眾所周知，miRNA是一種非常非常重要的非編碼的小分子RNA。它們能夠調(diào)控干細胞的發(fā)育、代謝、分化、凋亡等等多種不同的生物進程。
現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，miRNA在結直腸癌的診斷、治療、預后中具有極大的潛力，但是要了解miRNA的作用機制，就不得不談到miRNA的靶標-mRNA了。
怎么找出CRC相關的miRNA，同時發(fā)現(xiàn)它們的靶標基因呢？讓我們看看這篇文章的作者怎么解決的（FIG1）。
首先作者找了8個CRC組織和8個正常組織，然后進行miRNA和mRNA測序分析（測序結果上傳到了NCBI，GSE35982，有興趣的可以再拿它換種方法分析一次，說不定有意外的驚喜）。
測序完就拿過來分析分析唄。利用t檢驗，作者發(fā)現(xiàn)了32個差異表達的miRNA和2916個差異表達的mRNA（fig2）。差異mRNA，2916個（想看的話可以從后臺下載文章）。
既然差異miRNA和mRNA都找出來了，自然是要分析它們之間的關聯(lián)。通常miRNA會負調(diào)控mRNA，即下調(diào)的miRNA與上調(diào)的mRNA可能能夠匹配，反之亦然。基于這樣的理論，作者找到了17360對miRNA-mRNA（也在附件里）。
當然，這些匹配結果是經(jīng)過篩選的（篩選條件包括皮爾森相關度小于-0.5，p值小于0.05，F(xiàn)DR值小于0.3值）。雖然現(xiàn)在有了這么多miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡，但是畢竟只是根據(jù)表達情況分析的，不夠可靠啊。
于是作者在17360個匹配結果的基礎上，通過miRanda，TargetScanHuman進行了預測和進一步篩選。最后發(fā)現(xiàn)了72個miRNA-mRNA pairs。其中有22對不僅在兩個數(shù)據(jù)庫中都預測到了，并且同時這些miRNA和mRNA的表達水平呈現(xiàn)良好的負相關性。
在這22對pairs中，包括14個上調(diào)的miRNA、8個下調(diào)的miRNA。它們分別對應43和15個mRNA（figS1）。并且在這58個mRNA中，包括了KLF4，SERP1，SERP2，RNF148等已知的與CRC相關的基因。
現(xiàn)在miRNA和mRNA都有了，并且也發(fā)現(xiàn)了58個極有可能與CRC相關的基因，接下來自然是對這些基因進行功能分析了。作者利用DAVID（PMID:19033363）進行GO和KEGG分析。結果發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路（hsa04310）是唯一一個被明顯富集的KEGG通路，這表明Wnt信號通路與CRC關系很密切。
分析到現(xiàn)在，基本確定了CRC相關的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡，為了進一步驗證分析結果，作者挑選了6個上調(diào)的miRNA和4個下調(diào)的mRNA。之所以挑這幾個，是因為他們都已經(jīng)被報道參與了Wnt信號通路。不僅可以驗證數(shù)據(jù)篩選的結果，還能驗證Wnt信號通路是否真的與CRC相關，這就是一箭雙雕啊朋友們。
作者對挑選的這些基因在CRC組織和正常組織中的表達情況進行了定量分析，作者總共選擇了40個匹配的CRC-normal組織。結果發(fā)現(xiàn)，其中有五個miRNA在CRC組織中出現(xiàn)了顯著的上調(diào)。4個mRNA均出現(xiàn)了明顯的下調(diào)（FIG3）。
同時，作者利用皮爾森相關系數(shù)計算miRNA-mRNA表達值之間的相關性，發(fā)現(xiàn)miR-224-SFRP2，miR-29a-KLF4與定量結果存在非常好的相關性（TABLE2）。
做到這里，基本差不多了。但是作者為了進一步確認miRNA-mRNA的關系，作者做了miR-29a的轉(zhuǎn)染細胞系，并在其中檢測KLF4的表達情況。最終結果也與前面分析結果一致（FIG4）。這一數(shù)據(jù)結果表明KLF4受到miR-29a的調(diào)控。
縱觀整篇文章，作者其實并沒有做很多實驗，大多都是通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)的結果，然后通過簡單的實驗對這些結果進行驗證，進而提出了CRC中的miRNA-mRNA潛在調(diào)控網(wǎng)絡。但是作者最終也僅僅針對1-2個pairs進行了驗證，更加復雜的CRC調(diào)控網(wǎng)絡還需要進一步的分析。
但是，拿到測序數(shù)據(jù)后真的僅僅能得到這些東西嗎？其實可以在NCBI上選擇更多的數(shù)據(jù)集，然后結合自己的測序結果，進行更加深入的分析，也可以發(fā)現(xiàn)更加多的調(diào)控網(wǎng)絡，并且分析結果會更加可靠。
此外，作者對miRNA-mRNA的配對最初是基于miRNA和mRNA的表達值之間的相關性，然后在用miRanda等進行靶向預測。但是實際上，通過miWALK可以發(fā)現(xiàn)更多的潛在靶標，miWALK是目前常用的miRNA靶標預測手段（PMID：21605702），它是基于miRAN與mRNAde 3’-UTR區(qū)域的結合情況進行預測，因此其分析結果也更加可靠，將這些潛在靶標與差異mRNA取交集，是不是可以發(fā)現(xiàn)更多的miRNA-mRNA呢？
而且在本文中作者既沒有畫出miRNA-mRNA的相互關聯(lián)圖，也沒有給出miRNA-mRNA結合度的具體數(shù)值，如果添加上關聯(lián)圖以及結合情況，是不是可以更加直觀的看到它們的調(diào)控關系？
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