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1、采樣點(diǎn)：不一致的采樣點(diǎn)可能會(huì)引起微生物群落變化，比如：胃腸道、呼吸道的不同部位，不同的土壤深度等。

2、采集方法：不同樣本采集方法、非侵入性／較少侵入性的方法能否替代侵入性采集方法說(shuō)法不一。例如，研究顯示，人腸道拭子和活檢標(biāo)本、呼出氣冷凝液和肺刷、經(jīng)口留置胃管和瘺管采樣菌群差異顯著；牛瘤胃的一項(xiàng)研究則顯示，不同的采樣方法差別不大；另外，鼻拭子和活檢樣本、直腸拭子和糞便樣本菌群組成又差異不大了。缺乏共識(shí)和標(biāo)準(zhǔn)化的情況下，采集方法的一致性和預(yù)實(shí)驗(yàn)就十分重要了。

3、均勻度：重要的事說(shuō)三遍，混勻！混勻！混勻！尤其在腸道、土壤等高復(fù)雜或大尺度采樣時(shí)。

Note：參考已有／文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)時(shí)，首先看采樣方法是否一致，盡量避免來(lái)自不同采樣方法的數(shù)據(jù)的比較。同一項(xiàng)目的待比數(shù)據(jù)盡量保證采集條件、標(biāo)準(zhǔn)和方法的一致性。

新鮮樣本、直接提取時(shí)最好的選擇，如果不能，最權(quán)威的做法無(wú)疑是快速冷凍到-80度。

新鮮VS冷凍樣本：

兩項(xiàng)研究表明，冷凍樣本中F/B明顯升高。Fouhy et al的研究顯示，冷凍的影響只到屬，門(mén)、綱水平群落無(wú)甚差異。DNA提取前把糞便樣本冷藏個(gè)24h或72h，微生物組成和多樣性都不會(huì)造成太大差異。

Lauber等在不同溫度下儲(chǔ)存土壤、糞便和皮膚樣本，發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)菌群結(jié)構(gòu)和多樣性沒(méi)有顯著影響。－80 oC存儲(chǔ)2年，群落變化很小，僅 OTU數(shù)目減少，lactobacilli and bacilli豐度略有增加。

Note：最好新鮮樣本即時(shí)處理，如若不行，可以按不同保存時(shí)間等設(shè)置不同批次，處理方法、存儲(chǔ)時(shí)間和DNA提取批次的記錄很重要。

McKain等人探討了使用低溫保護(hù)劑(即甘油/磷酸鹽緩沖液)來(lái)存儲(chǔ)瘤胃樣品的效果，qPCR發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有使用冷凍保護(hù)劑的冷凍樣品存在擬桿菌的顯著損失。

Choo等人比較了使用幾種常用保護(hù)劑 (即RNAlater, OMNIgene.GUT 和Tris-EDTA)和-80oC直接干燥凍存的糞便樣品的菌群分布，發(fā)現(xiàn)OMNIgene.GUT效果最好、差異最??；Tris-EDTA處理組發(fā)現(xiàn)一些重要的細(xì)菌類(lèi)型如Escherichia-Shigella,Citrobacter 和 Enterobacter發(fā)生了顯著改變；效果最差的是RNAlater，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化。

Note：選用保護(hù)劑保存樣本時(shí)，十分重要的是，所有樣本的處理一致（選用同一種保護(hù)劑）。

可能影響提取和下游PCR實(shí)驗(yàn)的原因包括：

1、某些難于裂解的微生物細(xì)胞，包括細(xì)菌內(nèi)生孢子和革蘭氏陽(yáng)性菌等，影響提取效率。

2、抑制劑（來(lái)自環(huán)境、土壤、糞便中的殘骸、有機(jī)物等）可影響下游PCR效率，常見(jiàn)的抑制劑主要是有機(jī)質(zhì)（如腐植酸、膽汁酸鹽和多糖等）和一些無(wú)機(jī)質(zhì)（如鈣離子）。

提取方法上，手提最經(jīng)典的方法就是酚-氯仿提取法。此外，適用于各種樣本類(lèi)型的商用試劑盒也非常豐富，這里不多介紹。值得注意的是，很多文獻(xiàn)都顯示，不同的提取方法可能引發(fā)微生物群落的劇烈變化。

Note：所有樣本的提取盡量采用一致的方法，在保證特定物種成功提取的情況下盡可能的提高產(chǎn)量和質(zhì)量。得率的優(yōu)化可以從核心步驟bead beating開(kāi)始，建議預(yù)先優(yōu)化整體protocol。

1、區(qū)域和引物選擇：基于主流測(cè)序平臺(tái)，目前常見(jiàn)的16S rRNA測(cè)序區(qū)域選擇以V4（適用于2 X 250測(cè)序）和V34（適用于2X 300測(cè)序）等為主，然而事實(shí)上，沒(méi)有哪種引物是真正通用的，多項(xiàng)不同區(qū)域的比較研究給出了各種各樣的結(jié)論。值得注意的是，針對(duì)特定關(guān)注的微生物類(lèi)型，也可以選擇一些特定的區(qū)域擴(kuò)增。不同引物可能導(dǎo)致相對(duì)豐度和物種豐富度的改變，進(jìn)而改變微生物群落結(jié)構(gòu)。

2、PCR循環(huán)數(shù)：降低PCR循環(huán)數(shù)可以減少嵌合體的產(chǎn)生。

3、高保真聚合酶：不同的聚合酶對(duì)特定細(xì)菌群和整體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。

4、起始DNA量：PCR反應(yīng)的起始DNA總量也可能影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

Note：16S測(cè)序中并沒(méi)有真正的“金標(biāo)準(zhǔn)”，重要的是選擇盡量適合的引物，考慮到PCR試劑和PCR條件的優(yōu)化，并在研究中保持一致。

454：事實(shí)上在很長(zhǎng)一段時(shí)間里，Roche454是文獻(xiàn)和微生物組計(jì)劃們（如HMP）最常見(jiàn)的選擇平臺(tái)，雖然有同聚物的錯(cuò)誤，但是速度讀長(zhǎng)OK，一度獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷。然而通量小、成本高，逐漸退出競(jìng)爭(zhēng)鏈。

illumina：目前最主流的選擇，其中又以MiSeq平臺(tái)更為適用。16S metabarcoding的特點(diǎn)決定了其對(duì)讀長(zhǎng)的要求，是以目前市場(chǎng)上主要服務(wù)的機(jī)型并不是大熱的HiSeq X或NovaSeq，而是相對(duì)面世更早、讀長(zhǎng)更長(zhǎng)的MiSeq(2 X 300)和HiSeq 2500 (2 X 250)。

Pacbio：Pacbio和下面的Nanopore為微生物組研究帶來(lái)的希望是，無(wú)需頭疼選擇好的擴(kuò)增區(qū)域了，超長(zhǎng)讀長(zhǎng)使常規(guī)16SV1-V9區(qū)可以全測(cè)通，其他功能微生物的可擴(kuò)增和鑒定范圍也進(jìn)一步拓展。Pacbio目前的配套建庫(kù)、生信分析工具日趨成熟，陸續(xù)有文章證實(shí)技術(shù)的可靠性。然成本過(guò)高，在某些程度上限制了應(yīng)用范圍，目前已在逐漸降低成本。

Nanopore：號(hào)稱(chēng)使長(zhǎng)至天際的測(cè)序儀，讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)也很明朗。但是錯(cuò)誤率偏高，新技術(shù)文章積累不足，實(shí)驗(yàn)、測(cè)序到信息分析的普及程度仍需發(fā)展。

計(jì)劃開(kāi)展16S測(cè)序（注意只是測(cè)序）時(shí)，需要考慮4個(gè)關(guān)鍵因素：

1、數(shù)據(jù)質(zhì)量

2、測(cè)序成本

3、測(cè)序讀長(zhǎng)

4、每個(gè)run可以測(cè)序的樣本數(shù)量

Note:應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)、錯(cuò)誤率、測(cè)序覆蓋率和樣本數(shù)量的關(guān)系等選擇合適的測(cè)序平臺(tái)。例如，主要研究群落中的核心物種，那么就可以通過(guò)增加樣本數(shù)量來(lái)降低一個(gè)run中每個(gè)樣本的覆蓋率進(jìn)而降低成本，如果稀有物種則反之。

1、Mock Communities：已知比例的預(yù)混合細(xì)菌群落是一個(gè)很好的量化誤差的方法。模擬群落可以從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)（ATCC）或Zymo Research獲得。

2、Spike-in standards：在每個(gè)樣本中添加標(biāo)準(zhǔn)物，以在單樣本基礎(chǔ)上進(jìn)行質(zhì)量控制。為防止與樣本序列存在交叉，此處要選擇不太可能出現(xiàn)在感興趣樣本中的細(xì)菌，或者in silico設(shè)計(jì)的和數(shù)據(jù)庫(kù)中有差異的序列。

Note：推薦！

流程和分解步驟的分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，在之前的文章中做過(guò)詳細(xì)解釋和點(diǎn)評(píng),????9個(gè)模塊＋40余款軟件＋老司機(jī)辣評(píng) | 16S信息分析流程軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)合集。

這里補(bǔ)充一項(xiàng)，基因拷貝數(shù)校正：

不同的細(xì)菌類(lèi)型16S rRNA基因拷貝數(shù)有所不同，想要準(zhǔn)確獲知真實(shí)的拷貝數(shù)信息比較難。

但是，目前已經(jīng)有一些工具，可以利用序列數(shù)據(jù)庫(kù)和系統(tǒng)遺傳信息來(lái)校正拷貝數(shù)變化。其中包括Copyrighter、rrNDB、picanteR包和pplace中的函數(shù)，以及功能預(yù)測(cè)工具PICRUSt也包含有拷貝數(shù)校正的功能。

然而，既然是基于數(shù)據(jù)庫(kù)，那么，考慮到數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息數(shù)量，仍然是不夠全面的。

DNA提取試劑盒、PCR試劑和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中產(chǎn)生的微生物DNA污染在研究低微生物量樣品時(shí)可能會(huì)造成非常嚴(yán)重的影響。

1、陰性對(duì)照（或僅僅只有試劑）可以比較好的發(fā)現(xiàn)問(wèn)題。

2、處理之前的隨機(jī)抽樣可能有助于減少此類(lèi)問(wèn)題發(fā)生。

具體的解決污染的方法：

1、去除PCR試劑背景污染物的擴(kuò)增：Primer-extension PCR(對(duì)其他來(lái)源污染沒(méi)有影響)

2、去除試劑和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的DNA污染：紫外線(xiàn)和γ輻射、酶處理、硅基膜過(guò)濾、CsCl2密度梯度離心法、漂白劑/CoPA溶液處理等。

Note：想要開(kāi)展靠譜的16S研究，建議包含reagent-only controls（例如，DNA提取試劑盒和PCR控制）。

1、Mock Communities：已知比例的預(yù)混合細(xì)菌群落是一個(gè)很好的量化誤差的方法。模擬群落可以從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)（ATCC）或Zymo Research獲得。

2、Spike-in standards：在每個(gè)樣本中添加標(biāo)準(zhǔn)物，以在單樣本基礎(chǔ)上進(jìn)行質(zhì)量控制。為防止與樣本序列存在交叉，此處要選擇不太可能出現(xiàn)在感興趣樣本中的細(xì)菌，或者in silico設(shè)計(jì)的和數(shù)據(jù)庫(kù)中有差異的序列。

Note：推薦！