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Yongqiang Chen, Meghan B. Azad, Spencer B. Gibson:Methods for detecting autophagy and determining autophagy-induced cell death;Can. J. Physiol. Pharmacol. 88(3): 285–295 (2010)

檢測細(xì)胞自噬和確定其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法

HUABIN 初譯稿

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Abstract:

Autophagy is an intracellular lysosomal degradation process, which in the case of macroautophagy, is characterized by the formation of double-membraned autophagosomes.

Enhanced under stress conditions, autophagy can function to promote cell survival or cell death depending on the type of cellular stress.

摘要：

細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解之過程，在“巨自噬（macroautophagy）”情況下，它具有能形成雙層膜自噬體之特點(diǎn)。

在增加刺激條件下，細(xì)胞自噬可依據(jù)細(xì)胞刺激類型不同，或促進(jìn)細(xì)胞存活或?qū)е录?xì)胞死亡。

Interest in autophagy has increased substantially in the past several years as new research implicates this “self-eating” pathway in cell growth, development, and many human diseases.

Various methods have been developed for detecting autophagy; however, the implementation of these methods and the interpretation of the results often vary between studies, and a more standardized approach is required.

在過去數(shù)年中，人們已大幅度地增加了對(duì)“細(xì)胞自噬”領(lǐng)域之新的研究，其暗示在細(xì)胞生長發(fā)育和許多人類疾病中，存在這種“自食”通道。

為了檢測細(xì)胞自噬，人們已開發(fā)出各種方法；然而，這些方法的實(shí)施及其結(jié)果的解釋，往往在各個(gè)研究之間存在很大的差異，因此必須有一個(gè)更加規(guī)范的做法。

In this review, we summarize the current methods available for detecting autophagy and for determining its contribution to cell death.

Furthermore, we discuss the critical points for the successful application of these methods based on experiences from our laboratory and from other research groups.

在這篇綜述中，我們總結(jié)了能用于檢測細(xì)胞自噬的各種現(xiàn)代方法，以便確定細(xì)胞自噬對(duì)于細(xì)胞死亡的作用。

此外，基于我們的實(shí)驗(yàn)室和其他研究小組之經(jīng)驗(yàn)，我們討論了成功應(yīng)用這些方法之一些關(guān)鍵問題。

Key words: autophagy, autophagic cell death, apoptosis, necrosis, mitotic cell death, cell death

關(guān)鍵詞:自噬，細(xì)胞自噬死亡，細(xì)胞凋亡，壞死，有絲分裂細(xì)胞死亡，細(xì)胞死亡

HUABIN 于2010.8.27 子夜 (初譯稿)

為幫助對(duì)該領(lǐng)域研究不熟悉者,搞清楚"細(xì)胞死亡通道"全部范疇內(nèi)容!現(xiàn)從有關(guān)"細(xì)胞凋亡"基本概念開始介紹:

一.細(xì)胞凋亡"apoptosis"定義

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細(xì)胞凋亡"apoptosis" 也稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD).

定義1：指由于細(xì)胞內(nèi)部程序激活而發(fā)生的自殺性死亡，是增殖的淋巴細(xì)胞被清除的主要方式;

定義2：生物體內(nèi)細(xì)胞在特定的內(nèi)源和外源信號(hào)誘導(dǎo)下，其死亡途徑被激活，并在有關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過程。是程序性死亡過程的一種主要形式，強(qiáng)調(diào)的是形態(tài)學(xué)上的改變。它涉及染色質(zhì)凝聚和外周化、細(xì)胞質(zhì)減少、核片段化、細(xì)胞質(zhì)致密化、與周圍細(xì)胞聯(lián)系中斷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞膜融合，最終細(xì)胞片段化形成許多細(xì)胞凋亡體，被其他細(xì)胞吞入。

定義3：由死亡信號(hào)誘發(fā)的受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡過程, 是細(xì)胞生理性死亡的普遍形式。凋亡過程中DNA發(fā)生片段化，細(xì)胞皺縮分解成凋亡小體，被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬，不發(fā)生炎癥。

定義4：由生理或病理信號(hào)引發(fā)的自主性的細(xì)胞清除過程。

三.細(xì)胞凋亡的概念解釋

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1．細(xì)胞凋亡與細(xì)胞程序性死亡（PCD）
　　
其實(shí)從嚴(yán)格的詞學(xué)意義上來說，細(xì)胞程序性死亡與細(xì)胞凋亡是有很大區(qū)別的。

細(xì)胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是個(gè)功能性概念，描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。例如蝌蚪變成青蛙，其變態(tài)過程中尾部的消失伴隨大量細(xì)胞死亡，高等哺乳類動(dòng)物指間蹼的消失、顎融合、視網(wǎng)膜發(fā)育以及免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育都必須有細(xì)胞死亡的參與。這些形形色色的在機(jī)體發(fā)育過程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡有一個(gè)共同特征:即散在的、逐個(gè)地從正常組織中死亡和消失,機(jī)體無炎癥反應(yīng)，而且對(duì)整個(gè)機(jī)體的發(fā)育是有利和必須的。因此認(rèn)為動(dòng)物發(fā)育過程中存在的細(xì)胞程序性死亡是一個(gè)發(fā)育學(xué)概念，

而細(xì)胞凋亡則是一個(gè)形態(tài)學(xué)的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學(xué)特征的與壞死完全不同的細(xì)胞死亡形式。

但是一般認(rèn)為凋亡和程序性死亡兩個(gè)概念可以交互使用，具有同等意義。

2．細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別：

雖然凋亡與壞死的最終結(jié)果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。 　　

壞死（necrosis）：

壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細(xì)胞 脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。 　　

凋亡:
是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。

五.細(xì)胞凋亡的過程及機(jī)理

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細(xì)胞凋亡的過程大致可分為以下幾個(gè)階段： 　　接受凋亡信號(hào)→凋亡調(diào)控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程

1．凋亡的啟動(dòng)階段

細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號(hào)刺激后胞內(nèi)一系列控制開關(guān)的開啟或關(guān)閉，不同的外界因素啟動(dòng)凋亡的方式不同，所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同，客觀上說對(duì)細(xì)胞凋亡過程中信號(hào)傳遞系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)還是不全面的，目前比較清楚的通路主要有： 　　

1）細(xì)胞凋亡的膜受體通路：

各種外界因素是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)劑，它們可以通過不同的信號(hào)傳遞系統(tǒng)傳遞凋亡信號(hào)，引起細(xì)胞凋亡，我們以Fas -FasL為例： 　　

Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，它與FasL結(jié)合可以啟動(dòng)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡。它的活化包括一系列步驟：首先配體誘導(dǎo)受體三聚體化，然后在細(xì)胞膜上形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物中包括帶有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白FADD。 Fas又稱CD95，是由325個(gè)氨基酸組成的受體分子，F(xiàn)as一旦和配體FasL結(jié)合，可通過Fas分子啟動(dòng)致死性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起細(xì)胞一系列特征性變化，使細(xì)胞死亡。Fas作為一種普遍表達(dá)的受體分子，可出現(xiàn)于多種細(xì)胞表面，但FasL的表達(dá)卻有其特點(diǎn)，通常只出現(xiàn)于活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞，因而已被活化的殺傷性免疫細(xì)胞，往往能夠最有效地以凋亡途徑置靶細(xì)胞于死地。 Fas分子胞內(nèi)段帶有特殊的死亡結(jié)構(gòu)域（DD, death domain）。三聚化的Fas和FasL結(jié)合后，使三個(gè)Fas分子的死亡結(jié)構(gòu)域相聚成簇，吸引了胞漿中另一種帶有相同死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白FADD。FADD是死亡信號(hào)轉(zhuǎn)錄中的一個(gè)連接蛋白，它由兩部分組成：C端（DD結(jié)構(gòu)域）和N端（DED）部分。DD結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)和Fas分子胞內(nèi)段上的DD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，該蛋白再以DED連接另一個(gè)帶有DED的后續(xù)成分，由此引起N段DED隨即與無活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原發(fā)生同嗜性交聯(lián)，聚合多個(gè)caspase8的分子，caspase8分子逐由單鏈酶原轉(zhuǎn)成有活性的雙鏈蛋白，進(jìn)而引起隨后的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即Caspases，后者作為酶原而被激活，引起下面的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。細(xì)胞發(fā)生凋亡。因而TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑與此類似 　　

2）細(xì)胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學(xué)途經(jīng) 　　

線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心。實(shí)驗(yàn)表明了細(xì)胞色素C從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。釋放到細(xì)胞漿的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1（Apaf-1）結(jié)合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，線粒體還釋放凋亡誘導(dǎo)因子，如AIF，參與激活caspase?？梢姡?xì)胞凋亡小體的相關(guān)組份存在于正常細(xì)胞的不同部位。促凋亡因子能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放和凋亡小體的形成。很顯然，細(xì)胞色素C從線粒體釋放的調(diào)節(jié)是細(xì)胞凋亡分子機(jī)理研究的關(guān)鍵問題。多數(shù)凋亡刺激因子通過線粒體激活細(xì)胞凋亡途經(jīng)。有人認(rèn)為受體介導(dǎo)的凋亡途經(jīng)也有細(xì)胞色素C從線粒體的釋放。如對(duì)Fas應(yīng)答的細(xì)胞中，一類細(xì)胞（type1）中含有足夠的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受體活化從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在這類細(xì)胞中高表達(dá)Bcl-2并不能抑制Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在另一類細(xì)胞（type2）如肝細(xì)胞中，F(xiàn)as受體介導(dǎo)的胱解酶8活化不能達(dá)到很高的水平。因此這類細(xì)胞中的凋亡信號(hào)需要借助凋亡的線粒體途經(jīng)來放大，而Bid -- 一種僅含有BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族蛋白是將凋亡信號(hào)從胱解酶8向線粒體傳遞的信使。

2．凋亡的執(zhí)行

盡管凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，但是已經(jīng)確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細(xì)胞凋亡的過程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過程，到目前為止，至少已有14種Caspase被發(fā)現(xiàn)，Caspase分子間的同源性很高，結(jié)構(gòu)相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根據(jù)功能可把Caspase基本分為二類：一類參與細(xì)胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二類參與細(xì)胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。

Caspase家族一般具有以下特征： 　　

1）C端同源區(qū)存在半胱氨酸激活位點(diǎn)，此激活位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域?yàn)镼ACR/QG。 　　

2）通常以酶原的形式存在，相對(duì)分子質(zhì)量29000-49000（29-49KD），在受到激活后其內(nèi)部保守的天冬氨酸殘基經(jīng)水解形成大（P20）?。≒10）兩個(gè)亞單位，并進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體，其中，每個(gè)P20/P10異二聚體可來源于同一前體分子也可來源于兩個(gè)不同的前體分子。 　　
3）末端具有一個(gè)小的或大的原結(jié)構(gòu)域。 　　

參與誘導(dǎo)凋亡的Caspase分成兩大類： 啟動(dòng)酶（inititaor）和效應(yīng)酶（effector）它們分別在死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游和下游發(fā)揮作用。

Caspase活化機(jī)制

Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，Caspase分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個(gè)二聚體形成有活性的四聚體。去除N-端前肽是Caspase的活化的第一步，也是必須的，但是Caspase-9的活化不需要去除N-端前肽，Caspase活化基本有兩種機(jī)制，即同源活化和異源活化，這兩種活化方式密切相關(guān)，一般來說后者是前者的結(jié)果，發(fā)生同源活化的Caspase又被稱為啟動(dòng)caspase（initiator caspase），包括caspase-8,-10,-9，誘導(dǎo)凋亡后，起始Caspase通過adaptor被募集到特定的起始活化復(fù)合體，形成同源二聚體構(gòu)像改變，導(dǎo)致同源分子之間的酶切而自身活化，通常caspase-8, 10, 2介導(dǎo)死亡受體通路的細(xì)胞凋亡，分別被募集到Fas和TNFR1死亡受體復(fù)合物，而Caspase-9參與線粒體通路的細(xì)胞凋亡，則被募集到Cyt c/d ATP/Apaf-1組成的凋亡體（apoptosome）。同源活化是細(xì)胞凋亡過程中最早發(fā)生的capases水解活化事件，啟動(dòng)Caspase活化后，即開啟細(xì)胞內(nèi)的死亡程序，通過異源活化方式水解下游Caspase將凋亡信號(hào)放大，同時(shí)將死亡信號(hào)向下傳遞。異源活化（hetero-activation）即由一種caspase活化另一種caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經(jīng)典途徑。被異源活化的Caspase又稱為執(zhí)行caspase(executioner caspase)，包括Caspase-3,-6,-7。執(zhí)行Caspase不象啟動(dòng)Caspase ，不能被募集到或結(jié)合起始活化復(fù)合體，它們必須依賴啟動(dòng)Caspase才能活化。

Caspase的效應(yīng)機(jī)制
　　
凋亡細(xì)胞的特征性表現(xiàn)，包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜活化，細(xì)胞皺縮，最后形成由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體，然后，這些凋亡小體被其他細(xì)胞所吞噬，這一過程大約經(jīng)歷30-60分鐘，Caspase引起上述細(xì)胞凋亡相關(guān)變化的全過程尚不完全清楚，但至少包括以下三種機(jī)制：

1．凋亡抑制物

正常活細(xì)胞因?yàn)楹怂崦柑幱跓o活性狀態(tài)，而不出現(xiàn)DNA斷裂，這是由于核酸酶和抑制物結(jié)合在一起，如果抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DN***段化（fragmentation）?，F(xiàn)知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物稱為ICAD。因而，在正常情況下，細(xì)胞凋亡CAD不顯示活性是因?yàn)镃AD-ICAD，以一種無活性的復(fù)合物形式存在。ICAD一旦被Caspase水解，即賦予CAD以核酸酶活性，DN***段化即產(chǎn)生，有意義的是CAD只在ICAD存在時(shí)才能合成并顯示活性，提示CAD-ICAD以一種其轉(zhuǎn)錄方式存在，因而ICAD對(duì)CAD的活化與抑制卻是必需要的。

2．破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)
Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如裂解核纖層，核纖層（Lamina）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)（chromatin）得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個(gè)近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。

3．調(diào)節(jié)蛋白喪失功能
Caspase可作用于幾種與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的酶或蛋白，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)。其中包括凝膠原蛋白（gelsin）、聚合粘附激酶（focal adhesion kinase ,FAK）、P21活化激酶α（PAKα）等。這些蛋白的裂解導(dǎo)致其活性下降。如Caspase可裂解凝膠原蛋白而產(chǎn)生片段，使之不能通過肌動(dòng)蛋白（actin）纖維來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架。 　　除此之外，Caspase還能滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細(xì)胞的增殖與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡。 　　

所有這些都表明Caspase以一種有條不紊的方式進(jìn)行"破壞"，它們切斷細(xì)胞與周圍的聯(lián)系，拆散細(xì)胞骨架，阻斷細(xì)胞DNA復(fù)制和修復(fù)，干擾mRNA剪切，損傷DNA與核結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)可被其他的細(xì)胞吞噬的信號(hào)，并進(jìn)一步使之降解為凋亡小體。

細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)

細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控，在正常細(xì)胞Caspase處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，Caspase被活經(jīng)隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生不可逆的凋亡。細(xì)胞是如何準(zhǔn)確而又精確調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡呢？舉例如下：

1．凋亡抑制分子：

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制分子，包括P35，CrmA,IAPs，F(xiàn)LIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。 　　

1）P35和CrmA是廣譜凋亡抑制劑，體外研究結(jié)果表明P35以競爭性結(jié)合方式與靶分子形成穩(wěn)定的具有空間位阻效應(yīng)的復(fù)合體并且抑制Caspases活性，同時(shí)P35在位點(diǎn)DMQD！G被靶Caspases特異切割，切割后的P35與caspase的結(jié)合更強(qiáng)，CrmA（Cytokine response modfer A）是血清蛋白酶抑制劑，能夠直接抑制多種蛋白酶的活性，但目前還未發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)P35和CrmA的同源分子。 　　

2）FLIPs(FLICE-imhibirory proterins)能抑制Fas/TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。它有多種變異體，但其N-端功能前區(qū)（Prodomain）完全相同，C端長短不一。FLIPs通過DED功能區(qū)，與FADD和Caspase-8，10結(jié)合，拮抗它們之間的相互作用，從而抑制Caspase8，10募集到死亡受體復(fù)合體和它們的起始化。 　　

3）凋亡抑制蛋白（IAPs,inhibitors of Apoptosis protien）為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質(zhì)，首先是從桿狀病毒基因組克隆到，發(fā)現(xiàn)能夠抑制由病毒感染引起的宿主細(xì)胞死亡應(yīng)答。其特性是有大約20氨基酸組成的功能區(qū)，這對(duì)IAPs抑制凋亡是必需要的，它們主要抑制Caspase3,-7，而不結(jié)合它的酶原，對(duì)Caspase則即可以結(jié)合活化的，又可結(jié)合酶原，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。

2．Bcl-2家族：

這一家族有眾多成員，如Mcl-1、NR-B、A1 、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等，它們分別既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。多數(shù)成員間有兩個(gè)結(jié)構(gòu)同源區(qū)域，在介導(dǎo)成員之間的二聚體化過程中起重要作用。Bcl-2成員之間的二聚體化是成員之間功能實(shí)現(xiàn)或功能調(diào)節(jié)的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命，在一些白血病中Bcl-2呈過度表達(dá)。 　　
Bcl-2的亞細(xì)胞定位已經(jīng)明確，它在不同的細(xì)胞類型可以定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核膜上，并通過阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。此外， Bcl-2具有保護(hù)細(xì)胞的功能， Bcl-2的過度表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱苷肽（GSH）的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中參與細(xì)胞凋亡的一個(gè)成員，當(dāng)誘導(dǎo)凋亡時(shí)，它從胞液遷移到線粒體和核膜。有人研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞毒性藥物誘發(fā)凋亡時(shí)，核膜Bax水平的上升與lamin及PARP兩種核蛋白的降解呈正相關(guān)。用Bax寡核苷酸處理的細(xì)胞，只能特異地阻斷Lamin的降解，對(duì)PARP的降解不起作用。這種效應(yīng)的調(diào)控機(jī)制目前仍然不清楚。 　　

總之，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的，參與的分子也非常多，還有很多不為我們所知的機(jī)理需要我們一步的探索。

七.細(xì)胞凋亡的檢測

1． 早期檢測:
　　
1） PS（磷脂酰絲氨酸）在細(xì)胞外膜上的檢測:

細(xì)胞凋亡PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生, 可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志。AnnexinV，一個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測（懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結(jié)合來標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。 　　

美國著名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發(fā)了多種標(biāo)記的Annexin V產(chǎn)品，簡便快速，10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標(biāo)記的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）及Annexin V-FITC，靈敏度高，可作為FACS（流式細(xì)胞分選）方法篩選凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ)。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的結(jié)合比例為1：1，還可進(jìn)行定量檢測。除此之外，還提供生物素偶聯(lián)的Annexin V，可通過常用的酶聯(lián)顯色反應(yīng)來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細(xì)胞。 　　

2）細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測： 　　

這反應(yīng)了細(xì)胞凋亡研究中相對(duì)較新的趨勢，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過熒光染料monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。正常狀態(tài)下,谷光苷肽（glutathione：GSH）作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細(xì)胞中，細(xì)胞膜中有可被凋亡信號(hào)啟動(dòng)的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非?；钴S時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 　　由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān)，此項(xiàng)檢測除了對(duì)研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如：HeLa 和3T3細(xì)胞凋亡時(shí)沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。 　　

3）細(xì)胞色素C的定位檢測 　　

細(xì)胞色素C作為一種信號(hào)物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液，結(jié)合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時(shí)，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志。 　　ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細(xì)胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進(jìn)一步通過Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。 　　

4） 線粒體膜電位變化的檢測： 　　

在凋亡研究的早期，從形態(tài)學(xué)觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個(gè)陽離子性的染色劑，對(duì)此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號(hào)。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化。

2． 晚期檢測：
　　
細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 的DN***段。對(duì)于這一現(xiàn)象的檢測通常有以下兩種方法： 　　

1） TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling） 　　
通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP （多為dUTP）間接（通過地高辛）或直接接到DN***段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果。美國Intergen公司提供多種標(biāo)記方法，直接熒光標(biāo)記，地高辛介導(dǎo)熒光標(biāo)記或過氧化物酶聯(lián)顯色，可做細(xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。其中，直接標(biāo)記步驟少，操作簡便。而間接標(biāo)記有信號(hào)放大的作用，檢測靈敏度高。 　　

2） LM-PCR Ladder （連接介導(dǎo)的PCR檢測） 　　

當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時(shí)，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR（ligation-mediated PCR）,連上特異性接頭，專一性地?cái)U(kuò)增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時(shí)產(chǎn)生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。 　　上述兩種方法都針對(duì)細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷（如機(jī)械損傷，紫外線等）也會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測會(huì)受到其它原因的干擾。 　　
3） Telemerase Detection （端粒酶檢測） 　　

這是相對(duì)來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會(huì)縮短，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對(duì)的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個(gè)數(shù)的6堿基（GGTTAG）端粒重復(fù)序列，通過PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳檢測就可觀察到相差六個(gè)堿基的DNA Ladder現(xiàn)象（參見圖4）。此外，Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測的試劑盒. 　　同樣，這種檢測方法也不專對(duì)細(xì)胞凋亡，檢測結(jié)果也不純反應(yīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

3．mRNA水平的檢測
　　
研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)異常的基因，檢測這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測細(xì)胞凋亡的一種常用方法。

據(jù)報(bào)道，F(xiàn)as 蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cells）等靶細(xì)胞。Bcl-2 和bcl-X （長的） 作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對(duì)它們進(jìn)行檢測。

隨著近年來熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，用定量PCR技術(shù)來檢測基因表達(dá)水平無疑比之前者更快更準(zhǔn)確。Intergen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根據(jù)這一新技術(shù)原理，通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X （長的） 基因的 mRNA表達(dá)水平來進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。

在該研究領(lǐng)域,涌現(xiàn)出不少容易混淆之概念!例如:

一.程序性細(xì)胞死亡(PCD)包括細(xì)胞凋亡（apoptosis）、自噬性細(xì)胞死亡（autophagic cell death）、類凋亡（paraptosis）、有絲分裂災(zāi)難（mitotic catastrophe）、脹亡（oncosis）、凋亡樣程序性細(xì)胞死亡（model of apoptosis-like）和壞死樣程序性細(xì)胞死亡（model of necrosis-like）等。

二.有人將"細(xì)胞凋亡"等同于"程序性細(xì)胞死亡";但更多的人認(rèn)為:"程序性細(xì)胞死亡"包括:細(xì)胞凋亡(I型PCD)與細(xì)胞自噬(II型PCD)!

目前對(duì)"細(xì)胞凋亡",細(xì)胞自噬與細(xì)胞壞死三者,病理學(xué)界已經(jīng)有了一些鑒別診斷之方法!

見下鏈接內(nèi)容:http://news.dxy.cn/bbs/topic/18124558?tpg=1&age=0

三.細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬之概念區(qū)別:

1.細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的主動(dòng)過程，典型的細(xì)胞凋亡過程涉及一系列胱天蛋白酶（caspase）的水解、活化和信號(hào)傳遞過程。[/color]細(xì)胞凋亡一詞最早是由英國科爾等于1972年提出的。90年代才證明,細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的主動(dòng)過程!

2.60年代即已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬"現(xiàn)象，它是指細(xì)胞內(nèi)的溶酶體降解自身細(xì)胞器和其他大分子的過程。當(dāng)細(xì)胞在缺乏營養(yǎng)或發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，可發(fā)生細(xì)胞自噬現(xiàn)象。

D.QU

2010.8.27

下面是一篇2005年法國學(xué)者發(fā)表的"細(xì)胞凋亡/自噬悖論"文章!

González-Polo RA, Boya P, Pauleau AL,ET AL:The apoptosis/autophagy paradox: autophagic vacuolization before apoptotic death.J Cell Sci. 2005 Jul 15;118(Pt 14):3091-102. Epub 2005 Jun 28.

Abstract
Autophagic cell death is morphologically characterized by an accumulation of autophagic vacuoles. Here, we show that inactivation of LAMP2 by RNA interference or by homologous recombination leads to autophagic vacuolization in nutrient-depleted cells. Cells that lack LAMP2 expression showed an enhanced accumulation of vacuoles carrying the marker LC3, yet a decreased colocalization of LC3 and lysosomes, suggesting that the fusion between autophagic vacuoles and lysosomes was inhibited. While a fraction of mitochondria from starved LAMP2-expressing cells colocalized with lysosomal markers, within autophagolysosomes, no such colocalization was found on removal of LAMP2 from the experimental system. Of note, LAMP1 depletion had no such effects and did not aggravate the phenotype induced by LAMP2-specific small interfering RNA. Serum and amino acid-starved LAMP2-negative cells exhibited an accumulation of autophagic vacuoles and then succumbed to cell death with hallmarks of apoptosis such as loss of the mitochondrial transmembrane potential, caspase activation and chromatin condensation. While caspase inhibition retarded cell death, it had no protective effect on mitochondria. Stabilization of mitochondria by overexpression of Bcl-2 or the mitochondrion-targeted cytomegalovirus protein vMIA, however, blocked all signs of apoptosis. Neither caspase inhibition nor mitochondrial stabilization antagonized autophagic vacuolization in LAMP2-deficient cells. Altogether, these data indicate that accumulation of autophagic vacuoles can precede apoptotic cell death. These findings argue against the clear-cut distinction between type 1 (apoptotic) and type 2 (autophagic) cell death.