的巨大潛力（圖4C）。QTL編輯可用于將多個(gè)所需的定量等位基因直接引入優(yōu)良農(nóng)作物品種，從而避免了密集雜交的需要。該技術(shù)將特別適用于在低重組區(qū)域編輯QTL。

CRISPR-Cas9被用來(lái)產(chǎn)生數(shù)百個(gè)靶向突變，以促進(jìn)系統(tǒng)分析順式調(diào)控區(qū)域與番茄表型變異的關(guān)系?；蚪M編輯還用于通過(guò)候選QTL的高通量編輯屏幕來(lái)識(shí)別QTL。使用CRISPR-Cas9和堿基編輯來(lái)編輯基因的上游開放閱讀框（uORF）已被用于微調(diào)植物中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而促進(jìn)植物生產(chǎn)力，食品質(zhì)量和對(duì)壓力的適應(yīng)之間的平衡。此外，CRISPR多重策略可用于修飾候選QTL或定義的QTL區(qū)域中所有基因的組合，從而導(dǎo)致可測(cè)量表型的改變。

從頭馴化

幾千年來(lái)，當(dāng)今所有主要農(nóng)作物都是從野生祖先馴養(yǎng)而來(lái)的。馴化豐富了提高作物生產(chǎn)力的性狀，例如理想的植物結(jié)構(gòu)，高產(chǎn)和易于收獲；但是，隨著時(shí)間的流逝，這會(huì)導(dǎo)致遺傳瓶頸，從而導(dǎo)致遺傳多樣性下降和抗逆性下降。為了改良耕種的作物，自那時(shí)起就將野生近緣種的有益特性融入其中。不幸的是，這種雜交僅適用于單基因性狀，并且野生物種中的許多有用性狀，例如非生物脅迫耐受性，都是多基因的，并且在雜交和回交期間難以通過(guò)分離固定。通過(guò)基因組編輯從頭馴化野生物種提供了一種有前途的替代育種策略（圖4D）。作為概念的證明，成功進(jìn)行了馴化基因的多重編輯，以部分馴化野生番茄（S.pimpinellifolium），同時(shí)保留了對(duì)野生菌株的脅迫耐受性。野生稻的馴化也是一個(gè)有吸引力的目標(biāo)。同種四倍體野生稻物種Oryza alta具有很大的生物量，能夠抵抗生物和非生物脅迫，使其成為未來(lái)的有希望的作物。最近已經(jīng)確定了一種理想的O.alta生態(tài)型并使用CRISPR創(chuàng)建了具有改良農(nóng)業(yè)性狀的突變品系。這些研究為加快野生植物物種的馴化奠定了基礎(chǔ)。

從頭馴化還具有提高孤兒作物產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)含量以滿足當(dāng)?shù)匦枨蟮木薮鬂摿?。這些野生農(nóng)作物的單產(chǎn)遠(yuǎn)低于耕作農(nóng)作物，但它們能抵抗環(huán)境壓力，可以在邊緣土地上種植，表明與西紅柿密切相關(guān)的一種孤兒作物地面櫻桃可以得到快速改良。通過(guò)加速馴化。其他孤兒作物，例如高粱，Setaria viridis，Vigna unguiculata，Chenopodium quinoa，木薯和Eragrostis tef，都是從頭馴化的良好原料。除經(jīng)典育種和其他技術(shù)外，完全馴化的新栽培農(nóng)作物的創(chuàng)造可能還需要進(jìn)行反復(fù)的編輯活動(dòng)。利用從頭馴化將孤兒作物轉(zhuǎn)化為新的超級(jí)作物可能是確保全球糧食供應(yīng)的有效途徑。值得回顧的是，在18世紀(jì)和19世紀(jì)，向歐洲引入了一種新的主食，即馬鈴薯，在歐洲人口增長(zhǎng)和城市化進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

單倍體誘導(dǎo)和人工無(wú)融合生殖

傳統(tǒng)植物育種需要六到七代自花授粉才能提供高度純合，穩(wěn)定的品種。雙倍單倍體的產(chǎn)生可有效地在兩代內(nèi)固定重組單倍體基因組，從而與傳統(tǒng)的冗長(zhǎng)繁殖程序相比，極大地加快了繁殖過(guò)程并降低了成本。內(nèi)源植物基因的直接編輯是產(chǎn)生單倍體誘導(dǎo)物系的有效方法。編碼精子細(xì)胞特異性磷脂酶的MTL / PLA1 / NLD的敲除導(dǎo)致在玉米，水稻和小麥中產(chǎn)生有缺陷的雄配子體和母本單倍體誘導(dǎo)表型。通過(guò)經(jīng)由CRISPR介導(dǎo)的誘變操作DMP在玉米中獲得了相似的結(jié)果（圖4E）。

CRISPR-Cas9介導(dǎo)的CENH3 N末端α-螺旋的缺失導(dǎo)致擬南芥中產(chǎn)生單倍體誘導(dǎo)物系。TaCENH3α基因在小麥中的基因組編輯導(dǎo)致單倍體誘導(dǎo)率為約7％；編輯雜合基因型的恢復(fù)的移碼等位基因比純合體組合觸發(fā)更高的父本單倍體誘導(dǎo)率。重要的是，通過(guò)單倍體誘導(dǎo)編輯（HI-Edit）和單倍體誘導(dǎo)物介導(dǎo)的基因組編輯（IMGE）成功地修飾了幾種轉(zhuǎn)化困難作物品種。HI-Edit / IMGE使直接的基因組修飾進(jìn)入任何優(yōu)良商業(yè)品種背景中，并在載有針對(duì)所需農(nóng)藝性狀的CRISPR-Cas盒的單倍體誘導(dǎo)系授粉時(shí)產(chǎn)生無(wú)轉(zhuǎn)基因的農(nóng)作物。

開花植物（被子植物）的種子發(fā)育是由雙重受精觸發(fā)的，其中單倍體卵細(xì)胞和二倍體中央細(xì)胞各自與精子細(xì)胞融合，產(chǎn)生二倍體胚胎和三倍體胚乳。在某些物種中，種子可以通過(guò)無(wú)融合生殖的過(guò)程進(jìn)行無(wú)性繁殖。該過(guò)程導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳上相同的種子，這些種子在植物育種中具有許多應(yīng)用。無(wú)融合生殖自然存在于> 400個(gè)物種中。但是，此過(guò)程在大多數(shù)主要農(nóng)作物中都不會(huì)發(fā)生，并且很難通過(guò)常規(guī)育種進(jìn)行工程改造。無(wú)融合生殖需要三個(gè)主要步驟：形成未減少的雌配子體（無(wú)核生殖），從配子體中胚胎發(fā)育而不使卵細(xì)胞受精（孤雌生殖）和胚乳受精。在水稻中可以通過(guò)CRISPR-Cas9敲除減數(shù)分裂基因REC8，PAIR1和OSD1來(lái)誘導(dǎo)無(wú)融合生殖或“有絲分裂代替減數(shù)分裂”（MiMe）（圖4E）。創(chuàng)建無(wú)融合生殖植物的一種方法是消除基因組。證明Cas9誘導(dǎo)的水稻MATRILINEAL（MTL）的敲除導(dǎo)致單倍體誘導(dǎo)，同時(shí)編輯OSD1，PAIR1，REC8和MTL產(chǎn)生了產(chǎn)生克隆種子的植物。另一種方法是在不受精的情況下觸發(fā)雌性配子的胚胎發(fā)育（圖4E）。未受精卵細(xì)胞中BBM1的錯(cuò)誤表達(dá)觸發(fā)了水稻的胚發(fā)生。將此過(guò)程與通過(guò)編輯生成的MiMe突變相結(jié)合，產(chǎn)生合成無(wú)融合生殖。由于在這兩種方法中使用的基因在其他植物中都是保守的，因此這些方法應(yīng)適用于其他主要農(nóng)作物。盡管水稻中的無(wú)性系種子取得了成功，但在實(shí)現(xiàn)合成無(wú)融合生殖在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用之前，例如朝著固定雜種優(yōu)勢(shì)的方向發(fā)展之前，還需要進(jìn)行更多的改進(jìn)。操縱胚乳受精可以促進(jìn)農(nóng)作物合成無(wú)融合生殖的產(chǎn)生。

大規(guī)模篩選特征發(fā)現(xiàn)

為了將基因組編輯應(yīng)用于植物育種，必須了解有益性狀的遺傳調(diào)控。CRISPR-Cas9篩選可用作基因組和表型之間的全基因組表征的正向遺傳篩選工具。對(duì)于這種類型的篩選，Cas9與靶向植物中許多或所有基因的sgRNA文庫(kù)一起表達(dá)。植物轉(zhuǎn)化后，再生編輯過(guò)的植物，并篩選其子代以尋找感興趣的性狀。通過(guò)對(duì)富集變異體的sgRNA進(jìn)行測(cè)序，可以確定目標(biāo)基因或突變體。CRISPR-Cas9已成功用于水稻的全基因組篩選，并在番茄，大豆（Glycine max）和玉米中產(chǎn)生突變種群（圖4F）。這種方法比化學(xué)，物理或轉(zhuǎn)座子誘變更有效地在植物中產(chǎn)生全基因組突變。然而，當(dāng)前植物中的CRISPR篩選需要費(fèi)力的植物組織培養(yǎng)程序。將來(lái)，利用強(qiáng)大的表型讀數(shù)和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的單細(xì)胞或基于原生質(zhì)體的篩選方法可能會(huì)加快性狀發(fā)現(xiàn)的速度。

CRISPR-Cas大規(guī)模篩選的另一個(gè)重要應(yīng)用涉及在基因或其功能域中引入飽和突變，然后進(jìn)行定向進(jìn)化篩選以進(jìn)行性狀工程和新性狀發(fā)現(xiàn)（圖4F）。這種方法需要使用sgRNA文庫(kù)生產(chǎn)各種突變體，以及用于篩選和選擇具有所需特性的植物的有效方法。通過(guò)將Cas9與sgRNA文庫(kù)偶聯(lián)，直至相關(guān)編碼序列的兩條鏈上的所有潛在位點(diǎn)，CRISPR-Cas9已成功用于天然植物環(huán)境中的定向蛋白質(zhì)進(jìn)化。然而，Cas9誘導(dǎo)的主要突變是與插入缺失相關(guān)的移碼，這使得難以產(chǎn)生產(chǎn)生SNP所需的所有氨基酸替代，SNP是自然界中最常見的遺傳變異來(lái)源。基本編輯器是解決此難題的理想工具。例如，將sgRNA文庫(kù)與CBE或ABE一起傳遞到植物細(xì)胞中，以通過(guò)在水稻中產(chǎn)生OsACC的功能變體來(lái)促進(jìn)除草劑抗性的進(jìn)化。此外，開發(fā)了雙胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器，可同時(shí)生成從C?G到T?A和A?T到G?C的轉(zhuǎn)換，并已用于選定OsACC靶標(biāo)結(jié)構(gòu)域的近飽和誘變。在這些CRISPR指導(dǎo)的進(jìn)化活動(dòng)中回收了已知和新穎的變體。但是，只能以這種方式工程化有限數(shù)量的植物蛋白。使用單細(xì)胞或原生質(zhì)體進(jìn)行迭代突變和選擇的方法將來(lái)可能會(huì)擴(kuò)展該方法的實(shí)用性。

挑戰(zhàn)與未來(lái)展望

提高精確的基因組編輯效率

盡管植物基因組編輯方面有最新的技術(shù)進(jìn)步，但仍然不可能在基因組中生成所有所需的更改。迫切需要精確的基因組編輯，例如產(chǎn)生目標(biāo)堿基的替換，基因插入/缺失和基因替換，以改良農(nóng)作物的性狀。原則上，HDR介導(dǎo)的基因組編輯可用于精確地重寫任何基因組并產(chǎn)生指定的編輯。已經(jīng)使用各種策略來(lái)提高植物細(xì)胞中的HDR效率，例如使用雙生病毒構(gòu)建體，植物體內(nèi)基因靶向（GT）系統(tǒng)或化學(xué)修飾來(lái)穩(wěn)定供體模板。通過(guò)使供體DNA模板靠近DSB，操縱DNA修復(fù)途徑，利用特定的細(xì)胞周期階段和細(xì)胞類型或使用不同的SSN，也可以提高HDR效率。盡管已經(jīng)基于上述策略在許多植物中報(bào)道了精確的HDR介導(dǎo)的基因組編輯，但是該過(guò)程本身在體植物細(xì)胞中仍然效率極低。

為了克服這些限制，新開發(fā)的DNA堿基編輯系統(tǒng)（CBE和ABE）提供了有效且簡(jiǎn)單的方法，可以將特定的DNA堿基轉(zhuǎn)換為目標(biāo)基因組位點(diǎn)的另一個(gè)堿基。但是，目前僅限于將C?G替換為T?A，將A?T替換為G?C。因此，必須通過(guò)工程脫氨酶，操縱DNA修復(fù)途徑或蛋白質(zhì)工程來(lái)開發(fā)其他基礎(chǔ)編輯系統(tǒng)，例如C?G至G?C。除堿基編輯外，primer 編輯可用于生成任何堿基替換，但是目前它們顯示出相當(dāng)?shù)偷木庉嬓省Ｓ捎?span>primer 編輯器的活性取決于許多因素，例如RT的活性，pegRNA中PBS的長(zhǎng)度和RT模板，因此需要更多的策略來(lái)改善植物細(xì)胞中主要編輯者的活性。盡管最初的編輯不能產(chǎn)生大量的基因插入，但最近發(fā)現(xiàn)的與CRISPR相關(guān)的轉(zhuǎn)座酶可以高效地將DNA整合到細(xì)菌基因組中，這為將來(lái)將大量DNA插入植物基因組打開了大門。

改善基因組編輯的特異性

脫靶效應(yīng)是基因組編輯中的主要問(wèn)題之一。CRISPR技術(shù)產(chǎn)生兩種類型的脫靶編輯：依賴sgRNA和不依賴sgRNA的脫靶編輯。依賴sgRNA的脫靶編輯是通過(guò)編輯脫靶位點(diǎn)誘導(dǎo)的，這些位點(diǎn)與靶上sgRNA序列不匹配。全基因組測(cè)序表明，CRISPR-Cas系統(tǒng)不會(huì)在水稻或棉花中誘導(dǎo)不依賴sgRNA的脫靶效應(yīng)。但是，一些CBE誘導(dǎo)水稻中不依賴全基因組的sgRNA脫靶突變，這是由全基因組ssDNA區(qū)域中的胞苷脫氨酶活性觸發(fā)的。與將許多意外突變引入植物基因組的常規(guī)突變育種相比，植物基因組編輯具有很高的特異性。此外，可以通過(guò)回交消除有限數(shù)量的脫靶突變?？梢酝ㄟ^(guò)瞬時(shí)表達(dá)編輯試劑來(lái)增強(qiáng)CRISPR-Cas的特異性，如在小麥和玉米中證明的那樣，可以通過(guò)使用合理設(shè)計(jì)的指導(dǎo)RNA或通過(guò)使用工程改造的Cas9，Cas12a和脫氨基酶的精確變體來(lái)增強(qiáng)。但是，需要進(jìn)一步研究來(lái)解決脫靶編輯的傾向，尤其是在開發(fā)更靈敏的方法以檢測(cè)植物中全基因組脫靶突變以及鑒定具有更高特異性的改良或新編輯器方面。我相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，植物基因組編輯的脫靶效應(yīng)將不再是問(wèn)題。

優(yōu)化植物細(xì)胞的輸送和再生系統(tǒng)

理想的植物基因組編輯試劑輸送系統(tǒng)是不依賴基因型，無(wú)組織培養(yǎng)的，并且直接應(yīng)用于特定組織，例如分生組織，葉片，種子或下胚軸。當(dāng)前的遞送方法包括粒子轟擊，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，聚乙二醇（PEG），病毒載體和納米顆粒。最近顯示，sgRNA和RNA病毒表達(dá)的內(nèi)源性可移動(dòng)RNA序列的融合會(huì)遷移到分生組織區(qū)域并產(chǎn)生可遺傳的突變。納米顆粒和其他新材料可能會(huì)成為編輯試劑的有用工具。例如，碳納米管可用于將DNA傳遞到植物葉片中，從而成功表達(dá)蛋白質(zhì)。如果該系統(tǒng)可以將基因組編輯試劑傳遞到莖尖分生組織中，則可以實(shí)現(xiàn)無(wú)組織培養(yǎng)的編輯。

一旦基因組編輯試劑被遞送到體細(xì)胞中，則需要隨后的組織培養(yǎng)和植物再生以獲得被編輯的植物；但是，此再生步驟在大多數(shù)農(nóng)作物中極具挑戰(zhàn)性。植物的再生是基于體細(xì)胞的全能性，它使植物細(xì)胞與大多數(shù)其他真核細(xì)胞區(qū)分開。促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)生的發(fā)育調(diào)節(jié)劑（指定的促進(jìn)劑）已用于促進(jìn)植物再生（圖2B和2C）。過(guò)表達(dá)兩種發(fā)育調(diào)節(jié)因子，WUSCHEL（WUS）和BABY BOOM（BBM），可提高各種轉(zhuǎn)化難治性基因型和物種的再生頻率。盡管WUS和BBM的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化會(huì)引起玉米的形態(tài)缺陷和不育，但使用合適的啟動(dòng)子控制WUS和BBM的組織和時(shí)間特異性表達(dá)可減輕其多效性作用。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子（GRF），GRF相互作用因子（GIF）和GRF-GIF嵌合體也已用于提高各種單子葉植物和雙子葉植物的再生效率。與WUS和BBM相比，GRF，GIF和GRF-GIF嵌合體在組成型表達(dá)時(shí)沒(méi)有明顯的副作用，繞過(guò)了轉(zhuǎn)化后但再生之前切離它們的費(fèi)力且費(fèi)時(shí)的步驟。發(fā)育調(diào)節(jié)劑也可用于通過(guò)從頭分生組織誘導(dǎo)產(chǎn)生基因組編輯的雙子葉植物，這回避了組織培養(yǎng)的需要。盡管有這些有前途的技術(shù)，植物遺傳轉(zhuǎn)化和再生仍然需要使用專門的設(shè)備，因此有必要簡(jiǎn)化這兩個(gè)過(guò)程以在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)植物基因組編輯。

植物合成生物學(xué)

合成生物學(xué)是用于加速新型農(nóng)藝性狀發(fā)展的新策略。CRISPR-Cas系統(tǒng)具有改善植物設(shè)計(jì)和合成生物學(xué)的巨大潛力（圖4G）。通過(guò)編輯內(nèi)源基因或引入編碼各種酶或信號(hào)傳導(dǎo)途徑成分的外源基因，研究人員已經(jīng)能夠重定向固有的代謝網(wǎng)絡(luò)或在植物中建立新的途徑，以生產(chǎn)富含所需天然或人工化合物的食物（圖4G）。CRISPR-Cas介導(dǎo)的多重基因編輯和調(diào)控可用于完成這項(xiàng)合成生物學(xué)任務(wù)。例如，植物中的光合作用系統(tǒng)遠(yuǎn)非完美，因?yàn)樵诠夂献饔猛緩街邪l(fā)揮作用的核心酶Rubisco對(duì)CO2的固定效率很低，并且由于光呼吸而中毒，從而導(dǎo)致大量的碳，氮和能量損失。通過(guò)引入人工旁路光呼吸的成分或通過(guò)CRISPR介導(dǎo)的DNA插入重新設(shè)計(jì)Rubisco，可以提高植物的光合作用效率和生物量。除了這些前景外，基因組編輯還可以促進(jìn)植物合成生物學(xué)的其他方面，例如建立用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的植物生物傳感器或用于檢測(cè)環(huán)境刺激的植物生物記錄儀。

植物微生物組工程

在自然界中，植物暴露于數(shù)萬(wàn)億微生物，包括細(xì)菌，真菌，原生動(dòng)物，古細(xì)菌和病毒。有益的植物-微生物組相互作用可以改善植物生長(zhǎng)或控制病原體。在一組促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌中接種微生物群可以增強(qiáng)植物的發(fā)育，并有助于保護(hù)植物免受病原體和非生物脅迫的侵害。因此，微生物組被認(rèn)為代表了植物中的“第二基因組”。植物微生物組通過(guò)改變營(yíng)養(yǎng)吸收和基因表達(dá)以及充當(dāng)生物防治病原體來(lái)影響植物的生長(zhǎng)。微生物組工程已經(jīng)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生了重大影響。高通量測(cè)序和CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯的最新進(jìn)展為細(xì)菌基因在微生物群落中的作用提供了見識(shí)，而這些修飾微生物組的新方法可能會(huì)改善未來(lái)的作物生長(zhǎng)和病原體抗性（圖4H）。

CRISPR系統(tǒng)可用于精確編輯復(fù)雜微生物群落中特定生物的基因組。然后可以將這些經(jīng)過(guò)編輯的生物返回實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，以研究特定的修飾是否會(huì)在宿主植物中導(dǎo)致新的特性，例如改善的營(yíng)養(yǎng)吸收或病原體抗性。這樣的信息將揭示微生物群落中特定生物的確切功能。CRISPR系統(tǒng)可以首先轉(zhuǎn)化為微生物群落，然后遞送至天然植物生長(zhǎng)環(huán)境，例如土壤和葉片。CRISPR系統(tǒng)還可以通過(guò)相互作用和結(jié)合從修飾的微生物轉(zhuǎn)移到其他微生物群落成員，從而導(dǎo)致植物微生物組的原位基因組編輯（圖4H）。植物微生物組的這種精確的基因組編輯將為改善作物產(chǎn)量提供新的方法。

為基因組編輯作物的基于科學(xué)的監(jiān)管框架做出貢獻(xiàn)

基因組編輯植物的監(jiān)管和社會(huì)認(rèn)可對(duì)于開發(fā)新育種技術(shù)及其衍生作物和產(chǎn)品至關(guān)重要，但是這些步驟仍然存在問(wèn)題。當(dāng)前，當(dāng)調(diào)節(jié)基因組編輯的作物時(shí)，采用基于過(guò)程或基于產(chǎn)品的調(diào)節(jié)方法。歐盟使用基于過(guò)程的法規(guī)，而加拿大，美國(guó)和阿根廷則支持基于產(chǎn)品的方法，但是大多數(shù)其他國(guó)家尚未建立其監(jiān)管框架。迄今為止，已經(jīng)使用基于產(chǎn)品的方法完全批準(zhǔn)了幾家經(jīng)過(guò)編輯的工廠。目前等待監(jiān)管部門批準(zhǔn)的大多數(shù)基因組編輯植物均已由公共研究機(jī)構(gòu)和中小型公司提交。但是，如果采用限制性監(jiān)管方法并將經(jīng)過(guò)編輯的工廠視為轉(zhuǎn)基因生物，則會(huì)造成巨大的財(cái)務(wù)負(fù)擔(dān)，只有大型跨國(guó)公司才能承受。對(duì)于無(wú)轉(zhuǎn)基因的編輯產(chǎn)品，法規(guī)必須合理且易于瀏覽。已經(jīng)提出了針對(duì)基因組編輯作物的基于科學(xué)的管理框架。由于基因組編輯不是一種單一的技術(shù)，而是一種分子工具箱，因此可能不適合使用一種全面的，一刀切的監(jiān)管方法。相反，應(yīng)該使用分層的監(jiān)管系統(tǒng)來(lái)容納現(xiàn)有技術(shù)和未來(lái)技術(shù)。需要付出更多的努力來(lái)確保監(jiān)管透明性并打開對(duì)話。公共傳播應(yīng)基于事實(shí)和科學(xué)。我們應(yīng)該打開對(duì)話并以不同的聲音參與其中，包括最需要增加糧食產(chǎn)量的發(fā)展中國(guó)家和不發(fā)達(dá)國(guó)家的聲音。盡管如此，和解不同利益相關(guān)者的利益沖突必將帶來(lái)重大挑戰(zhàn)

結(jié)論

植物基因組編輯技術(shù)的發(fā)展為植物育種提供了廣泛的機(jī)會(huì)。通過(guò)基因組編輯進(jìn)行高效，精確和有針對(duì)性的誘變，為許多下一代育種策略奠定了基礎(chǔ)，這些策略將徹底改變農(nóng)業(yè)的未來(lái)。為了充分利用植物基因組編輯的潛力，必須探索所有方法。基因組編輯允許合理地將遺傳性狀的組合設(shè)計(jì)到作物中。這些精確有效的技術(shù)用于快速植物育種時(shí)，其結(jié)果類似于經(jīng)典育種。但是，基于基因組編輯的下一代育種不可能完全取代傳統(tǒng)方法。只有結(jié)合其他技術(shù)，例如高通量表型，基因組選擇和快速育種，我們才能保證基因組編輯在農(nóng)業(yè)中的廣泛實(shí)施。這種多學(xué)科的方法將促進(jìn)植物育種，以幫助實(shí)現(xiàn)第二次綠色革命，從而滿足在不斷變化的氣候條件下快速增長(zhǎng)的全球人口不斷增長(zhǎng)的糧食需求。

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