前言
很多研究僧在詢問如何查詢基因序列、如何進行引物設計、如何使用BLAST 進行序列比對……，這些問題在 NCBI 上都可以方便的找到答案。
交流經(jīng)驗的時間到啦！
接下來本文將按以下幾個部分說一下 NCBI 的使用：
Part 1：如何查找基因序列、mRNA、Promoter
Part 2：如何查找連續(xù)的 mRNA、cDNA、蛋白序列
Part 3: 運用 STS 查找已經(jīng)公布的引物序列
Part 4:如何運用 BLAST進行序列比對、檢驗引物特異性
1、利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、啟動子（Promoter）
下面以人的 IL6（白細胞介素 6）為例講述一下具體的操作步驟
1． 打開Map viewer 頁面， 網(wǎng)址為： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/index.html 在 search 的下拉菜單里選擇物種，for 后面填寫你的目的基因。操作完畢如圖所示：
2．點擊“GO”出現(xiàn)如下頁面：
3． 在步驟二圖示的右下角有一個Quick Filter,下面是讓你選擇的幾個復選框， 在Gene前面的小方框里打勾，然后點擊Filter. 出現(xiàn)下圖：
說明一下：1、染色體的紅色區(qū)域即為你的目的基因所處位置。2、下面參考序列給出了三個，是不同的部門做出來的，經(jīng)我驗證，序列有微小的差異，但總體來說基本相同。盡管你分別點擊后，序列代碼、序列代碼等有所差異，但堿基基本一致，不影響大家研究分析序列?，F(xiàn)在普遍采用的是最上面的那個序列，這一條是世界范圍的生物科學家用計算機合成的一個序列。我也推薦大家使用這個序列。
4．點擊上述三條序列第一條序列（即 reference）對應的'Genes seq'，出現(xiàn)新的頁面，頁面下方為：
5．點擊上圖出現(xiàn)的“Download/View Sequence/Evidence ”，即下載查看序列等功能，結果如圖所示：
先對上面這張圖做點簡要的說明，在 Sequence Format（序列輸出格式）后面是一個下拉式選擇菜單，默認的為 FASTA 格式，還有一個是 GenBank 格式。我推薦大家選擇 GenBnak格式，因為這個格式提供了很多該基因的信息，而 FASTA格式只有基因序列。
6．在 Sequence Format 后選擇 GenBank，然后點擊下面的 Display，目的基因的相關信息和序列就出現(xiàn)在眼前了。點擊后如圖所示（網(wǎng)頁較大，只抓取一小部分以作示范） ：
在上述打開的網(wǎng)頁中，你可以看到基因長度，基因序列，以及這個基因是如何被報道出來的等各種信息。 你會看到: mRNA join(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..8394) 這代表了從基因的 3598位開始就是轉錄區(qū)了， 即我們常說的 mRNA 片斷， 由于內(nèi)含子的存在，所以 mRNA 在DNA 序列上分成了幾段。 CDS join(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..7970) CDS 代表編碼序列，即蛋白編碼區(qū)是從 3660 開始的（ATG） ，由于剪接作用所以 CDS 區(qū)也是不連續(xù)的。
說到這里，可能很多朋友都已經(jīng)明白了 promoter 即啟動子區(qū)域在哪里了。但我還是再嘮叨幾句：轉錄起始位點前面是基因的調(diào)控區(qū)，啟動子區(qū)沒有明顯的位置定義，大家也只是猜測它的大體位置，如果你要研究 promoter 區(qū)的話，建議你選擇轉錄起始位點前的 2000個堿基進行研究，一般默認的是這樣。當然你如果覺得長度太長不好研究的話，也可以只研究-1000 到0這一千個堿基，因為一般情況下，啟動子區(qū)的變異都在這個區(qū)域內(nèi)。
這樣大家就可以找到自己的目的基因序列和啟動子了，這種方法可能使用的人不是很多，但我個人比較喜歡，因為它最大的優(yōu)點是可以找到啟動子區(qū)域和其他調(diào)控區(qū)域。希望大家可以發(fā)帖交流，讓我們把 NCBI 用的更好！
2、如何查找連續(xù)的mRNA、cDNA、蛋白序列（依然以人類的 IL6 為例）
1．進入NCBI 主頁：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 在 search 后面選擇 Gene，在 for 后面填寫需要查找的基因的名字。如圖所示：
出現(xiàn)了很多基因序列，在每個序列的右邊還有“Order cDNA clone” 的鏈接，這些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是別名（Other Aliases）與你的目的基因一致，根據(jù)每個序列的介紹認真選擇你的目的基因。上圖中我需要的 IL6 是標號為2的序列。
2.1 查找 cDNA 序列
2.1.1 點擊Order cDNA clone, 出現(xiàn)目的頁面如圖所示：
2.1.2 點擊Clone Sequence 后面的鏈接即可得到cDNA 序列。點擊后如圖所示（只抓取其中一部分）
2.2 查找 mRNA、蛋白序列
回到步驟 1 點擊“Go”之后出現(xiàn)的頁面，點擊目的基因的名字，出現(xiàn)以下頁面 (只抓取相關部分)：
頁面的下半部分，即可以獲取 mRNA和蛋白序列的部分：
找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，它分為幾個板塊，第一個“mRNA and Protein ”區(qū)可以讓我們找到連續(xù)的編碼 mRNA 序列和蛋白序列。在 mRNA and Protein下面有兩個序列代碼（中間劃有一個箭頭） ，這代表了 mRNA序列和蛋白序列。分別點擊就可以得到相應的序列頁面。點擊后如圖所示，mRNA 序列：
NCBI Reference Sequences (RefSeq)的第二個板塊是 Reference assembly，它下面顯示的是 Genomic ，點擊 Genomic 下面Reference assembly 對應的 Genbank 或 FASTA 即可出現(xiàn)編碼的 DNA 序列（注意：只是編碼序列，其中包括內(nèi)含子，但一般沒有 5‘非編碼區(qū)） 。一步就不做貼圖演示了吧，
這樣我們就可以找到基因的 cDNA 序列、連續(xù)的編碼 mRNA 序列、蛋白序列以及含有內(nèi)含子的編碼DNA 序列了。相信這些操作對很多戰(zhàn)友還是有用的。
友情提示：在 NCBI 里打開的每一個頁面都會給我們提供大量的信息，大家不妨好好看看，可能會有令我們驚喜的收獲！
3、運用STS 查找已經(jīng)公布的引物序列
STS，序列標簽位點（Sequence Tagged Site）：一段短的DNA 序列（200－500 個堿基對），這種序列在染色體上只出現(xiàn)一次，其位置和堿基順序都是已知的。在PCR 反應中可以檢測處STS 來，STS 適宜于作為人類基因組的一種地標，據(jù)此可以判定DNA 的方向和特定序列的相對位置。以上內(nèi)容基本是STS 的定義，要活學活用，下面就介紹一下用STS 數(shù)據(jù)庫查找引物的一點經(jīng)驗。
還是使用人的IL6 基因為例，
1． 打開 NCBI 主頁，在 Search 后面的下拉菜單選擇 UniSTS，在 FOR 后面填寫目的基因。
操作完畢如圖所示
點擊GO以后出現(xiàn)以下頁面
這是你會發(fā)現(xiàn) NCBI 又提供了很多序列，下面我們還是要初步篩選我們需要的序列。
2．根據(jù)物種、目的引物所在染色體的位置等選擇相應序列（可能不只一個） ，點擊。 下面以點擊第一個進入的畫面為例。
你會發(fā)現(xiàn)這個頁面直接就給出了引物序列，PCR之后的片段長度也是給了的（247bp） 。下面還有很多相關的信息……
3．點擊GeneBank Accession 后面的代碼，進入下一個頁面。
前后引物都呈現(xiàn)在眼前了，還有反應體系和反應條件！其中 Primer A 是前引物序列，Primer B 則是后引物序列，并且給出了他們在 DNA 序列中的位置。有興趣的朋友可以在序列中找一下，是可以找到的， 不過要注意，PCR 是雙鏈擴增，在序列中可以直接找到的是 Primer A 的原序列 和 Primer B的互補序列。
在步驟二里面我只點開了一個序列，繼續(xù)打開其他的可能還會有對自己有用的引物，不過這要你自己慢慢發(fā)掘了。
這種尋找引物的方法有點投機取巧的味道，實用程度不是很高，但如果這里面恰好有你想 P 的片段的話，恭喜你，這些引物都是很成熟的引物，可以直接拿過來使用了。
如果這兩種方法都不能找到你需要的引物的話， 那就自己設計吧， 建議使用 Primer 5 和 Oligo。
4、如何運用 BLAST 進行序列比對、檢驗引物特異性
提到序列比對，絕大多數(shù)戰(zhàn)友都會想到 BLAST，但 BLAST 的使用確實又是一個很大的難題， 因為他的功能比較強悍， 里面涉及到的知識比較多， 而且比對結束后輸出的結果參數(shù) （指標）又很多。如果把 BLAST 的使用詳細的都講出來，我想我發(fā)帖發(fā)到明天也發(fā)不完，更何況我自己也不是完全懂得 BLAST 的使用。 所以我在這里也就“畫龍點睛”——以比對核酸序列為例來給大家介紹一下 BLAST 的使用， 也算是 BLAST 的入門課程吧。 請看帖的戰(zhàn)友好好體會，如果你用心看，在看帖完畢之后 BLAST 的基本使用（包括其他序列的比對）應該沒有問題了。
1．打開BLAST 頁面，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 打開后如圖所示：
對上面這個頁面進行一下必要的介紹：
BLAST 的這個頁面主體部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂這三個短語的意思，我就不多說了；我要說的是，可以認為這是三種序列比對的方法，或者說是 BLAST 的三條途徑。
第一部分 BLAST Assembled Genomes 就是讓你選擇你要比對的物種，點擊相應物種之后即可進入比對頁面。
第二部分 Basic BLAST 包含了 5 個常用的 BLAST，每一個都附有簡短的介紹。
第三部分 Specialized BLAST 是一些特殊目的的 BLAST，如 IgBLAST、SNP 等等，這個時候你就需要在 Specialized BLAST部分做出適當?shù)倪x擇了。
總之， 這是一個導航頁面， 它的目的是讓你根據(jù)自己的比對目的選擇相應的 BLAST 途徑。
下面以最基本的核酸序列比對來談一下 BLAST的使用， 期間也會捎帶著說一下其他序列比對的方法。
2． 點擊Basic BLAST部分的nucleotide blast 鏈接到一個新的頁面。打開后如圖所示：
介紹一下上述頁面：
Enter Query Sequence 部分是讓我們輸入序列的，你可以直接把序列粘貼進去，也可以上傳序列，還可以選擇你要比對的序列的范圍（留空就代表要比對你要輸入的整個序列） 。Job Title 部分還可以為本次工作命一個名字。
Choose Search Set 部分是讓我們選擇要與目的序列比對的物種或序列種類（genome DNA、mRNA 等等） 。如果是人或老鼠的話，就可以直接選擇了如果是其他物種就要選擇“others”了，這時候網(wǎng)頁會主動跳出一個下拉對話框和一個輸入式對話框，你可以分別選擇和輸入要跟你的序列比對的序列種類和物種。下面的 Entrez Query 可以對比對結果進行適當?shù)南拗啤?/span>
Program Selection 部分其實是讓我們選擇本次比對的精確度，種內(nèi)種間等等。
在 BLAST 按鈕下面有一個“Algorithm parameters” ，這是參數(shù)設置選項，一般用戶使用不到此項，所以它比較隱蔽，點擊，原網(wǎng)頁下方即可增加了 Algorithm parameters 的內(nèi)容。大部分戰(zhàn)友都用不到更改這里面的選項，我也不多說了，有興趣的朋友可以自己研究一下。
3．依次填寫上述網(wǎng)頁必須部分，點擊 BLAST 按鈕后，出現(xiàn)如下界面（只截取其中一部分） ：
出現(xiàn)的這個結果頁面信息含量非常大，如果我們用心觀察，還是可以發(fā)現(xiàn)其中的一些主要指標的。列舉上圖也是為了給大家展示一下這些評價標準。其中 Description 部分推薦大家詳細看一下，另外說一下“E value” 這個指標與其他指標不同，它的數(shù)值越小相似程度越高，其他幾個（如 Totle score）都是數(shù)值越高相似度越高。
在這個圖示的表格下方就是具體的相似性的核酸序列了，還配合著各種參數(shù)的得分。
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