2017年12月26日，我們在“熱心腸日報”頭條看到了Nature Microbiology當(dāng)時剛剛online的一篇重要觀點論述，這篇文章集合了全球29位腸道菌群研究大佬（包括中國的趙立平和王?。┕餐鹈槍Α澳c型”這一個在2011年被正式提出但后來備受爭議的概念，做了充分探究，并提出了新的腸型路線圖。
為讓更多人了解腸道菌群分類的原則和方法，今天我們特別編發(fā)來自中國科學(xué)院微生物研究所病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室助理研究員陳亮博士、中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所宏基因組學(xué)實驗室工程師劉永鑫博士對這篇文章的翻譯，希望對你有用。
原標(biāo)題：Enterotypes in the landscape of gut microbial community composition
認(rèn)識腸道菌群領(lǐng)域的29位大佬，從熟悉他們的名字和單位開始。
作者：Paul I. Costea 1, Falk Hildebrand 1,2,3, Arumugam Manimozhiyan 4, Fredrik B?ckhed 5,6, Martin J. Blaser 7, Frederic D. Bushman 8, Willem M. de Vos 9,10, S. Dusko Ehrlich 11,12, Claire M. Fraser 13, Masahira Hattori 14, Curtis Huttenhower 15, Ian B. Jeffery 16, Dan Knights 17,18, James D. Lewis 19, Ruth E. Ley 20, Howard Ochman 21, Paul W. O’Toole 16, Christopher Quince 22,
David A. Relman 23,24,25, Fergus Shanahan 16, Shinichi Sunagawa 1,26, 王俊 5,27,28,29,30,
George M. Weinstock 31, Gary D. Wu 32, Georg Zeller 1, 趙立平 33, Jeroen Raes 2,3,34*,
Rob Knight 35,36,37,38* and Peer Bork 1,39,40*
德國，海德堡，歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL)
比利時，VIB微生物中心
比利時，布魯塞爾大學(xué)，微生物實驗室
丹麥，哥本哈根大學(xué)，衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)科學(xué)系，諾和諾德基金會基礎(chǔ)代謝研究中心
瑞典，哥德堡大學(xué)，薩爾格學(xué)院，醫(yī)學(xué)研究所，分子與臨床醫(yī)學(xué)系，瓦倫堡實驗室
丹麥，哥本哈根大學(xué)，衛(wèi)生科學(xué)系，受體與腸內(nèi)分泌代謝部，諾和諾德基金會基礎(chǔ)代謝研究中心
美國，紐約大學(xué)，朗格尼醫(yī)學(xué)中心
美國，費城，賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院，微生物系
芬蘭，赫爾辛基大學(xué)，細(xì)菌與免疫系
荷蘭，瓦赫寧根大學(xué)，微生物實驗室
法國，朱昂薩斯，國家農(nóng)業(yè)研究院，MetaGenoPolis (MGP)計劃
英國，倫敦，Guy醫(yī)院，牙科中心辦公室，宿主與微生物組互作中心；倫敦國王學(xué)院
美國，巴爾的摩，馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，基因組研究所
日本，東京，早稲田大學(xué)，高等科學(xué)與工程研究生院
美國，波士頓，哈佛公共衛(wèi)生學(xué)院，生物統(tǒng)計系
愛爾蘭，科克郡，科克大學(xué)，APC微生物組研究所
美國，明尼蘇達(dá)，圣保羅，明尼蘇達(dá)大學(xué)，生物技術(shù)研究所
美國，明尼阿波里斯市，明尼蘇達(dá)大學(xué)，計算機(jī)科學(xué)與工程系
美國，費城，賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院，臨床流行病與生物統(tǒng)計中心
德國，圖賓根，MPI微生物組科學(xué)部
美國，德州，奧斯丁，德州大學(xué)綜合生物學(xué)系
英國，考文垂，華威大學(xué)，華威醫(yī)學(xué)院
美國，加州，斯坦福大學(xué)，微生物與免疫系
美國，加州，斯坦福大學(xué)，醫(yī)學(xué)部
美國，加州，退伍軍人事務(wù)部帕羅奧圖保健中心
瑞士，蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院，微生物所，生物部
丹麥，哥本哈根大學(xué)，生物系
沙特，吉達(dá)，阿卜杜勒阿齊茲國王大學(xué)，遺傳異常研究中心
中國，澳門，凼仔島，澳門科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院
香港，薄扶林，港大，醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室
美國，法明頓，杰克遜基因組醫(yī)學(xué)實驗室
美國，費城，賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院，腸胃病學(xué)系
中國，上海交通大學(xué)，上海系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)中心，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室
比利時，魯汶大學(xué)，微生物與免疫系
美國，博爾德，科羅拉多大學(xué)，計算機(jī)科學(xué)系
美國，博爾德，科羅拉多大學(xué)，生物前沿研究所
美國，博爾德，科羅拉多大學(xué)，化學(xué)與生化系
美國，博爾德，科羅拉多大學(xué)，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所
德國，柏林，Max DelbrüCK分子醫(yī)學(xué)中心
德國，海德堡，分子醫(yī)學(xué)伙伴單位
來自EMBL的Paul I. Costea和Falk Hildebrand為共同第一作者。比利VIB的Jeroen Raes、科羅拉多大學(xué)的Rob Knight和EMBL的Peer Bork為共同通訊作者。
群體分型(分層/層化，stratification)是一種有助于更好的理解人類身心健康等復(fù)雜生物學(xué)問題的有效方法。將這種方法應(yīng)用于腸道微生物中，可以將不同的群落組成定義為腸型，對科學(xué)研究產(chǎn)生了積極的影響，但也引發(fā)了巨大的爭議。
我們基于原始工作發(fā)表以來積累的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析，重新審視腸型這一概念，討論區(qū)分微生物組結(jié)構(gòu)的不同方法，并將這些概念應(yīng)用于功能、生態(tài)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)。
由于腸型在描述腸道微生物群落結(jié)構(gòu)時非常有效，且可能用于指導(dǎo)臨床實踐，因此我們呼吁合理的使用這一概念并希望協(xié)調(diào)出現(xiàn)的不同觀點。
人體內(nèi)定殖著數(shù)萬億的有益于身心健康的微生物，通常不同的微生物群落定殖在不同的人體部位 (圖1)。研究表明不同人同一部位的微生物群落組成差異很大，同一個人的不同部位的微生物群落組成也顯著不同 (圖1)。
圖1. 健康人身體不同位置微生物組在屬水平明顯分開
a-c, 基用2381個16S測序的HMP樣品，我們展示了身體不同部分菌群的差異程度。a, 基于OTU水平的非權(quán)重UniFrac距離；b, 屬水平的Jensen-Shannon距離；c, OTU水平的Jensen-Shannon距離。每張圖都僅展示第一和二主坐標(biāo)軸，并結(jié)合左上角柱狀圖展示組內(nèi)樣品距離。
人體內(nèi)最復(fù)雜的定殖環(huán)境當(dāng)屬腸道，據(jù)估計大約有150克的微生物定殖于此，包括各種各樣的細(xì)菌和古菌，其中以厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主要類群。個體間微生物群落的差異已經(jīng)被廣泛證明，例如美國的人類微生物組計劃(HMP)，歐洲的腸道宏基因組計劃(MetaHIT)和眾多其他的腸道菌群研究，都證明此現(xiàn)象的存在。此外，研究還表明腸道微生物群落變化表現(xiàn)出不同的演替階段，可分為：嬰幼兒快速變化期，成人穩(wěn)定期和老年退化期。
目前，在大人群和跨地理研究中，還很難簡單的描述如此復(fù)雜的生物現(xiàn)象，部分原因是有些類群在不同個體間表現(xiàn)為單峰(正態(tài)分布)，而另外一些類群又表現(xiàn)出雙峰或者更復(fù)雜的分布模式(圖2a)。
考慮到腸道系統(tǒng)的重要性和復(fù)雜性，確定微生物群落組成的結(jié)構(gòu)模式及其背后的組裝機(jī)制是非常必要的，這些能夠幫助我們更好的了解人體的健康和疾病狀態(tài)。基于群落組成結(jié)構(gòu)的分類方法將加強(qiáng)基于微生物的疾病診斷、治療或預(yù)防，并在營養(yǎng)、微生物和藥物干預(yù)方面對個性化治療產(chǎn)生影響。這種基于微生物組成的模式可以被用來對人群進(jìn)行分類，類似于癌癥研究中常用的分子亞型分類，例如，在臨床上，基于基因表達(dá)的模式與乳腺癌子類是相關(guān)的。然而，我們也應(yīng)注意到，在其他情況下，如結(jié)直腸癌，這種分類方式的有效性仍不清楚，值得注意的是分子水平的分型并不是在所有情況下都適用。
圖2. 人類腸道微生物群落組成的分型。
a, 人類腸道中普遍微生物屬的豐度分布非常復(fù)雜。基于278個MetaHIT樣品中腸型主要指示物種多度數(shù)據(jù)分析得到的beta多樣性的理論分布模式（左）和實際分布模式（中）和腸型空間分布（右）。在3個大數(shù)據(jù)集中，當(dāng)擬桿菌（Bacteroides）豐度分布接近于對數(shù)正態(tài)分布時，普氏菌屬（Prevotella）則表現(xiàn)為雙峰分布，暗示兩種分布的混合型可以更好的解釋觀察值，這種現(xiàn)象可能來自于兩種完全不同的生態(tài)過程，一個對應(yīng)群落內(nèi)優(yōu)勢物種的狀態(tài)，另一個對應(yīng)相對稀有物種的狀態(tài)。
b, 有關(guān)腸型研究的地理分布（附表1）；報道的腸型數(shù)量在圖中用顏色標(biāo)示，點代表研究中樣品來自于哪個國家。連線代表樣品屬于同一個研究項目。大部分研究來自西方國家，可能對結(jié)果造成偏差，從而忽略其他人群中的腸道菌群的變異。
c, 基于多元正態(tài)分布模擬微生物組成的示意圖，存在三個高密度主峰，每一種代表一種腸型，峰圖可以更清晰的展示腸型的概念。此圖可以通過修改不同的參數(shù)來對圖中空間分割，從而在覆蓋不同人群樣品范圍內(nèi)（由交叉平面表示）產(chǎn)生不同的集群數(shù)量（2個或者3個），
d, 同一群體基于不同分類方法定義的腸型。最上面的圖層將空間分割為3個離散的空間。
穩(wěn)定的微生物群落變異模式已經(jīng)在成人腸道研究中被證明，例如：主要類群如擬桿菌(Bacteroides)和普氏菌屬(Prevotella)的比例在成人腸道內(nèi)是穩(wěn)定的(圖2a和附圖1)。當(dāng)微生物群落組成的變異被劃分成集群/組(cluster)后，它們可以被稱作為腸型(enterotypes)，并且可以作為一種非常有效的區(qū)分人體腸道微生物的方法。后來，此研究方法被應(yīng)用于其他生態(tài)系統(tǒng)如陰道和身體其他部位的微生物群落的分類。然而，由于腸道微生物聚類方法的差異，自腸型的概念提出以來，關(guān)于腸型的數(shù)量和存在其他不同類型的討論從未間斷。
在本文中，我們采用來自三個大陸的宏基因組大數(shù)據(jù)（包括美國的人類微生物組計劃(HMP)，歐洲的腸道宏基因組計劃(MetaHIT)和中國二型糖尿病研究數(shù)據(jù)）來評估腸道微生物群落組成的變化并驗證不同的假說。我們通過精細(xì)的元分析，提出了一種改進(jìn)的腸型概念，目的是協(xié)調(diào)出現(xiàn)的不同觀點。研究結(jié)果展示了聚類和其他分層分析方法的優(yōu)點和缺點。我們發(fā)現(xiàn)腸道微生物群落是結(jié)構(gòu)化的，雖然在統(tǒng)計學(xué)上沒有強(qiáng)有力的支持，但聚類的方法還是可以為微生物組數(shù)據(jù)提供有效的解釋。另外，由于群落水平的分層分析只解釋了微生物群落變化的某些方面，因此，這種分析方法并不能替代其他分析方法對群落變異的解釋。
腸道微生物群落組成模式的穩(wěn)定性
通過研究上面提到的3個大數(shù)據(jù)集，我們發(fā)現(xiàn)在腸道菌群中，屬水平的群落組成可以將樣品很好的分組(附圖2)，這一結(jié)果與腸型研究的原始文獻(xiàn)的結(jié)果一致。也就是說，某些相對豐富的微生物出現(xiàn)頻率要高于其他物種。這些現(xiàn)象都可以通過計算樣本之間的距離、研究產(chǎn)生的分組，以及通過直接觀察一些腸道微生物類群豐度的復(fù)雜分布來驗證(圖2)。這種微生物群落結(jié)構(gòu)對特定微生物的偏好是適度的，導(dǎo)致在偏好某種微生物的集群周圍形成更高的樣品密度，但是我們也可以發(fā)現(xiàn)有許多樣品處于不同的分組之間。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)導(dǎo)致我們很難用精確的數(shù)學(xué)的方法來描述這些偏好某種微生物的微生物群落，也很難確定這類高度密集群的數(shù)量，這就促使人們采用另一種方式來描述這部分區(qū)域，即梯度結(jié)構(gòu)(gradients，連續(xù)不可分型)。然而，我們要清楚在群落變化研究中什么是最重要的？描述這些局部最優(yōu)的群落組成，是為了更好的理解生態(tài)限制和群落特性對群落結(jié)構(gòu)的影響機(jī)制。
2011年，采用三種測序技術(shù)(Illumina、454和Sanger)，對來自三個國家(丹麥、西班牙和美國)的人類糞便樣本中的16S rRNA基因進(jìn)行測序分析，得出腸道微生物存在三種腸型的結(jié)果。腸型被描述為“在群落組成的多維尺空間中樣品密集的集群”，并且其不會受年齡、性別、文化背景和地理位置的影響。對每一種腸型的特性研究，發(fā)現(xiàn)共存的微生物網(wǎng)絡(luò)中心存在一種指示/驅(qū)動類群，即這一類微生物與給定的腸型最相關(guān)。例如：腸型1，又可以表示為ET B，Bacteroides(擬桿菌)是其最好的指示類群；腸型2，又可以表示為ET P，是由Prevotella(普氏菌)驅(qū)動的，它的豐度通常與擬桿菌的豐度成反比；腸型3，又可以表示為ET F，是通過Firmicutes(厚壁菌)占比高低來區(qū)分的，其中最主要的類群為Ruminococcus(瘤胃球菌)。 以上所有分析都是基于屬水平分類進(jìn)行的，因為屬水平可以更好的反映生態(tài)位變化。盡管有一些屬表現(xiàn)出功能異質(zhì)性，如鏈球菌(streptococci)，它既包含常見的共生菌和致死性病原體，又包含可以用于食物發(fā)酵的類群，但通常屬水平的分析還是比較可靠的。這種方法雖然可以促進(jìn)個體間功能差異在臨床中的應(yīng)用，但是我們也不應(yīng)該忽略群落在物種水平和菌株水平的變異。
大部分的研究都證實了三種腸型的存在，最初的定義也已經(jīng)明確了腸型是非離散的，聚類只是一種為了對樣本分組以降低復(fù)雜性來定義腸型的方法 (見圖3a集群和屬豐度的比較)。盡管這一人為的定義存在局限性，由此產(chǎn)生的群落聚類只能部分地反映群落間距離的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，但腸型的概念已經(jīng)證明對分析微生物組數(shù)據(jù)非常有幫助。
圖3. 人類糞便樣品微生物組存在結(jié)構(gòu)亞型。
采用Jensen–Shannon距離排序278個MetaHIT樣品。
a, 主要差異屬的對數(shù)轉(zhuǎn)換的相對豐度。在相鄰的浮點軸上，展示了不同類型間投影豐度變化。圖中的雙峰豐度譜(虛線)和漸變豐度(實線)分別支持了梯度漸變(連續(xù)不可分)模型和非連續(xù)分組模型。
b, 三種腸型的COG排序投影也表明腸型間功能存在差異。
c, 宏基因組水平OTU的Shannon多樣性指數(shù)和基因豐度（少于480000個基因定義為為低基因數(shù)，其它為高基因數(shù)）在不同腸型間顯著不同，大多數(shù)為梯度漸變類型。
d, 飲食和疾病與普氏菌屬（Prevotella）、厚壁菌門（Firmicutes）或擬桿菌門（Bacteroides）豐富的腸道菌群的關(guān)系（附表5）。為方便區(qū)分，在a, b, d中3種腸型均采用顏色區(qū)分。
隨后對新數(shù)據(jù)集的研究也在不同程度上證明了腸型的存在，包括對腸型數(shù)量的驗證和提供的統(tǒng)計學(xué)證據(jù)，當(dāng)然也存在一些沒有發(fā)現(xiàn)此類結(jié)構(gòu)的研究(圖2和附表1)。例如，一項關(guān)于美國人飲食的大數(shù)據(jù)分析結(jié)果支持2種腸型的結(jié)論，一種類型包含與ET P類似的優(yōu)勢類群，另一種為ET B和ET F類型的混合型。 HMP的16S數(shù)據(jù)，四個宏基因組數(shù)據(jù)和一個佛蘭德人群數(shù)據(jù)的研究結(jié)果與腸型原始文獻(xiàn)的結(jié)果類似，證明存在三種腸型。一項關(guān)于委內(nèi)瑞拉、馬拉維農(nóng)村地區(qū)和美國大都會地區(qū)的人群研究則強(qiáng)調(diào)了普氏菌(Prevotella)和擬桿菌(Bacteroides)為驅(qū)動類群，另外還發(fā)現(xiàn)嬰兒具有與成人完全不同的腸道菌群，主要含有雙歧桿菌(Bifidobacteria)和變形菌(Proteobacteria)。研究發(fā)現(xiàn)，人類在3歲至9歲之間腸道菌群的腸型結(jié)構(gòu)逐漸建立(發(fā)現(xiàn)類腸型結(jié)構(gòu))，表明基于有限樣本時推斷全世界不同年齡段人群腸道菌群的結(jié)構(gòu)需要十分小心。
除聚類方法以外，Holmes等提出了另外一種區(qū)分菌群結(jié)構(gòu)的方法。這種方法關(guān)注屬水平的真實豐度而不是樣品間距離，為每一個可能的結(jié)構(gòu)生成一個模型，并確定每個模型如何解釋觀察到的數(shù)據(jù)。采用這種多項式混合模型(Dirichlet multinomial mixture models，DMMs)對腸型原始文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，證明很可能存在四種腸型(此處也籠統(tǒng)的稱其為“集群”)。其中的兩個集群類似于ET B和ET P，而第三個集群中瘤胃球菌(Ruminococcus)和厚壁菌(Firmicutes)內(nèi)相關(guān)屬為優(yōu)勢類群，但是這些類群在腸道菌群中通常含量很低。最后一個集群中則含有大量未鑒定的類群。DMMs還被用于分析瑞典健康人群的腸道菌群數(shù)據(jù)，結(jié)果確定了三個集群，同樣有兩個集群的群落組成類似于ET B和ET P，在另外一個集群中優(yōu)勢類群為一個未鑒定類群。另一項研究采用此方法對HMP中的16S rRNA基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腸道微生物組有四個相似的模型。應(yīng)用DMMs 分析MetaHIT宏基因組數(shù)據(jù)集時，可以確定四個集群，其中兩個集群與ET B和ET P重合，而另兩個集群為一個更復(fù)雜的混合群(圖2，附圖3)。然而DMMs屬于更嚴(yán)格的統(tǒng)計方法，未來還需要進(jìn)一步確認(rèn)生成模型的分布假設(shè)是否適合微生物組數(shù)據(jù)。
盡管對腸型分類起主要貢獻(xiàn)的三種腸道微生物——普氏菌(Prevotella)、擬桿菌(Bacteroides)和瘤胃球菌(Ruminococcaceae)是腸道菌群核心物種，但是有研究已經(jīng)證明其相對豐度在個體間存在最大的變異。另外，基于總體數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)方法也確定這三種腸道微生物為三個共存網(wǎng)絡(luò)集群的核心物種，并證明它們的豐度是相互負(fù)相關(guān)的。同樣，一項關(guān)于腸道菌群內(nèi)35個主要類群的的qPCR數(shù)據(jù)也展示了這樣的負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外，在阿米什成人腸道菌群中也存在3個不同的網(wǎng)絡(luò)，這些網(wǎng)絡(luò)中的優(yōu)勢屬與原始研究中腸型的驅(qū)動類群高度重合。類似地，在一個由愛爾蘭成年人和老年人組成的數(shù)據(jù)集里，報道了6個共豐度類群(co-abundance groups, CAGs)，且證明健康人群都具有和原始腸型相對應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，有別于聚類和建模方法，細(xì)菌共存網(wǎng)絡(luò)是另一種解釋這些聚集群落主要特征的方法。理論研究已經(jīng)證明在具有不同相互作用強(qiáng)度的群落中容易產(chǎn)生類似于腸型的結(jié)構(gòu)。
盡管動物的腸道菌群與人類不同，但是最近在幾項動物實驗中也報告了類似于腸型的結(jié)構(gòu)。在控制實驗中，小鼠的腸道微生物群落中，聚類方法可以將其分成明顯的集群，然而在野生動物(老鼠、靈長類和野豬)中，這種集群趨勢則比較微弱。這表明，當(dāng)沒有外部因素影響微生物群落時，更容易出現(xiàn)聚集的群落狀態(tài)。因此，腸型并不是人體腸道菌群特有的，動物中同樣存在這些現(xiàn)象，這一結(jié)果使人們認(rèn)為，腸型在泛人類分裂之前就已經(jīng)存在了。腸道菌群在進(jìn)化過程中主要受競爭影響，并且受到來自宿主的壓力限制，因此，腸型可以代表這一共生群落的最適狀態(tài)，以達(dá)到群體效應(yīng)的局部最優(yōu)，并兼容宿主所施加的壓力限制。
定義微生物群落類型的挑戰(zhàn)
鑒于從生態(tài)學(xué)到哲學(xué)的各個學(xué)科都在討論微生物群落可能存在的狀態(tài)，評估集群在腸道菌群研究中的作用是不容忽視的?？紤]到腸型聚類的本質(zhì)特性，以及對分類級別、距離指標(biāo)、聚類算法和集群優(yōu)化得分等方面的多種選擇，在研究中產(chǎn)生不同數(shù)量的集群是不可以避免的(附圖4和補(bǔ)充信息)，即使在相同的數(shù)據(jù)集上出現(xiàn)不同的集群數(shù)量也不足為奇。盡管一些人認(rèn)為，有些數(shù)據(jù)集(引文8, 16, 23, 29, 42, 43)并不支持腸型的存在，但是當(dāng)采用相同的方法將屬于人體不同部位的樣本(皮膚、糞便、陰道和口腔)區(qū)分開時，即使這一區(qū)分方法也沒有多少統(tǒng)計支持(附圖4)，這種區(qū)分方法卻被科學(xué)界廣泛接受。
不管聚類支持率還是建模假設(shè)(詳見補(bǔ)充信息)，基于三大公共數(shù)據(jù)集的分析都可以得到來自文獻(xiàn)報道的結(jié)論(附表1)，證明腸道菌群具有相似的的局部子結(jié)構(gòu)，也就是3個集群的群落結(jié)構(gòu)中總是存在擬桿菌屬（Bacteroides）、普氏菌屬（Prevotella）和厚壁菌門（Firmicutes）主導(dǎo)的集群，兩個集群的群落結(jié)構(gòu)中可以根據(jù)普氏菌屬（Prevotella）的優(yōu)勢度來區(qū)分樣品。因此，腸道菌群的劃分在一定意義上是穩(wěn)定的，因為相關(guān)的聚類可以重復(fù)，并可以協(xié)調(diào)許多研究和支持群落組成的存在。
在復(fù)雜的微生物組成背景下，不同環(huán)境中腸道群落顯然會表現(xiàn)出一定的生物學(xué)差異。盡管合理的定義腸型和確定其臨界點還有很大挑戰(zhàn)，但是腸型的概念可以幫助我們更好的理解這些差異。這與大型生物研究中的集群概念是相似的，盡管到目前為止，區(qū)分不同類型的環(huán)境，也面臨著相似的問題。例如，撒哈拉以南非洲地區(qū)的稀樹、草原和森林生態(tài)系統(tǒng)可以作為對平均降雨量梯度變化或者穩(wěn)定狀態(tài)的對照。
考慮到準(zhǔn)確定義腸道群落結(jié)構(gòu)的挑戰(zhàn)，如克服間歇效應(yīng)，考慮干擾因子(附圖5)和解釋時間變異，腸型穩(wěn)定狀態(tài)的確切數(shù)字是很難確定的。盡管如此，在許多研究(主要為西方)中，無論應(yīng)用什么方法，擬桿菌屬（Bacteroides）和普氏菌屬（Prevotella）都是個體間最主要的差異類群，并能夠解釋最主要的變異。不同腸型間的微生物組成和多樣性上都有很大的不同，在隨后的討論中，有關(guān)它們的功能、生態(tài)和疾病等方面的情況都將涉及。盡管三種腸型可能不是對數(shù)據(jù)的最佳解釋，但它是最常用的模型，并且為我們研究腸道菌群提供可直接使用的框架。
腸型在功能與生態(tài)中應(yīng)用
腸型間的物種組成不同表明其在功能和生態(tài)學(xué)意義上也不同。基于三大數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果也表明微生物群落組成的差異導(dǎo)致了顯著的功能變異(圖3b)。事實上，考慮基因類型時，大多數(shù)KEGG(京都基因與基因組百科全書)直系同源(KO)和非監(jiān)督同源組(non-supervised orthologous
groups，NOGs)在三種腸型間存在64%和77%的差異(假陽性率FDR <> 例如，報導(dǎo)過ET P腸型或者普氏菌屬（Prevotella；無腸型的報導(dǎo))的研究，通常來自非西方或者飲食富含纖維的人群樣本。這一關(guān)聯(lián)讓我們更容易理解菌群功能的差異，普氏菌屬（Prevotella）水解酶專門分解植物纖維，另外，有研究發(fā)現(xiàn)ET P群落可以導(dǎo)致脂肪和蛋白的分解發(fā)酵能力下降。相反的，ET B群落結(jié)構(gòu)與富含動物蛋白和飽和脂肪酸飲食相關(guān)，并且具有擬桿菌(Bacteroides)特異的碳水化合物酶(CAZymes)(附表2)。此外，我們發(fā)現(xiàn)在ET B群落中碳水化合物代謝酶顯著富集(附表3)，與最近關(guān)于糖和蛋白水解的潛能增加的研究一致。一些腸型間的功能差異可歸因為某個指示屬，另一些只是結(jié)構(gòu)變化被動導(dǎo)致的(總量不變，相對增長就會有相對減少)。
腸型間的功能差異支持了不同群體特征的概念，如豐富度、多樣性和時間穩(wěn)定性。從生態(tài)學(xué)的角度來看，這些特征都是相關(guān)的，理論預(yù)測了諸如腸道之類的動態(tài)系統(tǒng)的高多樣性，其營養(yǎng)供應(yīng)和類型隨著時間的變化而波動。最早在阿米什人中采用16S擴(kuò)增子測序報導(dǎo)了三種腸型的物種豐度不同，ET B有最低的物種豐度，此結(jié)果在最近一個更大的群體研究中被驗證。我們使用三個大的數(shù)據(jù)集分析，發(fā)現(xiàn)ET B種物種豐度最低，而ET F中物種豐度最高(附圖7，8)。采用香農(nóng)指數(shù)同樣發(fā)現(xiàn)ET F中物種豐度最高，而ET B和ET P中物種多樣性均下降(附圖8)。此外，這種差異與糞便稠度和/或樣品轉(zhuǎn)運時間的差異密切相關(guān)，其中轉(zhuǎn)運較慢的ETs也顯示了蛋白水解對糖精蛋白和蛋白水解代謝產(chǎn)物的相對比升高。
在許多研究中，健康成人的腸道群落組成在很長一段時間內(nèi)不會發(fā)生顯著變化，表明成人體內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)與腸型狀態(tài)普遍比較穩(wěn)定。然而，也有例外，我們在分析HMP宏基因組時間序列數(shù)據(jù)中，其中也包括超過6個月個人樣品，其中三種腸型穩(wěn)定存在，但也有16%的樣品腸型存在變化。這也表明：對于一些個體，腸型是可變的，且不存在明顯的邊界(附圖9)。
這一結(jié)果可以用腸道菌群的可變動態(tài)模型來解析：
(1) 偏好性群落組成的存在(即腸型，附圖10A);
(2) 個體特異性吸引子(attractors)的存在主要是由于個體的腸道群落的時間自相關(guān)(附圖10B)。
證明這些模型需要有關(guān)微生物群落對不同干擾下反應(yīng)的信息，從而使我們能夠確定個體是否有能力保持/恢復(fù)到原來的組成狀態(tài)或腸型。不幸的是，目前我們只有非常有限的腸道菌群干擾數(shù)據(jù)，如抗生素、糞便移植和飲食干預(yù)，并且許多數(shù)據(jù)都被排除在腸型定義的框架之外，所以很難得出哪個穩(wěn)定狀態(tài)的模型是正確的結(jié)論。
短期的抗生素治療對人類腸道菌群的影響太劇烈，可以導(dǎo)致整個群落的瓦解，不適合研究腸道菌群的恢復(fù)能力。事實上抗生素治療可產(chǎn)生嚴(yán)重的菌群破壞，導(dǎo)致病原的入侵(如艱難梭菌)，并導(dǎo)致無法恢復(fù)至最初的菌群狀態(tài)。
飲食干預(yù)對人類腸道菌群生態(tài)系統(tǒng)的影響更溫和，因此適合用于研究腸道菌群的可塑性。研究發(fā)現(xiàn)，飲食干預(yù)可以在4天內(nèi)導(dǎo)致腸型的改變，但是10天后趨于穩(wěn)定，表明腸道菌群存在一種恢復(fù)至原始狀態(tài)的能力。采用普氏菌與擬桿菌相對比例定義腸型的分類方法，這種穩(wěn)定性在6個月的干預(yù)實驗中同樣被觀測到。這一結(jié)果表明，個人的微生物組因短期飲食干預(yù)受多大影響還有待進(jìn)一步研究，但支持腸型恢復(fù)能力的假說。與之相比，長期的干預(yù)可能產(chǎn)生更深選的影響，長達(dá)一年的飲食干預(yù)導(dǎo)致擬桿菌門（Bacteroidetes）/厚壁菌門（Firmicutes）比例發(fā)生變化，從而導(dǎo)致腸型的改變。隨著時間的推移，腸型通常變得比較穩(wěn)定。對于長期干預(yù)缺少后續(xù)的研究，更沒有對其恢復(fù)力的近似研究(無論是從整體的群落相似性還是腸型的分類)。然而，有研究也暗示不同腸型可能恢復(fù)能力也不同，例如，據(jù)估計ET F中總體細(xì)菌的生長率最低，可能導(dǎo)致平衡狀態(tài)恢復(fù)的延遲。
雖然目前還不能預(yù)測特定的擾動將如何改變微生物組，但不同的微生物組結(jié)構(gòu)，包括那些被定義的腸型結(jié)構(gòu)，可能會在未來作為分類治療和指導(dǎo)飲食的建議。腸道菌群的調(diào)節(jié)對疾病尤其重要，目前的挑戰(zhàn)在于如何將一個人改變了的微生物組轉(zhuǎn)變回發(fā)病之前的健康狀態(tài)(菌群恢復(fù)或菌群人工調(diào)控)。
腸型在臨床應(yīng)用
按照腸型對腸道菌群結(jié)構(gòu)分類具有潛在的臨床意義。首先，在診斷上有助于判別個體的疾病狀態(tài)。其次，可作人體特定狀態(tài)的風(fēng)險或易感指標(biāo)。再次，層化可作為預(yù)后恢復(fù)的生物標(biāo)記物。第四，不同腸型可影響異質(zhì)性物質(zhì)代謝，從而產(chǎn)生不同的藥物代謝動力學(xué)、藥物代謝動態(tài)差異。因此，腸道分型可作為指導(dǎo)治療的選項，有助于理解不同的治療措施。
目前，已經(jīng)有一些腸型(或者主要的驅(qū)動物種)與人類疾病表型相關(guān)的報導(dǎo)。例如，增加擬桿菌或ET B腸型本身通常具有低的微生物多樣性(附圖7/8)，這與非酒精性脂肪肝炎(NASH)、結(jié)腸癌、乳糜癥、免疫衰老和長期低度感染相關(guān)。在MetaHIT數(shù)據(jù)中，ET B與ET F相比(FDR < 0.1)，淋巴細(xì)胞數(shù)量和c反應(yīng)蛋白顯著增長，同時et="" f樣品有低于平均水平的胰島素抗性水平(附圖4)。普氏菌屬（prevotella）豐度的增長與長期抗生素使用、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、二型糖尿病和hiv相關(guān)(hiv在男同中高風(fēng)險，可能混淆報導(dǎo)的關(guān)聯(lián))。最后，et="" f具有高的微生物多樣性，且能夠降低宿主感染程度，且報導(dǎo)與動脈硬化風(fēng)險相關(guān)。鑒于不同疾病表型的大量關(guān)聯(lián)，腸型并不能單獨作為疾病診斷指標(biāo)，但可以指示某些方面的風(fēng)險。目前，在特定狀態(tài)下，健康個體疾病風(fēng)險與腸型的關(guān)系研究的還很少，而且尚不清楚腸道菌群分類是否對疾病發(fā)展的預(yù)后有幫助。例如，在具有克羅恩病雜合等位基因易患克羅恩病的個體中，容易出現(xiàn)et="" p腸型；而在metahit研究中，克羅恩病風(fēng)險人群中中以et="">
最后，某些疾病可能會有不同的病因，這可能與腸型相關(guān)。分層可以幫助我們發(fā)現(xiàn)這些潛在的信號，從而消除個體間微生物群落巨大變異的部分，而這些個體間的差異可能與疾病本身無關(guān)。在小鼠研究的例子中，分層可以發(fā)現(xiàn)基因型與微生物組、籠子與微生物組的關(guān)聯(lián)。同樣地，將人類患者分層為八個微生物集群，有助于識別與微生物組成相關(guān)的醫(yī)學(xué)參數(shù)，顯著提高艱難梭菌(C. difficile)相關(guān)腹瀉分類的準(zhǔn)確性。雖然目前沒有長期觀測的數(shù)據(jù)，但對飲食和藥物的反應(yīng)以及腸道生理和生活方式的影響，也可能因人體不同位置而有所不同。因此，分層代表了不同臨床相關(guān)領(lǐng)域的切入點。它可以在很大程度上獨立于梯度-或以集群為中心的觀點，類似于身體質(zhì)量指數(shù)，定義的閾值是對患者疾病風(fēng)險的重要指南。
更合理腸型分類的準(zhǔn)則
為了使腸型概念更有意義，標(biāo)準(zhǔn)化是必不可少的。除了上文提到的技術(shù)困難外，單個樣品的分類也受到同批次其它樣品的影響。這種方式定義的腸型在不同研究中很難比較。例如，在一次單獨的研究中，大部分的樣品為ET B和ET F，只有極少的ET P，最優(yōu)的聚類可能只有兩個或一個組。盡管如此，這些少量的ET P還是可以基于其它的數(shù)據(jù)庫來鑒定。比較不同的研究數(shù)據(jù)是比較困難的，因為不同的DNA提取方法、樣本處理方法、測序技術(shù)、引物選擇、數(shù)據(jù)處理過程(如rRNA聚類OTUs、拷貝數(shù)校正、嵌合體檢測)等導(dǎo)致細(xì)菌豐度檢測產(chǎn)生偏差(bias)，從而影響腸型的分類。在標(biāo)準(zhǔn)化這些步驟時，需要非常嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，也許需要與人工重組微生物群落 結(jié)合在一起，并擴(kuò)展到腸道中發(fā)現(xiàn)了的大量微生物系統(tǒng)基因譜，從而使標(biāo)準(zhǔn)樣品和臨床樣本之間具有可比性。此外，還需要更多的縱向研究，包括跨越多個大陸的更大的人群研究，以確定額外的混雜因素。事實上，幾個聯(lián)盟己在這方面做出努力，如國際人類微生物組標(biāo)準(zhǔn)(IHMS)，微生物組質(zhì)控計劃(MBQC，之前推送的兩篇Nature Biotechnolog報導(dǎo)的DNA提取，以及實驗與分析比較均是他們的工作)己經(jīng)在嘗試建立宏基因組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并確定變異的來源。
我們提出了一個可操作的腸型分類方案，它可以避開上面列出的許多問題，并可以提供更多可比較的結(jié)果(圖4)。我們并不希望限制你對數(shù)據(jù)意義的解析，但至少可以將其他方法的分析結(jié)果與按此流程分析的結(jié)果進(jìn)行比較。基于MetaHIT數(shù)據(jù)集，我們建立了一個基于屬水平的在線分類器(基于HMP1和中國二型糖尿病 http://enterotypes.org/)。如果重新聚類的結(jié)果與分類器的結(jié)果不同，我們建議謹(jǐn)慎地將分層結(jié)果與該元分析中描述的腸型結(jié)果進(jìn)行比較。
此外，這種方法還定義了腸型空間，通過確定哪些樣本與參考數(shù)據(jù)集相似，可以用來定義“正?！蹦c道菌群的界限，并識別出它們之外的樣本，可以作為一個健康指標(biāo)。以前也報導(dǎo)過非正常的疾病狀態(tài)，通過使用一種包含六個物種的群落模型，在相對健康的病人中，網(wǎng)絡(luò)分析顯示出類似三種腸型的結(jié)構(gòu)為主要類型，而在脆弱的、年老的病人中，有兩個新的類型位主要類型。另一個病例報告了一種新的腸桿H，以腸桿菌科（Enterobacteriaceae）為主要類群。腸型分類器只基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)，如果與已知數(shù)據(jù)不相似會排除在腸型分類之外。個體的菌群異常，通常由肥胖、NASH，高血乙醇和ROS水平引起，表明非正常的組成與消化異常有關(guān)。
圖4. 基于菌群結(jié)構(gòu)鑒定腸型的技術(shù)路線
根據(jù)微生物豐度數(shù)據(jù)確定腸型的推薦流程圖。
獲取腸型分類的兩種主要途徑分別為：重鑒定（de novo identification；左側(cè)路線圖，可發(fā)現(xiàn)新腸型）和基于已知參考數(shù)據(jù)集的腸型分類（右側(cè)路線圖）。
依據(jù)現(xiàn)有模型推斷群落數(shù)據(jù)的可能結(jié)構(gòu)：
(1) 先基于聚類強(qiáng)度參數(shù)（clustering
strength measures，附圖4）或使用DMM模型框架對數(shù)據(jù)進(jìn)行評估，確定是否有集群結(jié)構(gòu)存在。其他模型也可能有助于獲取菌群數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但目前這類方法的具體應(yīng)用還沒有實現(xiàn)。
(2) 將樣品與HMP1和MetaHIT6數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性比較以確定是否為已知腸型，在http://enterotypes.org網(wǎng)站可實現(xiàn)腸型的分類和檢查。
(3) 不同的組成和結(jié)構(gòu)會有許多不同的原因，例如樣品來源不同，可能來自于非西方人或嬰兒樣本，技術(shù)性問題不同，如DNA提取、引物和分析預(yù)處理偏差等。
(4) 分類器結(jié)果的一致性，可用silhouette指數(shù)來確定。
無論是用于疾病狀態(tài)識別、前瞻性分型還是解決目前存在的技術(shù)問題，標(biāo)準(zhǔn)化的腸型分類才能確保大范圍研究的可比性，并有助于我們理解腸型的作用和重要性。
結(jié)論
與人類腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)的主要模式的鑒定仍然充滿挑戰(zhàn)性。目前可用的研究方法，每種都有各自的優(yōu)點和適用范圍，鑒定出的腸型的數(shù)量和統(tǒng)計支持也可能會有所不同。隨著標(biāo)準(zhǔn)化流程的發(fā)展，對樣品處理和數(shù)據(jù)分析的控制，可以預(yù)期未來不同研究間結(jié)果的一致性會增加。通過添加更廣泛的樣本和背景信息，可以進(jìn)一步細(xì)化腸型的屬性，擴(kuò)展到工業(yè)化世界之外以更好地代表全球人口的特征。但是現(xiàn)在，我們在這里提出了一種限制腸型空間的方法，以期對己知腸型之外的樣本也可進(jìn)行檢測。
除了上文提到的許多困難，盡管有不同的統(tǒng)計支持，但多項研均究報導(dǎo)了具有相似菌群組成特征的腸型。盡管腸型并非明顯的離散，且受到許多因素影響，但是它們在在分類、功能和生態(tài)特性上都有差異，并且可以在大型數(shù)據(jù)集上精確地重現(xiàn)。它們代表了一種獲取人類腸道中首選的微生物組成的方法，因此也可以應(yīng)用于許多其他生態(tài)系統(tǒng)中。
僅僅依靠腸型分類可能會掩蓋潛在的重要的微生物變異，因此不能取代直接的臨床關(guān)聯(lián)分析和專業(yè)的統(tǒng)計分析在微生物物種和功能差異研究中的應(yīng)用。然而，腸型仍與多種臨床情況有關(guān)，如從直接的疾病關(guān)聯(lián)到前瞻性分型研究，甚至是個性化的飲食干預(yù)或其他腸道菌群調(diào)節(jié)治療。盡管我們目前了解的知識非常有限，但我們相信腸型可以成為研究人類腸道菌群的有用工具。
腸型在線分類器主頁: http://enterotypes.org/
你只要提交一個屬水平的OTU表文件，格式如下：
GENUS MH0277 MH0087 MH0156Bacteroides 0.005 0.732 0.501Prevotella 5.359-06 0 0Eubacterium 6.148-05 0 0.046...即可獲得基于參考數(shù)據(jù)腸型分類的結(jié)果匯總?cè)缦拢?/p>
同時下載可以下載每個樣品的分類詳細(xì)結(jié)果，示例如下：
ET Within_ET_space MH0277 ET_F FALSE MH0087 ET_B TRUE MH0156 ET_B TRUE MH0444 ET_B TRUENature子刊：利用“腸型”對腸道菌群進(jìn)行分類
原標(biāo)題：腸道菌群群落組成中的腸型
① 2011年，MetaHIT團(tuán)隊提出“腸型”概念，將腸道菌群分為B、P和F三類；② 這有潛在研究和臨床價值，但爭議不小，不同人根據(jù)不同試驗、算法和分析方法，認(rèn)為菌群應(yīng)分為2種、4種腸型甚至是連續(xù)不可分型；③ 為統(tǒng)一認(rèn)識和指導(dǎo)實踐，29位世界主流菌群科學(xué)家聯(lián)合提出新的腸型分類器及公開比對數(shù)據(jù)庫；④ 新方案充分利用和驗證HMP等數(shù)據(jù)庫，綜合考慮菌群功能、生態(tài)學(xué)及臨床需求，能更好指示出疾病和健康狀態(tài)的菌群類型；⑤ 共識仍存局限，但意義重大。
Costea, P. I., et al. (2018). “Enterotypes in the landscape of gut microbial community composition.” Nat Microbiol 3(1): 8-16.
Nature子刊：利用“腸型”對腸道菌群進(jìn)行分類 http://www.xunludkp.com/papers/read/1067264900?kf=bayi
注：譯文中原始文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)、結(jié)果等均指提出腸型概念的原始文獻(xiàn)：Arumugam, R. et al. (2011). Enterotypes of the human gut microbiome. Nature, 473: 174–180.
陳亮，博士。2010年畢業(yè)于魯東大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)，2017年于中國科學(xué)院微生物研究所獲微生物學(xué)博士學(xué)位。目前就職于中國科學(xué)院微生物研究所病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，生物信息和計算生物學(xué)研究組，任助理研究員，目前主要研究內(nèi)容為微生物生態(tài)學(xué)、宏基因組學(xué)等方面的數(shù)據(jù)挖掘和分析。
劉永鑫，博士。2008年和2011年畢業(yè)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)和作物遺傳育種專業(yè)。2014年在中科院遺傳發(fā)育所獲生物信息學(xué)博士學(xué)位，2016年博士后出站留所工作，任宏基因組學(xué)實驗室工程師，目前主要研究方向為宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法、培養(yǎng)組學(xué)方法優(yōu)化。2017年7月創(chuàng)辦“宏基因組”公眾號，半年關(guān)注人數(shù)過萬，累計閱讀超百萬。
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