【摘要】：目的:針刺療法適用于臨床多種疾病,其中包括心肌缺血。大量的實驗和臨床研究結(jié)果表明針刺對心肌缺血具有確切的療效和優(yōu)勢。以往的研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血與心肌細胞鈣離子通道關(guān)系密切,但對于針刺對心肌缺血鈣離子通道影響的相關(guān)研究并不多見,而對于針刺作用的傳入機制仍在研究之中。故本研究觀察針刺內(nèi)關(guān)穴對正常及特定基因敲除小鼠心肌細胞鈣離子通道及其相關(guān)蛋白表達的影響,從而探討針刺循經(jīng)特異性效應(yīng)對心肌缺血鈣離子通道的影響以及針刺作用的傳入機制,揭示經(jīng)穴效應(yīng)循經(jīng)特異性心臟鈣離子通道響應(yīng)模式及特征。同時,隨著人們生活節(jié)奏的加快以及競爭壓力的加劇,臨床上由抑郁癥誘發(fā)或加重的心肌缺血發(fā)病率逐年升高,隨著生物醫(yī)學(xué)模式向生物-心理-社會醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變,抑郁癥與心肌缺血在發(fā)病及治療上的相關(guān)性受到越來越多的重視。已有研究證實抑郁癥可通過下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸介導(dǎo)心肌缺血的發(fā)病,而針刺對抑郁癥與心肌缺血均有良好的療效,故本研究建立慢性應(yīng)激抑郁大鼠模型,模擬臨床抑郁癥的病理表現(xiàn),將心肌缺血大鼠與心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁大鼠進行對照,觀察兩種模型大鼠HPA軸相關(guān)指標含量的差異以及心肌細胞鈣離子通道及其相關(guān)蛋白表達的差異,并觀察針刺對兩種模型大鼠HPA軸相關(guān)指標含量以及心肌細胞鈣離子通道蛋白表達影響的差異,探討慢性應(yīng)激抑郁與心肌缺血在發(fā)病及治療上的相關(guān)性,為臨床治療與抑郁癥相關(guān)的心肌缺血提供指導(dǎo)。材料與方法:1.在研究電針內(nèi)關(guān)穴對心肌缺血小鼠心肌細胞鈣離子通道影響的實驗中,選用24只野生C57BL/6(SPF級)小鼠和21只同品系酸敏感離子通道3(Acid-sensing Ion Channel3,ASIC3)基因敲除(ASIC3-/-)小鼠(SPF級),各自隨機分為5組,分別為正常組、模型組、內(nèi)關(guān)組、列缺組和非經(jīng)非穴組,采用多點皮下注射異丙腎上腺素(20mg/kg)的方法建立心肌缺血模型,觀察造模前,造模后,針刺后心電圖ST段、T波和心率的變化;觀察超聲心動圖心臟收縮和舒張功能相關(guān)參數(shù)變化,包括:左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd),左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs),舒張早期心室二尖瓣峰值速度比舒張晚期心室二尖瓣峰值速度(E/A),射血分數(shù)(EF),每搏輸出量(SV)和左室短軸縮短率(FS);用光鏡觀察心肌組織形態(tài)變化;ELISA法檢測血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脫氫酶(LDH)含量;采用Western-blot法檢測鈣離子通道及其相關(guān)蛋白表達,包括:鈣離子通道亞基Cavα1C、Cavβ、Cavα2-δ1以及鈣調(diào)蛋白(Ca M)、鈣調(diào)蛋白激酶II(Ca MKII)。2.在研究慢性應(yīng)激抑郁與心肌缺血相關(guān)性的實驗中,選擇50只SD大鼠隨機分為5組,分別為正常組、心肌缺血模型組、心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁模型組、內(nèi)關(guān)治療1組(內(nèi)關(guān)穴治療心肌缺血組)、內(nèi)關(guān)治療2組(內(nèi)關(guān)穴治療心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁組),對心肌缺血模型組和內(nèi)關(guān)治療1組采用多點皮下注射異丙腎上腺素(85mg/kg)的方法建立心肌缺血模型,對心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁模型組、內(nèi)關(guān)治療2組采用多點皮下注射異丙腎上腺素(85mg/kg)+強制束縛加游泳的方法建立心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁模型,電針內(nèi)關(guān)穴治療后,采用Western-blot法檢測下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)蛋白表達,采用ELISA法檢測血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醇(CORT)的含量,采用Western-blot法檢測心肌細胞鈣離子通道及其相關(guān)蛋白表達,包括:鈣離子通道亞基Cavα1C、Cavβ、Cavα2-δ1以及鈣調(diào)蛋白(Ca M)、鈣調(diào)蛋白激酶II(Ca MKII)。3.結(jié)果:1.C57BL/6和ASIC3-/-兩種小鼠心肌缺血后,除正常組外,其他各組小鼠心電圖ST段及T波幅值均有不同程度的抬高,并且出現(xiàn)心率降低,與本組造模前比較均有顯著性差異(P0.01),說明小鼠心肌缺血造模成功。針刺治療后,內(nèi)關(guān)組、列缺組和非經(jīng)非穴組ST段和T波幅值均出現(xiàn)降低趨勢,各自與本組造模后比較有顯著性差異(P0.01),與模型組治療后比較有顯著性差異(P0.01)。內(nèi)關(guān)組ST段和T波降低更加明顯,與列缺組和非經(jīng)非穴組比較有顯著性差異(P0.01),但未恢復(fù)到正常水平。針刺治療后,內(nèi)關(guān)組、列缺組和非經(jīng)非穴組心率未出現(xiàn)明顯改變,各自與本組造模后比較無顯著性差異(P0.05)。與ASIC3-/-小鼠內(nèi)關(guān)組比較,C57BL/6小鼠內(nèi)關(guān)組ST段和T波幅值降低更加明顯,有顯著性差異(P0.01)。2.C57BL/6和ASIC3-/-兩種小鼠心肌缺血后,除正常組外,其他各組小鼠超聲心動圖LVIDd、LVIDs值較本組造模前均有不同程度的增加,E/A、EF、FS及SV值較本組造模前均有不同程度的降低,具有顯著性差異(P0.01),針刺治療后,內(nèi)關(guān)組、列缺組和非經(jīng)非穴組LVIDd值降低,E/A升高,各自與本組造模后比較有顯著性差異(P0.01),與模型組治療后比較有顯著性差異(P0.01)。內(nèi)關(guān)組LVIDd值的降低及E/A值的升高更加明顯,與列缺組和非經(jīng)非穴組比較有顯著性差異(P0.01),但未恢復(fù)到正常水平。與ASIC3-/-小鼠內(nèi)關(guān)組比較,C57BL/6小鼠內(nèi)關(guān)組LVIDd值及E/A值的改善更加明顯,有顯著性差異(P0.01)。針刺治療后,內(nèi)關(guān)組、列缺組和非經(jīng)非穴組的LVIDs值、EF、FS及SV值的改善不明顯,各自與本組造模后比較無顯著性差異(P0.05)。3.通過光鏡檢測心肌缺血心肌組織形態(tài)發(fā)現(xiàn),對于C57BL/6和ASIC3-/-兩種小鼠,電針內(nèi)關(guān)穴、列缺穴和非經(jīng)非穴均對心肌缺血兩種小鼠心肌有一定的保護作用,但內(nèi)關(guān)穴對兩種小鼠的心肌保護作用更大。4.C57BL/6和ASIC3-/-兩種小鼠心肌缺血后,與正常組比較,模型組小鼠血清CK-MB及LDH含量均有不同程度的增加(P0.01),證實心肌缺血造模成功。C57BL/6和ASIC3-/-兩種小鼠心肌缺血后,與正常組比較,模型組小鼠心肌細胞鈣離子通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表達均有不同程度的增加(P0.01)。針刺后,與模型組比較,內(nèi)關(guān)組、列缺組和非經(jīng)非穴組Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表達明顯降低,有顯著性差異(P0.01),內(nèi)關(guān)組Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表達降低更加明顯,與列缺組和非經(jīng)非穴組比較有顯著性差異(P0.01),但未恢復(fù)到正常水平。與ASIC3-/-小鼠內(nèi)關(guān)組比較,C57BL/6小鼠內(nèi)關(guān)組Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表達的改善更加明顯,有顯著性差異(P0.01)。5.與正常組、心肌缺血模型組以及內(nèi)關(guān)治療1組比較,心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁組和內(nèi)關(guān)治療2組大鼠體重增加減慢,蔗糖攝入量減少,存在顯著性差異(P0.01),提示造模方法可誘發(fā)大鼠慢性應(yīng)激抑郁的發(fā)生。電針治療第2天,電針治療第4天,電針治療第7天時,與心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁組比較,內(nèi)關(guān)治療2組大鼠體重增加加快,蔗糖攝入量增加,存在顯著性差異(p0.01)。提示電針治療可改善慢性應(yīng)激抑郁合并心肌缺血大鼠體重增加和蔗糖攝入量。與正常組比較,心肌缺血模型組和心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁模型組大鼠心肌細胞鈣通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表達均增加,存在顯著性差異(P0.01),與心肌缺血模型組比較,心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁模型組大鼠室旁核CRH蛋白表達,血清ACTH及CORT含量均升高,心肌細胞鈣通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表達均增加,存在顯著性差異(P0.01),提示慢性應(yīng)激抑郁加重大鼠HPA軸功能亢進,加重心肌細胞鈣離子通道蛋白表達的升高。內(nèi)關(guān)穴治療后,與心肌缺血模型組比較,內(nèi)關(guān)治療1組大鼠鈣通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表達降低,存在顯著性差異(P0.01);與心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁模型組比較,內(nèi)關(guān)治療2組CRH蛋白表達、血清ACTH及CORT含量,鈣通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表達降低,存在顯著性差異(P0.01)。提示:電針內(nèi)關(guān)穴可明顯改善心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁大鼠HPA軸相關(guān)指標CRH蛋白表達的升高、血清ACTH及CORT含量的升高,抑制鈣通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表達的異常增加。結(jié)論:1.心肌缺血時,心電圖、超聲心動圖、光鏡、心肌細胞鈣通道及其相關(guān)蛋白表達發(fā)生改變;針刺內(nèi)關(guān)穴可改善以上相關(guān)指標。說明針刺內(nèi)關(guān)穴對心肌缺血心肌細胞具有保護作用,針刺的循經(jīng)特異性效應(yīng)在心臟鈣通道的響應(yīng)模式是改善鈣通道及其相關(guān)蛋白表達的異常升高,抑制鈣超載。2.心肌缺血時,ASIC3基因敲除和未敲除小鼠均出現(xiàn)心電圖、超聲心動圖、光鏡、心肌細胞鈣通道蛋白相關(guān)指標的改變,針刺內(nèi)關(guān)穴可改善兩種小鼠以上相關(guān)指標,對于ASIC3基因未敲除小鼠改善作用大于對ASIC3基因敲除小鼠的改善作用,說明針刺作用的傳入途徑可能是激活A(yù)SIC3受體離子通道,進而抑制交感神經(jīng),從而改善異丙腎上腺素興奮交感神經(jīng)后引起的心肌缺血。3.心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁的心肌細胞鈣離子通道蛋白表達明顯高于心肌缺血的鈣通道蛋白表達,說明慢性應(yīng)激抑郁加重心肌缺血損傷,心肌缺血與慢性應(yīng)激抑郁在發(fā)病上具有相關(guān)性。電針內(nèi)關(guān)穴可改善心肌缺血大鼠及心肌缺血合并慢性應(yīng)激抑郁大鼠HPA軸亢進和心肌細胞鈣離子通道表達,說明內(nèi)關(guān)穴既可以治療心肌缺血,又可以治療慢性應(yīng)激抑郁,兩病均可以用內(nèi)關(guān)穴進行治療,提示心肌缺血與慢性應(yīng)激抑郁在治療上具有相關(guān)性。4.以上結(jié)論證實經(jīng)穴-臟腑相關(guān),慢性應(yīng)激抑郁-心肌缺血相關(guān),為經(jīng)穴-臟腑相關(guān)性及抑郁癥與心肌缺血相關(guān)性提供理論依據(jù)。
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