血液病綜合診斷學(xué)術(shù)交流--美博邦血液病診斷論壇旗下訂閱號
翻譯：陳雪艷 深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院
審校：陳宏偉 秦皇島市第一醫(yī)院
歷史背景：
70年前血液學(xué)專家就在骨髓中發(fā)現(xiàn)了一類與眾不同的“淋巴樣細(xì)胞”。Vogel等用hematogones（源自拉丁語hematogonia，意指血液標(biāo)志物）描述發(fā)現(xiàn)于兒童胸骨骨髓涂片的一類意義未明的細(xì)胞。在以后幾十年里由于這類細(xì)胞的確切性質(zhì)和功能一直不得而知而被認(rèn)為是一類未分化的干細(xì)胞。隨著70、80年代免疫學(xué)和流式細(xì)胞學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展，這類細(xì)胞的神秘面紗終于被揭開了。70年代學(xué)者應(yīng)用間接免疫熒光和流式細(xì)胞學(xué)等技術(shù)發(fā)現(xiàn)健康人群骨髓中一些數(shù)量不等的不成熟細(xì)胞和B-ALL患者的原始細(xì)胞的免疫表型相似。這些免疫標(biāo)記物包括TdT、HLA-DR、CD19、CD34和CD10。那時(shí)，這些幼稚細(xì)胞被認(rèn)為是B淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞，也是“正常的骨髓原始淋巴細(xì)胞”。這些幼稚細(xì)胞中只有一小部分表達(dá)CD34和TdT。根據(jù)CD19、CD10等抗體表達(dá)不同將它們分為Pre-B和Pro-B兩類，這些細(xì)胞即為hematogones。直到20世紀(jì)90年代隨著廣泛的細(xì)胞免疫表型的深入和多參數(shù)流式細(xì)胞儀的使用，hematogones的免疫表型的特點(diǎn)及其分化成熟過程得以清晰地呈現(xiàn)出來。
概念澄清：Hematogones不等于B祖細(xì)胞，Hematogones為正常的B淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞，英文與B-lymphocyte precursors同義，B祖細(xì)胞，英文為B-cell progenitors。
Hematogones和B祖細(xì)胞關(guān)系：
B細(xì)胞成熟過程：
1、祖細(xì)胞逐步向B祖細(xì)胞分化。祖細(xì)胞（CD34+CD38-）獲得CD38，并丟失CD13、CD117、CD123及CD33。
2、B祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為B淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞（hematogones）。B祖細(xì)胞（CD34+TdT+ CD79a+CD10+）獲得CD19轉(zhuǎn)化為hematogones。Hematogones分為3個(gè)階段（具體請見下文“免疫表型特點(diǎn)”部分）
3、成熟B細(xì)胞。3期的hematogones完全失去CD10，轉(zhuǎn)化為成熟B細(xì)胞。
參考：SindhuCherian, Brent Wood主編《Flow Cytometry inevaluation of hematopoietic neoplasms》。
細(xì)胞起源：
起初人們認(rèn)為來自胎兒肝臟的CD34+CD10+ CD19-細(xì)胞可能是B淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的最早期發(fā)育階段，但有人發(fā)現(xiàn)髓系前體細(xì)胞如果表達(dá)這些表型可以產(chǎn)生巨噬細(xì)胞集落。進(jìn)一步的研究證實(shí)新生兒骨髓中共表達(dá)CD10和CD19的細(xì)胞是最早期B系前體細(xì)胞（CD34+，CD10bri，CD19dim）。CD19具有系別特異性并且是B淋巴細(xì)胞的特異標(biāo)志。
形態(tài)特點(diǎn)：
Hematogones是通常在骨髓里發(fā)現(xiàn)的淋巴樣細(xì)胞。在骨髓活檢切片里，它通常單個(gè)散在或聚集成小簇分布而不會形成大的集落。骨髓涂片是觀察hematogones形態(tài)的最佳選擇。細(xì)胞大小與其成熟發(fā)育階段相關(guān)，直徑10~20μm不等。發(fā)育最成熟的hematogones形態(tài)上與成熟淋巴細(xì)胞相似，細(xì)胞染色質(zhì)聚集或粗糙，明亮有光澤；較幼稚的hematogones細(xì)胞和ALL中的原始淋巴細(xì)胞十分相似，在某些病例中形態(tài)上難以區(qū)別，原因在于這類hematogones 核為圓形或橢圓形，經(jīng)常有切跡，染色質(zhì)模糊、涂抹感，甚至在某些情況下可見清晰的核仁?？傊?，典型的hematogones胞漿很少；如果可見，胞漿嗜堿性，缺乏顆?；蚩张荨Ｓ捎趶男螒B(tài)上難以將hematogones和腫瘤性的原始淋巴細(xì)胞區(qū)分出來，骨髓中增多的hematogones容易引起診斷上的錯(cuò)誤。更棘手的問題是二者在免疫表型上也有相同之處。這種形態(tài)和免疫表型的重疊尤其在評價(jià)化療后的骨髓重建和B-ALL患者的MRD檢測時(shí)比較麻煩。
Hematogones的分布特點(diǎn)：
通常運(yùn)用流式細(xì)胞儀可在骨髓中檢出少量的hematogones；除了新生兒和臍血外，外周血形態(tài)學(xué)檢查很少能查出hematogones。最近有人用敏感性較高的流式方法在成人外周血中檢測到極低水平的hematogones。胎兒的臍血和骨髓里hematogones是最普通的一種細(xì)胞。在髓外組織，例如扁桃體和淋巴結(jié)也可檢測到數(shù)量極低的hematogones。兒童的扁桃體和反應(yīng)性淋巴結(jié)的副皮質(zhì)區(qū)可見TdT+細(xì)胞單個(gè)或小簇狀分布于其中。
因?yàn)榻】嫡吆苌傩泄谴z查，所以至今也沒制定出hematogones的參考范圍。另外，骨髓細(xì)胞分離的方法也會影響檢出率。分離單個(gè)核細(xì)胞時(shí)密度梯度離心法比紅細(xì)胞溶解法可獲取更多的hematogones細(xì)胞數(shù)。早期的研究證實(shí)健康兒童的B淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)量高于成人，且隨著年齡的增長而下降。Lucio等研究表明健康兒童骨髓中hematogones的平均比例為7.15%（占骨髓全部有核細(xì)胞）。一項(xiàng)大型的前瞻性研究調(diào)查了662名各年齡段的患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約79.8%的調(diào)查者中檢出了hematogones，隨著年齡的增加檢出率相應(yīng)的下降，有趣的是各個(gè)年齡段的檢測數(shù)值變化范圍更廣，許多成人骨髓的比率也相對增高；8%的骨髓標(biāo)本中hematogones占有核細(xì)胞的5%或稍高，年齡小于16歲、大于等于16歲者分別有24.6%、6.3%的hematogones檢出。研究還未證實(shí)骨髓此類細(xì)胞的比例有性別差異。
免疫表型特點(diǎn)：
多參數(shù)的流式細(xì)胞儀和免疫過氧化物酶染色等技術(shù)的進(jìn)展使得準(zhǔn)確檢測骨髓中的hematogones成為可能。流式細(xì)胞儀提供了一個(gè)敏感而有效的方法進(jìn)一步描述其特征?；?/span>1988年Loken等最初的描述，hematogones發(fā)育成熟的三個(gè)階段被廣泛接受。三個(gè)階段分別用阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3期表示。
1期：也稱為可識別的最不成熟階段，通常只占全部hematogones非常小的一部分，但卻可以在再生的骨髓中明顯而快速的擴(kuò)充，通常表達(dá)CD34和TdT這類不成熟的標(biāo)記，弱表達(dá)CD19，相對強(qiáng)表達(dá)CD10和CD38，但不表達(dá)CD20。
2期：在多數(shù)骨髓標(biāo)本中，2期的比例相當(dāng)高，平均可達(dá)全部hematogones的65%，其特點(diǎn)為：原始細(xì)胞標(biāo)記物CD34和TdT丟失，CD19的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，而CD10表達(dá)逐漸減弱，CD38持續(xù)強(qiáng)表達(dá)，CD20開始表達(dá)。
3期：發(fā)育至3期時(shí)CD20的表達(dá)逐漸增強(qiáng)至成熟B淋巴細(xì)胞的水平，CD38的表達(dá)水平不一，所不同的是3期細(xì)胞可弱表達(dá)CD10,而成熟B淋巴細(xì)胞不表達(dá)。
最近的研究又發(fā)現(xiàn)了幾類發(fā)育成熟過程中hematogones的特征表型：1、2、3期hematogones都表達(dá)低水平的BCL2；與CD10的表達(dá)方式相似，CD43以一種可重現(xiàn)的方式表達(dá)于發(fā)育過程中的hematogones；但不會像慢性淋巴細(xì)胞白血病那樣高表達(dá)ZAP-70；cIgM常常在1期向2期過渡時(shí)開始出現(xiàn)。有意思的是從這些數(shù)據(jù)中可以明顯地看到B細(xì)胞分化發(fā)育的各期缺乏連續(xù)性，例如從1期過渡至2期時(shí)CD34和TdT突然丟失和cIgM突然出現(xiàn)，然而CD10和CD43的消失以及CD20的表達(dá)卻是逐級和連續(xù)的。
這些發(fā)育成熟的過程可以通過流式散點(diǎn)圖完整而清晰地表現(xiàn)出來。
A：Hematogones（綠色）和成熟淋巴細(xì)胞（紅色）比較，SSC小且CD45弱表達(dá)；
B：Hematogones顯示共表達(dá)CD19和CD10，散點(diǎn)圖衛(wèi)星樣分布與1期（CD19+dim/CD10+bright）、2期和3期（CD19+bright/CD10+dim）的hematogones表達(dá)一致。
C：隨著CD19+的hematogones成熟，CD20開始表達(dá)；
D：CD20和CD10組合時(shí)的特征圖形。
E：2期和3期占大部分hematogones（右下象限CD10＋dim/CD34－），1期比例低（右上象限CD10＋bright/CD34＋）；
F：2期和3期占大部分hematogones（右下象限CD19＋bright/CD34－）和比例低的1期（CD19＋dim/CD34＋）。
G：Hematogones可見 CD19 和CD43共表達(dá)；
H：2期和3期表達(dá)cIgM和CD19相對強(qiáng)表達(dá)，I期cIgM-CD19+ dim。
Hematogones 為何增多和減少？
和成人相比，兒科患者骨髓中hematogones的數(shù)量要多些，自免性或先天性血細(xì)胞減少、ITP、IDA和AIDS、骨髓轉(zhuǎn)移瘤、病毒感染等以及骨髓重建時(shí)（化療或骨髓移植后），hematogones的比例會更高一些。這些疾病hematogones增高的原因目前還不清楚。血細(xì)胞減少的兒科患者伴有hematogones增多時(shí)常常會給診斷帶來諸多挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@一現(xiàn)象常常被誤以為是白血病。
無論是血液性還是非血液性腫瘤浸潤骨髓，hematogones數(shù)量減低的程度與骨髓浸潤程度成正比。骨髓衰竭綜合征時(shí)（包括MDS和獲得性AA患者）也可見到此現(xiàn)象，這些骨髓衰竭綜合征有著相互重疊的臨床表現(xiàn)，并且有著相似的病理生理學(xué)機(jī)制，例如T-細(xì)胞介導(dǎo)的造血抑制。研究也證實(shí)MDS時(shí)與B淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟相關(guān)的一些基因表達(dá)會下調(diào)。
如何與白血病性原始淋巴細(xì)胞鑒別？
綠色區(qū)域?yàn)?/span>CD45 dim門，?代表hematogones， 代表B-ALL的原始淋巴細(xì)胞
如前所述，hematogones與B-ALL的原始淋巴細(xì)胞在形態(tài)和免疫表型上有著許多相似之處。除此之外，引起hematogones明顯增加的疾病臨床表現(xiàn)也與B-ALL的相似，比如全血細(xì)胞減少。在CD45/SSC的散點(diǎn)圖上，hematogones與B-ALL的原始淋巴細(xì)胞都位于CD45dim門內(nèi)，hematogones表現(xiàn)為SSC很小，并與成熟淋巴細(xì)胞門有連續(xù)發(fā)育的軌跡。而B-ALL的原始淋巴細(xì)胞SSC比hematogones要大一些（如上圖所示）。正常前體B細(xì)胞一般不存在跨系表達(dá)，而B-ALL的原始淋巴細(xì)胞經(jīng)常存在跨系表達(dá)，跨系表達(dá)常見的有：髓系CD33、CD13或CD15等抗體，T細(xì)胞CD2、CD5或CD7；還常見抗原的不同步表達(dá)：TdT和cIgM、CD34和CD20或CD34和表面輕鏈；抗原異常丟失：如CD45-的原始細(xì)胞；B-ALL伴MLL基因表達(dá)時(shí)CD10常陰性；B-ALL伴E2A-PBX1融合基因時(shí)CD34常陰性。相反，hematogones卻不存在以上表現(xiàn)，通常為一個(gè)連續(xù)、高重現(xiàn)性、逐步發(fā)育成熟的抗原表達(dá)方式，也不存在跨系和不同步表達(dá)。而且，即使hematogones和B-ALL的原始淋巴細(xì)胞二者都表達(dá)相同的抗原，也存在表達(dá)方式和表達(dá)水平的差異（例如TdT）。最近研究表明，通過細(xì)胞核TdT免疫熒光染色的表達(dá)模式能夠區(qū)別TdT高表達(dá)的hematogones（染色質(zhì)粗顆粒狀）和TdT低表達(dá)的原始淋巴細(xì)胞（染色質(zhì)均勻細(xì)顆粒狀）。之前也有研究證實(shí)每個(gè)hematogones細(xì)胞所含TdT和CD10分子的數(shù)量和表達(dá)強(qiáng)度均高于B-ALL的原始細(xì)胞，但是CD19的表達(dá)二者卻恰恰相反。在B-ALL復(fù)發(fā)的骨髓活檢標(biāo)本兩者的區(qū)別也有報(bào)道，hematogones一般散在分布于整個(gè)骨髓之中，而殘留的B-ALL的原始細(xì)胞往往呈5個(gè)以上原始細(xì)胞小簇狀分布。這種分布方式上的差別在CD34和TdT免疫組化染色上更加明顯!
未來前景：
盡管我們已經(jīng)了解了hematogones的生物學(xué)和免疫表型特點(diǎn)，但是仍然有許多未知領(lǐng)域仍需探索。首先，只有充分了解了正常的分化發(fā)育過程才可以真正認(rèn)識hematogones，這些工作都是在多色流式分析儀和多種免疫標(biāo)記物的復(fù)雜組合的協(xié)助下得以完成。至今還沒有出現(xiàn)任何單一的標(biāo)記物可以十分肯定地鑒別出hematogones，有待于發(fā)現(xiàn)更多的標(biāo)記物更準(zhǔn)確地區(qū)別hematogones和腫瘤性的原始淋巴細(xì)胞。其次，建立正常骨髓hematogones的參考范圍仍具挑戰(zhàn)性，根本原因在于健康人幾乎不做骨穿。再次，盡管已經(jīng)研究了不同生理和病理狀態(tài)下各種致hematogones增加或減少的原因，將來仍有許多方面值得去探索研究（例如，兒童MDS、先天性骨髓衰竭及PNH等）。最后，一些生理性刺激，常常發(fā)生于腫瘤和非腫瘤狀態(tài)下，與骨髓微環(huán)境的變化同步。而導(dǎo)致hematogones數(shù)量變化的骨髓微環(huán)境至今還有許多未解之謎，未來研究工作的重心將著力于此。
參考文獻(xiàn)：
[1] SevillaDW, Colovai AI, Emmons FN, et al. Hematogones: a review and update. Leukemia& Lymphoma, 2010, 51(1): 10-19.
[2] McKennaRW, Washington LT, Aquino DB, et al. Immunophenotypic analysis of hematogones(B-lymphocyte precursors) in 662 consecutive bone marrow specimens by 4-colorflow cytometry. Blood, 2001, 98(8): 2498-2507.
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