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作者：何明燕 夏景林

單位：復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所

目前肝癌的臨床管理主要包括對高危人群的定期監(jiān)測、早期發(fā)現(xiàn)、早期治療以及對肝癌患者的積極治療和隨訪。治療主要包括手術(shù)治療和局部治療。早期肝癌患者首選外科手術(shù)治療，術(shù)后5年生存率達(dá)50%～70%，但腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率也高達(dá)50%～80%。肝移植較肝葉切除具有復(fù)發(fā)率低及生存率高的優(yōu)點(diǎn)，但供體短缺限制其在肝癌治療中的應(yīng)用。肝動脈化療栓塞、射頻微波、酒精局部注射、放療、中醫(yī)藥以及索拉菲尼是多數(shù)中晚期肝癌和肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)患者的主要治療方式，對延緩肝癌進(jìn)展和延長生存期具有一定作用。隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)為肝癌的臨床管理注入新鮮血液，為肝癌研究提供新的思路。其旨在通過人類基因組數(shù)據(jù)及相關(guān)大數(shù)據(jù)平臺對疾病內(nèi)在生物學(xué)特征和臨床表型等進(jìn)行整合，并依據(jù)整合結(jié)果對疾病亞型進(jìn)行分子水平的細(xì)分，從而提供精準(zhǔn)的診療方案，且在評估療效和預(yù)測預(yù)后等方面具有一定的優(yōu)勢。但由于肝癌本身的基因組不穩(wěn)定及高度異質(zhì)性導(dǎo)致肝癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實(shí)踐之路困難重重。本文通過闡述肝癌基因組不穩(wěn)定及其異質(zhì)性，探討肝癌液體活檢及靶向藥物研發(fā)所面臨的挑戰(zhàn)。

基因組不穩(wěn)定是癌癥發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)，有2種表現(xiàn)形式：有絲分裂缺陷相關(guān)染色體不穩(wěn)定性（CIN）及DNA代謝缺陷相關(guān)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MIN）。一般來說，CIN較MIN預(yù)后更差，因?yàn)镃IN更易引起基因組的嚴(yán)重突變，如染色體碎裂、拷貝數(shù)異常等。多數(shù)肝癌細(xì)胞存在明顯的基因組不穩(wěn)定性，且以CIN較為常見。染色體臂的缺失突變以及染色體臂獲得性突變，在肝癌中多次被報(bào)道。其中，4q及16q的缺失在乙肝相關(guān)性肝癌中發(fā)生頻率較高，染色體臂1p缺失在分化較好的肝癌細(xì)胞或不典型增生結(jié)節(jié)以及肝硬化結(jié)節(jié)中檢出率較高。CIN變異小鼠模型也證實(shí)，高程度CIN變異具有自發(fā)腫瘤傾向，如CIN相關(guān)基因Sgo1缺陷的小鼠易自發(fā)肝癌。

當(dāng)代腫瘤學(xué)研究和基因深度測序等方法已確定多種癌癥相關(guān)基因突變和表觀遺傳學(xué)錯(cuò)配與癌癥基因組不穩(wěn)定性密切相關(guān)。在肝癌細(xì)胞中，這些基因主要涉及以下幾條信號通路：（1）原癌基因信號通路；（2）DNA損傷修復(fù)信號通路；（3）氧化應(yīng)激途徑；（4）細(xì)胞周期；（5）免疫調(diào)節(jié)信號通路。其中，原癌基因信號通路異常主要發(fā)生于Wnt、Smad及表皮生長因子受體（EGFR）等信號通路相關(guān)基因，如Wnt通路中β-catenin基因CTNNB1（20%～40%）、Axin1（9%～13%）和Zic3（5%）基因，Smad通路中Wwp1（9%）基因，以及EGFR通路中Errfi1（5%）基因等。肝癌中這些基因通常發(fā)生功能獲得型突變，導(dǎo)致原癌基因信號通路活化，進(jìn)而引起低級別CIN和基因組不穩(wěn)定。肝癌中DNA損傷修復(fù)信號通路突變以TP53基因?yàn)榇恚s35%～50%肝癌中含TP53突變。該基因在維持基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，其功能缺失可引起中心體擴(kuò)增、異倍體細(xì)胞繁殖以及染色體不穩(wěn)定等，尤其當(dāng)TP53突變合并抑癌蛋白pRb功能缺陷或紡錘體檢測點(diǎn)缺陷時(shí)，更易引起高級別CIN和基因組不穩(wěn)定。其他肝癌細(xì)胞中常見突變基因還包括CDKN2A、TERT和MLL2等，參與細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激、免疫炎性反應(yīng)等信號通路。除癌癥相關(guān)基因異常外，乙型肝炎病毒（HBV）及丙型肝炎病毒（HCV）感染也是誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定性發(fā)生的重要原因。其主要與以下3種途徑相關(guān)：（1）病毒蛋白直接干擾有絲分裂過程，引起CIN；（2）病毒基因整合至宿主基因組的特異位點(diǎn)，影響癌癥相關(guān)基因的表達(dá)和功能；（3）持續(xù)性慢性炎性反應(yīng)進(jìn)一步加重肝癌基因組不穩(wěn)定性?；蚪M不穩(wěn)定是肝癌高度異質(zhì)性、治療抵抗和腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要分子基礎(chǔ)，同時(shí)增加肝癌精準(zhǔn)病理診斷分型和精準(zhǔn)治療的難度。

肝癌異質(zhì)性是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。從病因上看，多數(shù)肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生與慢性肝病（包括肝炎病毒感染、酒精相關(guān)肝炎、非酒精性脂肪肝）、致癌物暴露（如黃曲霉素等）和遺傳等因素有關(guān)。慢性肝損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、再生和纖維化等，在此不良環(huán)境中，引起DNA損傷，驅(qū)動基因發(fā)生突變，環(huán)境抵抗的優(yōu)勢細(xì)胞克隆亞型存活并擴(kuò)增，從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。致病因素多變是不同患者間肝癌異質(zhì)性的基礎(chǔ)。在肝癌進(jìn)展過程中，微環(huán)境的變化進(jìn)一步促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生變異，壓力選擇下，產(chǎn)生更多克隆亞型，導(dǎo)致肝細(xì)胞性肝癌在基因組學(xué)、形態(tài)學(xué)和腫瘤進(jìn)展征象等方面均表現(xiàn)出高度異質(zhì)性。因此，肝癌異質(zhì)性包括時(shí)間和空間異質(zhì)性，時(shí)間異質(zhì)性是指在肝癌進(jìn)展過程中不同階段異質(zhì)性的逐漸增加，空間異質(zhì)性表現(xiàn)在肝癌內(nèi)部不同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞存在不同的特征以及肝癌患者間的腫瘤生物學(xué)行為差異。

肝癌細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性是肝癌具有高度異質(zhì)性的重要原因。不同于其他惡性腫瘤如乳腺癌或肺癌等具有多個(gè)決定腫瘤行為的遺傳變異標(biāo)志分子，肝癌細(xì)胞基因變異譜范圍廣，缺乏明確的遺傳變異特征。COSMIC數(shù)據(jù)庫提供的肝癌組織高頻突變基因如圖1所示，除TERT、TP53和CTNNB1突變頻率較高外，其他基因的突變率相對較低，均＜10%。肝癌組織中甲基化異?；蛞寻l(fā)現(xiàn)多達(dá)數(shù)千個(gè)，且在肝癌發(fā)生早期甚至在肝細(xì)胞不典型增生時(shí)期，DNA甲基化異常即可出現(xiàn)，并隨著肝癌發(fā)展和異質(zhì)性增加，DNA甲基化異常程度也進(jìn)一步增加。突變基因及表觀遺傳變異基因的數(shù)目之多、范圍之廣增加了肝癌精準(zhǔn)分子病理診斷的復(fù)雜性，提升了靶向治療研究的難度，是肝癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究面臨的最大挑戰(zhàn)。

液體活檢是指檢測血液或體液分泌物中的腫瘤相關(guān)分子標(biāo)志。目前研究較多的檢測內(nèi)容包括循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）及循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）。ctDNA及CTCs來源于原發(fā)腫瘤DNA或腫瘤細(xì)胞的釋放入血，因此能反映原發(fā)腫瘤的情況。與傳統(tǒng)組織病理活檢比較，液體活檢具有非侵入性、易操作性和可動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，克服了空間和時(shí)間異質(zhì)性的極限。可以通過檢測ctDNA及CTCs的分子特征分析癌癥的基因組信息，對癌癥進(jìn)行精準(zhǔn)的分子病理診斷，并提供靶向治療指導(dǎo)。液體活檢的連續(xù)取樣功能有助于肝癌高危人群的早期診斷，治療反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，耐藥評估，以及提前預(yù)測腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。如TP53基因突變是肝癌組織中最常見的突變，249T位點(diǎn)是TP53基因突變熱點(diǎn)，該突變已證實(shí)能在肝癌患者外周循環(huán)和尿液DNA中檢測到。研究顯示，在嚴(yán)重的肝硬化患者外周循環(huán)DNA中也能檢測到TP53249T突變，肝硬化是肝癌的癌前病變。這項(xiàng)結(jié)果提示，TP53249T突變可能在肝癌發(fā)生早期或癌前病變階段就已出現(xiàn)并釋放至外周循環(huán)中，進(jìn)一步研究有望對這部分ctDNA檢測陽性（TP53249T突變）的肝硬化患者進(jìn)行更為密切的影像學(xué)及甲胎蛋白隨訪，以期對早期病灶進(jìn)行積極處理。盡管液體活檢顯現(xiàn)出巨大優(yōu)勢，但由于肝癌異質(zhì)性的存在，液體活檢也僅能反映部分原發(fā)腫瘤的情況，且肝癌本身缺乏明確的遺傳變異標(biāo)志性分子，患者循環(huán)中CTCs及ctDNA的濃度低，這些因素限制了液體活檢在肝癌臨床上的應(yīng)用。以TP53249T突變?yōu)槔?，ctDNA中發(fā)現(xiàn)該突變也與結(jié)腸癌和乳腺癌等其他類型腫瘤有關(guān)，因此，循環(huán)DNA中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變表明，患者體內(nèi)可能有腫瘤存在，但特異性太低，對肝癌的診斷僅具有提示意義。

肝癌對傳統(tǒng)化療藥物不敏感。索拉菲尼是目前唯一被FDA批準(zhǔn)用于晚期肝細(xì)胞性肝癌治療的分子靶向藥物。該藥物是一個(gè)多激酶抑制劑，其作用靶點(diǎn)主要包括血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）、血小板源生長因子受體（PDGFR）和KIT等。但索拉菲尼的臨床試驗(yàn)結(jié)果不盡如人意，與安慰劑比較，其僅能延長晚期肝細(xì)胞癌患者2～3個(gè)月的生存期。且在索拉菲尼治療過程中，部分患者一開始對治療有反應(yīng)但很快產(chǎn)生耐藥，而對索拉菲尼治療失敗的患者進(jìn)行二線藥物的臨床試驗(yàn)也多以失敗告終。

肝癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容之一是根據(jù)基因和表觀特征將異質(zhì)性的肝癌細(xì)分成不同亞型，并制定精準(zhǔn)的治療方案。隨著腫瘤靶向藥物研究的深入，其他類型腫瘤信號通路抑制劑治療肝癌的臨床試驗(yàn)相繼展開，如抗血管生成分子制劑、c-Met抑制劑、mTOR抑制劑、MEK抑制劑和免疫調(diào)節(jié)劑等。一項(xiàng)MEK抑制劑聯(lián)合索拉菲尼治療中晚期肝癌的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)用與單用索拉菲尼比較并不能延長肝癌患者總生存期，但4例（4/69）肝癌患者ctDNA中存在KRAS、NRAS突變，其中3例經(jīng)refametinib治療后腫瘤得到明顯緩解，提示依據(jù)精準(zhǔn)的肝癌分子遺傳學(xué)分型進(jìn)行臨床試驗(yàn)，盡量減少不同肝癌患者之間的異質(zhì)性，可提高精準(zhǔn)治療療效，有望促進(jìn)靶向制劑的研發(fā)效率。然而，肝癌具有高度異質(zhì)性，目前未發(fā)現(xiàn)明確的標(biāo)志性遺傳變異分子，TERT、TP53和CTNNB1等基因突變，盡管在肝癌中已被證實(shí)為高頻突變基因，但仍未明確其在肝癌進(jìn)展過程中發(fā)揮“驅(qū)動基因”還是“路過基因”作用，限制了肝癌精準(zhǔn)靶向藥物臨床試驗(yàn)的開展。

肝癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究面臨最大的挑戰(zhàn)是肝癌基因組不穩(wěn)定性，導(dǎo)致肝癌的高度異質(zhì)性。由于肝癌缺乏明確的生物標(biāo)志基因，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)很難對肝癌進(jìn)行分子病理水平的精準(zhǔn)診斷和治療，從而影響肝癌液體活檢技術(shù)的應(yīng)用和分子靶向藥物的研發(fā)。因此肝癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究任重而道遠(yuǎn)。但隨著大數(shù)據(jù)計(jì)算工具和云計(jì)算等手段的不斷進(jìn)步，對肝癌基因分子水平異質(zhì)性的認(rèn)識程度也會日益增加，未來肝癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在肝癌臨床管理中的重要性也將日益突出。